Leishmaniosi canina

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virbacnews http://it.virbac.com Speciale leishmaniosi - novembre 2017 N° 7 Leishmaniosi canina tra vecchie e nuove concezioni VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 1

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2 Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Editoriale Leishmaniosi canina: vecchie e nuove concezioni.Approfondimenti e casi clinici . 3 Angelo Giorgetti Malattie parassitarie Nuove acquisizioni su serbatoi e “vie” di trasmissione della leishmaniosi canina (LCan . 4 Ezio Ferroglio LCan fra forme tipiche e atipiche e l’impatto della profilassi vaccinale . 8 Gaetano Oliva Utilizzo e interpretazione dei test sierologici nell’era vaccinale . 11 Fabrizia Veronesi Quadri ematologici, biochimici e sierologici in cani donatori dopo la somministrazione di CaniLeish® . 15 Alessandra Gavazza Casi studio Caso studio n° 1: Red . 17 Manuela Diaferia Caso studio n° 2: Mei . 19 Chiara Brachelente Caso studio n° 3: Chace . 21 Giulia Morganti Sommario Pubblicazione a carattere non periodico della Società Virbac e pertanto non soggetta a registrazione ai sensi degli Artt. 2 e 16 Legge n. 47/1948. Tipografia A.S.P. Italia SpA Bergamo virbacnews Tutti i diritti di traduzione, adattamento e riproduzione sono riservati. Nessuna parte può essere riprodotta né divulgata in qualsiasi forma, con mezzi elettronici, meccanici, con fotocopie e registrazioni, senza il permesso scritto di Virbac Italia.

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Care Lettrici, Cari Lettori Il 26 febbraio 2017, a Perugia, nella splen- dida sala messa a disposizione dall’Uni- versità, si è tenuta una giornata di studio dal titolo:“Leishmaniosi canina tra vecchie e nuove concezioni”. I relatori sono stati il prof. Ezio Ferroglio e il prof. Gaetano Oliva, la dott.ssa Alessandra Gavazza e la dott.ssa FabriziaVeronesi,nonché le dottoresse Manuela Diaferia, Giulia Morganti e Chiara Brachelente che hanno portato in chiusura tre interessanti casi clinici. Il tutto introdotto da due interventi di pre- stigio tenuti dal prof. Luca Mechelli, diretto- re del Dipartimento di Medicina veterinaria di Perugia, e dalla prof.ssa Daniela Piergili Fioretti, ordinario di Malattie parassitarie nella stessa Università, che hanno dato con entusiasmo il benvenuto a tutti noi. I partecipanti sono stati numerosi e tutti fortemente interessati dalle relazioni e dai casi clinici, che hanno dato un ulteriore tocco di concretezza a una giornata volu- tamente orientata alla pratica clinica. Virbac, infine, ha avuto il privilegio di aiuta- re nell’organizzazione l’entusiasta gruppo di lavoro di Parassitologia e malattie paras- sitarie del Dipartimento di Medicina Veterinaria dell’Università di Perugia. In questi anni ho personalmente parteci- pato a numerosi seminari e convegni sul- l’argomento, sia a livello nazionale che in- ternazionale, a giornate di studio promosse da aziende farmaceutiche ma anche indi- pendenti ove la spinta organizzatrice era sostenuta da enti istituzionali quali le Università o le Società culturali e pur non ritenendomi un esperto, sinceramente, pensavo che nuovi stimoli fossero difficili da trovare. Invece ancora una volta la mae- stria degli specialisti e la complessità della materia hanno “inchiodato” la mia atten- zione per tutto il durare delle relazioni. Spero che anche voi lettori possiate vivere attraverso questo nostro numero diVirbac News l’interesse di noi partecipanti. Vorrei ringraziare in modo particolare tut- to lo staff di Virbac che non solo ha con- tribuito alla buona riuscita della giornata ma che ha assistito tutti noi dall’arrivo a Perugia fino alla chiusura lavori.

Gli autori, l’Università di Perugia, il marke- ting team di Virbac Italia, tutta Point Vétérinarie Italie e in particolare la figura della dr.ssa MonicaVajna De Pava, che con pazienza ci assiste in termini di coordina- mento, sono destinatari di un mio caloroso ringraziamento. Infine, come sempre, un grazie a voi lettori. Buona lettura. 3 ■ Leishmaniosi canina:vecchie e nuove concezioni Approfondimenti e casi clinici Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Angelo Giorgetti, DVM Marketing manager Virbac Italia Editoriale VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 3

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A l genere Leishmania sono ascritte diverse specie, presenti in diverse parti del mondo (soprattutto aree sub-tropicali e tropicali). Si stima che a livello mondiale la leishmaniosi sia la sesta più importante malattia per l’uomo e la terza tra le vector borne diseases. Le lei- shmaniosi umane, poiché diffuse soprattut- to nelle aree povere, sono ampiamente sottostimate e, nella parte europea del Bacino del Mediterraneo, è presente Leishmania infantum, che è l’agente della leishmaniosi viscerale zoonotica. Si tratta appunto di una zoonosi, per cui anche l’uo- mo può infettarsi tramite la puntura di fle- botomi portatori, con il cane come princi- pale serbatoio dell’infezione. Particolarità del ciclo Per quanto riguarda il ciclo di Leishmania è importante ricordare che, come in molte altre vector borne diseases da protozoi, il vettore è in realtà l’ospite “ottimale”, in quanto è qui che il parassita si trova nelle condizioni ottimali, mentre nell’ospite ver- tebrato si presenta in forme“di resistenza”. Esemplificando al massimo, possiamo im- maginare che il protozoo cerchi di soprav- vivere più a lungo possibile all’interno del vertebrato, in attesa che arrivi un nuovo flebotomo (cioè una nuova stagione di tra- smissione), e questo può spiegare perché molte vector borne diseases da protozoi dia- no, negli ospiti usuali, delle forme croniche. L’unico vero limite che il parassita incontra nella trasmissione vettoriale è la presenza stessa del vettore: i flebotomi sono stati sempre tradizionalmente considerati pa- rassiti “da aree calde”. Fino agli anni ‘70, ad esempio, non erano mai stati individuati flebotomi nel Nord Italia; oggi sappiamo che non è più così e infatti sono segnalati da circa 20 anni anche focolai autoctoni nell’Italia settentrionale, in particolare nelle aree collinari e pedemontane.

Flebotomi in Italia In Italia sono presenti 7 specie di fleboto- mo, di cui solo 4 certamente vettori di Leishmania, ciascuna con caratteristiche ed esigenze differenti, con una diversa presen- za nei vari ambienti, per cui varia anche il loro potenziale quale effettivi vettori di Leishmania.Ad esempio, P. perfiliewii, ampia- mente diffuso nel versante adriatico, è ben adattato all’ambiente domestico, per cui quasi nel 90% dei casi si rinviene entro 100 metri da stalle e altre attività umane, in cir- ca il 10% entro 150 m (zone peri-dome- stiche) e in meno dell’1% in ambiente sil- vestre. Al contrario, P. perniciosus è distri- buito pressoché equamente tra ambiente domestico, peri-domestico e silvestre. Considerando che i flebotomi han- no un range di azione molto ristret- to, usualmente poche centinaia di metri, appare ovvio il perché la LCan si manifesti tendenzialmente “a macchia di leopardo”. Generalmente i flebotomi non hanno una predilezione particolare per una specie animale, ma si alimentano soprattutto sulla specie più diffusa in quell’area (cani nei ca- nili, cavalli in una scuderia, ovini in una stalla, ecc...) qualora siano presenti contempora- neamente più ospiti effettuano invece il pa- sto su più specie, uomo compreso! Fattori climatici e ambientali Altro aspetto importante è la presenza di ambienti favorevoli allo sviluppo e alla so- pravvivenza larvale, in quanto è proprio sotto forma di larva di IV stadio che il fle- botomo passa l’inverno, per poi impuparsi a primavera, dando luogo ad una nuova ge- nerazione di adulti. Quindi il picco di concentrazione di flebotomi sarà ad inizio estate, quando sfarfallano gli adulti, mentre in aree in cui la tem- peratura autunnale non scende sot- to i 15 °C possiamo avere un secon- do picco autunnale. Quindi l’inizio della stagione di trasmissione è fondamental- mente simile in tutta Italia (tarda primave- ra-inizio estate); la differenza sta invece nel termine della stagione di trasmissione, le- gato a questo secondo picco (autunnale), assente nelle Regioni settentrionali, ma presente in Centro e Sud Italia. Pertanto, man mano che si scende lungo la Penisola, la stagione di trasmissione si allunga. Relativamente alla probabilità della singola puntura di trasmettere il parassita, certa- mente i flebotomi presenti all’inizio della stagione di trasmissione, poiché appena 4 ■ Nuove acquisizioni su serbatoi e“vie” di trasmissione della leishmaniosi canina (LCan) Il ruolo centrale della repellenza Il veterinario è l’unico in grado di dare informazioni corrette sulla LCan, poiché è il solo che conosce il ciclo e l’epidemiologia di Leishmania.

Animali da compagnia Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Prof. Ezio Ferroglio DVM, PhD Dipl. EVPC, Dipl. ECVPH Dipartimento di Scienze Veterinarie, Università degli Studi di Torino Malattie parassitarie VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 4

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schiusi, sono meno pericolosi rispetto a quelli presenti in piena estate o in autunno, che invece hanno già effettuato più pasti di sangue e quindi, potenzialmente, hanno an- che assunto Leishmania! Risultano dun- que più pericolosi i flebotomi pre- senti nella fase declinante della sta- gione di trasmissione: per tale mo- tivo è importante proteggere il ca- ne costantemente finché sono pre- senti i vettori (un errore che spesso compie il proprietario è quello di proteggere il cane con prodotti re- pellenti specifici solo in primavera e in estate, ma non in autunno). Importanti nella diffusione dei flebotomi sono anche le temperature invernali: infatti, più basse sono le temperature in inverno, minore sarà il numero di flebotomi nel- l’estate successiva, in quanto le forme lar- vali presenti nel terreno muoiono.

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Si parla sempre più spesso di cambia- menti climatici: Leishmania rappresenta uno dei pochissimi esempi tangibili degli effetti del cambiamento climatico sulla trasmissione di un agente patogeno. Ad esempio, nel Nord-Ovest d’Italia, che rap- presenta una delle zone in cui la LCan si è espansa maggiormente, negli ultimi anni c’è stato un aumento del 15% delle gior- nate invernali senza gelo. Altro segno del riscaldamento è la diminuzione, sempre in quest’area, delle giornate con nebbia; questa diminuzione dell’umidità e le tem- perature invernali più miti rappresentano condizioni favorevoli alla sopravvivenza delle larve di flebotomi nel terreno, giu- stificando l’aumento della LCan in tale area.

Particolarità dei serbatoi di LCan Per quanto concerne i serbatoi, oltre al ca- ne non bisogna sottovalutare l’importanza di altre specie animali. Prima fra tutte il gat- to: anche se la malattia clinicamente mani- festa in questo animale è molto rara, in re- altà nelle aree endemiche ci sono tantissimi soggetti PCR+; ad esempio, in uno studio condotto in Liguria, il 35% dei gatti esami- nati era PCR+ per Leishmania, cioè con il DNA del parassita in circolo. Si tratta mol- to spesso non di soggetti asintomatici ma “aclinici”, in quanto esami di laboratorio possono evidenziare alterazioni causate dal parassita, come ad esempio, l’anemia. In Italia settentrionale, così come in molte altre zone d’Europa, il serbatoio silvestre per eccellenza è rappresentato dalla volpe (in alcuni studi sono risultati positivi fino al 30% dei soggetti), mentre altri serbatoi noti sono, in generale, tutti i canidi selvatici. Un caso particolare relativamente ai ser- batoi è stato registrato in Spagna: in una ri- stretta zona a sud-ovest di Madrid alcuni anni fa è stato registrato un aumento signi- ficativo e inspiegabile di sieropositività nei confronti di Leishmania sia nei cani, con un aumento dei casi clinici, che nell’uomo (si sono avuti fino a 150/casi annui nell’uomo solo in quest’area!) (Galvez R. et al., 2010. Vet. Parasitol., 169: 327-334).

Nel 2012 i ricercatori sono riusciti a dimo- strare che la responsabile di questa emer- genza sanitaria era la lepre, ben adattata a vivere nelle aree periurbane di nuova co- struzione alla periferia di Madrid (Molina et al., 2012.Vet. Parasitol., 190: 268-271). In realtà non si tratta di una novità, in quanto ricerche effettuate in varie regioni europee mostrano alte prevalenze, fino al 30%, sia nella lepre che nelle minilepri e nei conigli. In realtà conigli e minilepri, che sono specie sedentarie, con spostamenti limitati, sono ancora più importanti nel mantenere il ci- clo del parassita, in quanto i flebotomi so- no ditteri che non riescono a compiere grandi spostamenti (in genere non com- piono più di 200 m dal punto di schiusa). Altro esempio è l’isola di Montecristo, do- ve non sono presenti né animali domestici né altri canidi: qui serbatoio di Leishmania è il ratto nero, nel quale si è registrata una positività mediante PCR del 15,5%.

Oggi la LCan è certamente più diffusa ri- spetto al passato; ciò è dovuto a diversi fat- tori, quali: - aumento del numero di cani (una volta presenti solo nelle campagne); - diversa distribuzione dei cani nel territo- rio: oggi nelle aree cosiddette “rurbane” (rurali-urbane) le abitazioni sono molto vi- cine fra loro, circondate da giardini ben cu- rati in cui convivono cani e flebotomi (an- che se il flebotomo si sposta al massimo di circa 200 metri, riesce comunque a rag- giungere un nuovo ospite, mentre in pas- sato spesso le case di campagna in cui vi- 6 Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Animali da compagnia Malattie parassitarie I flebotomi presenti nella fase declinante della stagione di trasmissione sono i più pericolosi, pertanto i cani vanno protetti finché sono presenti i vettori, anche in autunno.

© dezy - shutterstock.com VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 6

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vevano i cani erano distanti centinaia di metri una dall’altra!). Sono possibili interventi diretti sul vettore al fine di limitare la diffusione di LCan? Negli anni ‘60 abbiamo assistito a un dra- stico calo della LCan in quanto si utilizzava su larga scala il DDT e quindi il numero di flebotomi, e di altri ditteri vettori, era cala- to considerevolmente. Oggi è impossibile pensare a interventi di questo tipo, sia per motivi ambientali, ma anche dal punto di vista del rapporto costi/benefici, in quanto estremamente costosi in termini di impat- to ambientale e per i rischi di selezione di ceppi resistenti.

Dobbiamo perciò intervenire sull’ospite, evitando che il flebotomo punga il cane. Ma come fa il flebotomo a trovare il suo ospite? È attratto prima dall’odore (a lunga distanza); man mano che si avvicina è gui- dato dalla concentrazione di CO2 (a media distanza) e, quando è vicino (breve distan- za), per trovare il vaso sanguigno dove compiere il pasto di sangue è guidato dal calore e dall’umidità del corpo (cioè zone in cui la cute è più sottile e i vasi più su- perficiali).

I repellenti in senso stretto, come gli oli na- turali o le sostanze di sintesi normalmente impiegate nei repellenti ad uso umano, hanno un odore che maschera quello del cane; per fare ciò devono essere molto vo- latili, per cui hanno un’azione molto limitata nel tempo (da poche ore a massimo 24 ore) e dovrebbero essere somministrati quotidianamente. Attualmente utilizziamo essenzial- mente i piretroidi che non sono propriamente repellenti,ma sostan- ze anti-feeding, in quanto il fleboto- mo si avvicina all’animale, ma non compie il pasto di sangue. Si tratta di sostanze lipofile, che si legano alla frazione lipidica della cute e del pelo, e che perman- gono a lungo sulla cute del cane in quanto non suda e quindi non elimina i piretroidi attraverso il sudore: anzi, anche grazie al- l’adiuvante oleoso, vengono assorbiti in parte dalle ghiandole sebacee che li rila- sciano gradualmente, consentendo una lo- ro lunga efficacia, che può arrivare fino a 4 settimane. Inoltre sono resistenti all’acqua, conservando la loro efficacia anche quan- do il cane si bagna. Possono essere utilizzati in formule diverse: ad esempio, se devo proteggere il cane solo per pochi giorni posso tranquillamente usare la soluzione acquosa in spray; per un’azione duratura nel tempo devo invece scegliere le formu- lazioni spot-on o la banda protettiva (colla- re). Non bisogna dimenticare che i piretroidi, oltre all’azione anti-fee- ding,hanno anche un’azione biocida: se, infatti, un flebotomo riesce a compiere il pasto di sangue, assor- birà una quantità di piretroide suffi- ciente a ucciderlo nell’arco di alcu- ne ore. Queste molecole hanno dunque un effetto protettivo per il cane e letale per il flebotomo (knock down, cioè scoor- dinamento motorio, entro la prima ora e morte entro le 24 ore successive al pasto di sangue). Queste caratteristiche sono im- portanti per comprendere come sia indi- spensabile proteggere non solo i cani sani, ma soprattutto quelli malati: in questo mo- do, infatti, diminuisce il numero di fleboto- mi che fanno il pasto di sangue e quindi si infettano, e quelli che riescono comunque a pungere il cane e infettarsi con Leishmania nella stragrande maggioranza dei casi muoiono prima di trasmettere il parassita ad un altro ospite. Il ruolo dell’uomo e del veterinario In conclusione, possiamo affermare che Leishmania e flebotomi sono esempi perfet- ti di parassiti che si adattano all’ambiente: la loro distribuzione è influenzata sia dai cam- biamenti climatici che dalla disponibilità di ospiti recettivi. Ad esempio, attualmente la specie di flebotomo che più sta espanden- do il suo areale di distribuzione in Italia è P. perniciosus, in grado di collegare il ciclo sil- vestre di Leishmania con quello domestico. A questo proposito è centrale anche il ruolo svolto dall’uomo, in quanto in grado di intervenire direttamente sia sull’ambien- te che sull’ospite (spostamenti di animali, urbanizzazione delle aree peri-rurali, innal- zamento della temperatura, ecc , influen- zando la distribuzione dei patogeni. Per tutti questi motivi è necessario ribadire l’importanza del medico veterinario in campagne di sensibilizzazione e corsi di formazione; è inoltre di primaria importan- za fornire sempre informazioni adeguate ed esaustive ai proprietari dei cani. Ad esempio è bene sfatare la fobia del cane malato come pericolo per l’uomo: nelle zo- ne endemiche la prevalenza nell’uomo può arrivare al 40%, ma questo è indice solo di ampia circolazione del parassita (convivere con animali infetti non costituisce un fatto- re di rischio)!

È il veterinario l’unico professionista in gra- do di dare le informazioni corrette, poiché è il solo che conosce il ciclo e l’epidemio- logia di Leishmania. Per questi motivi è in- dispensabile la collaborazione fra ricerca- tori, liberi professionisti e operatori della Sanità pubblica, in quanto la LCan è una patologia complessa, che interessa tutti gli aspetti della medicina veterinaria a 360 gradi. Per ampliare la conoscenza sui parassiti de- gli animali da compagnia è possibile con- sultare il sito dell’Escaap (www.escaap.org), in cui si trovano anche le linee guida ag- giornate sul controllo delle malattie tra- smesse da vettori nel cane e nel gatto. 7 Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Animali da compagnia Malattie parassitarie VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 7

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Q uando ci troviamo in un’area en- demica dobbiamo pensare che la leishmaniosi canina (LCan) può avere diverse espressioni: - Cani sani, o meglio non infetti, cioè nei quali non riusciamo a dimostrare la pre- senza del parassita con i mezzi a nostra di- sposizione (sierologia, PCR, ecc . È im- probabile che tali soggetti non siano stati mai punti durante la stagione di trasmis- sione; probabilmente sono geneticamente resistenti (perchè selezionati in aree stori- camente endemiche). Si stima che circa il 10-15% dei cani rientrino in questa ca- tegoria.

- Cani infetti, cioè nei quali riusciamo a dimostrare la presenza del parassita solo mediante tecniche di biologia mole- colare (PCR); sono di solito sierologica- mente negativi, o esprimono bassi titoli anticorpali. Questi soggetti sono del tut- to asintomatici e potrebbero non mani- festare mai la forma clinica di LCan; ad- dirittura, come dimostrano studi longitu- dinali, possono tornare a negativizzarsi dopo alcuni mesi, in quanto il loro siste- ma immunitario riesce a contenere o a eliminare il parassita. Rientrano in questa categoria circa il 50-60% dei cani. In questo gruppo possiamo inserire, oltre al cane, tutti gli altri animali che possono essere punti da flebotomi infetti (equidi, ruminanti, volpi, ecc...) ma che non svi- luppano malattia.

- Cani asintomatici preclinici, cioè cli- nicamente sani (non presentano alcun se- gno di malattia alla visita clinica e il profilo urinario e quello emato-biochimico sono nella norma), però hanno iniziato a produr- re anticorpi e sono quindi positivi non solo alla PCR ma anche agli esami sierologici. Questi soggetti sono destinati, in tempi di- versi a seconda della risposta immunitaria individuale, ad evolvere in animali sintoma- tici, con titoli progressivamente crescenti di anticorpi. A questa categoria appartengo- no circa il 15-20% dei cani.

- Cani sintomatici. Rappresentano solo il 5-10% dei soggetti, che “emergono” dal gruppo degli asintomatici preclinici, co- me la punta di un iceberg. Si tratta quindi dei soggetti che arrivano poi a visita pres- so gli ambulatori veterinari. Più raramente è possibile che anche i gatti manifestino malattia. Nuove vie di trasmissione Per quanto concerne le vie di trasmis- sione, certamente quella principale è la via vettoriale, ma negli ultimi anni sono emerse nuove possibili modalità di trasmis- sione. Si tratta della via trasfusionale (mediante donatori di sangue), il cui ruolo nella trasmissione dell’infezione è ormai ac- certato, della via verticale (da madre a cucciolo) e di quella venerea (mediante 8 ■ LCan fra forme tipiche e atipiche e l’impatto della profilassi vaccinale Espressioni cliniche di LCan Le espressioni cliniche della LCan sono molteplici, poiché fortemente condizionate dalla risposta immunitaria del cane, diversa da soggetto a soggetto.

Animali da compagnia Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Prof. Gaetano Oliva Dipartimento di Scienze Cliniche Veterinarie Università di Napoli Federico II Malattie parassitarie VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 8

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l’accoppiamento), il cui significato epide- miologico è ancora da approfondire. Certamente la modalità di trasmissione più interessante è quella per via verticale: ad esempio, tutto il focolaio di LCan in Nord America, dove il flebotomo competente non è stato ancora identificato, sembra es- sere mantenuto da trasmissioni verticali; così come in alcune aree della Francia set- tentrionale, dove la LCan continua a diffon- dersi nonostante il flebotomo non sia fino ad oggi stato ancora identificato. Espressioni cliniche di LCan Le espressioni cliniche della LCan con le quali il medico veterinario si deve confron- tare sono molteplici, poiché fortemente condizionate dalla risposta immunitaria del cane, che è diversa da soggetto a soggetto. Infatti, i meccanismi patogenetici alla base dei segni clinici di LCan sono numerosi: danni organici da immunocomplessi, da granulomi, da auto-anticorpi, ecc. Ci possiamo quindi trovare di fronte a for- me tipiche o atipiche.

Le forme tipiche sono quelle più fre- quenti, vale a dire determinate da im- munocomplessi: bisogna infatti sottoli- neare il rapporto direttamente proporzio- nale tra numero di parassiti e concentra- zione di anticorpi, per cui all’aumentare del titolo anticorpale corrisponde quasi sem- pre una carica parassitaria tissutale elevata e, di conseguenza, peggiori condizioni clini- che nel cane leishmaniotico. Ancora oggi, quindi, il metodo diagnostico di elezione in corso di LCan è la sierologia quantitativa. Per quanto detto, in soggetti con titoli anticorpali molto alti sarà facile ritrovare il parassita anche mediante esame citologico di un puntato linfonodale, per- chè elevato sarà il numero di leishmanie nei vari tessuti target.

La diagnosi di LCan in soggetti sintomatici con forma tipica è quindi relativamente semplice, perchè, oltre alla sierologia, pos- siamo avvalerci di diversi metodi in grado di evidenziare direttamente il parassita in vari organi e tessuti (PCR e citologia/isto- logia). La forma tipica di LCan è caratterizzata da segni clinici che si manifestano molto fre- quentemente in corso di malattia, quali perdita di peso, inappetenza, linfoadeno- megalia, forfora, onicogrifosi, ulcere, uveite, ecc...A questo dobbiamo aggiungere le al- terazioni dei profili emato-biochimici ed urinari, quali anemia (che di solito in corso di LCan è normocitica e normocromica), proteinuria, inversione del rapporto albu- mine/globuline, ecc...

Le espressioni cliniche ritenute meno fre- quenti sono quelle che caratterizzano la LCan atipica; queste forme sono sem- pre di più descritte, forse anche perchè so- no aumentate le zone in cui la LCan è en- demica e quindi il medico veterinario è più conscio delle manifestazioni multiformi del- la malattia. Per questo motivo diventa oggi essenziale standardizzare le procedure diagnostiche e la stadiazione da attuare in corso di sospet- to di LCan, in modo da formulare un giudi- zio prognostico e terapeutico non basato esclusivamente sull’apparente gravità dei se- gni clinici, fino ad alcuni anni orsono basata su un giudizio puramente quantitativo (ani- mali“polisintomatici”). La prognosi, infatti, è condizionata dall’insieme del quadro clinico che tiene in dovuto conto i risultati di tutti gli esami collaterali, tra i quali quelli della funzione renale assumono particolare im- portanza. È utile ricordare, ad esempio, che un soggetto apparentemente sano o con minime manifestazioni cliniche potrebbe già presentare proteinuria, la cui gestione è di primaria importanza in corso di LCan. Per quanto riguarda le forme atipiche, specialmente nei soggetti prove- nienti da aree endemiche, è essen- ziale dimostrare la presenza del pa- rassita poiché la sola dimostrazione di anticorpi, spesso non elevati in queste forme, non è sufficiente a correlare l’infezione in atto con la manifestazione “atipica” rilevata. Per maggiori approfondimenti in merito, è possibile avvalersi di linee guida elaborate da esperti del gruppo Leishvet, di cui l’Autore fa parte (www.leishvet.org), riguar- danti la diagnosi, la stadiazione, la terapia, il monitoraggio e la prevenzione della LCan. Esempi di LCan atipica • Forme muco-cutanee o cutanee da L.infantum, segnalate sia nel cane ma anche nell’uomo (ad esempio in aumento in soggetti immunodepressi come HIV+ o affetti da altre patologie immunodepres- santi croniche).

• Forme cutanee da L.tropica: questa specie era finora considerata antroponoti- ca, cioè trasmessa solo da uomo a uomo (responsabile del cosiddetto “bottone d’oriente”), ma ad oggi è stata segnalata anche nel cane, in Israele. In Italia questa specie è segnalata in alcuni immigrati pro- venienti dal medio-oriente, ma attualmente nel nostro Paese non è presente il suo specifico vettore (P. papatasi). • Forme cutanee da L. major, segnala- te nel cane in Nord Africa; il suo vettore è P. sergenti, che è stato isolato in Sicilia. Il pa- rassita ha come reservoir naturale alcuni roditori (gerbilli) non presenti in Italia. • Forme complicate da neoplasie (lin- fomi, tumori venerei, ecc...) o da altre pato- logie concomitanti (ad esempio ehrichiosi). • Coliti: in cani infetti alcuni studi hanno dimostrato in tutto il tratto intestinale, so- prattutto cieco e colon, un’alta concentra- zione di parassiti. In zona endemica, per- tanto, in un cane che presenta come unico sintomo una colite è bene includere nella diagnosi differenziale anche la LCan. 9 Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Animali da compagnia Malattie parassitarie VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 9

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• Leishmaniosi epatica: in zone ende- miche, in caso di diagnosi di epatite cronica idiopatica è bene effettuare una biopsia epatica perchè sono segnalati rari casi di LCan epatica. La profilassi vaccinale Il vaccino non può impedire al flebotomo di pungere l’ospite e quindi al parassita di infettare il cane; purtroppo ad oggi non so- no disponibili vaccini in grado di sterilizzare l’animale una volta che esso si infetta con Leishmania. Inoltre, deve essere tenuto in conto che in zona endemica, nonostante la sierologia negativa, potremmo comunque vaccinare cani già infetti (quella fetta di ani- mali solo PCR+).

Un vaccino “ideale” dovrebbe assicurare una buona stimolazione immunitaria, es- sere sicuro ed efficace, e rendere il cane non infettante per il vettore.Allo stato at- tuale, però, i vaccini disponibili in commercio sono in grado di limi- tare l’espressione clinica della ma- lattia, molto importante quando ci si riferisca a una patologia proto- zoaria cronica e potenzialmente mortale come la leishmaniosi cani- na. Ricordiamo, a titolo di esempio, co- me anche altri vaccini anti-protozoari, tra cui la malaria, non riescono che a limitare le forme più severe di malattia, e non evi- tano che i soggetti restino portatori di parassita.

Per quanto concerne il CaniLeish® , unico vaccino disponibile in Italia, la letteratura scientifica dimostra che è in grado di dare una buona stimolazione immunitaria, che tale stimolazione resiste per un anno e che le quote parassitarie sono nettamente ri- dotte nei soggetti vaccinati. Per questo mo- tivo, i flebotomi che si infettano su cani vaccinati assumono meno parassiti rispetto a quelli infettatisi su cani non vaccinati. Ricordiamo però che il vaccino non è in grado di proteggere il cane dall’infezione iniziale; per tale motivo è essenziale pro- teggere con repellenti anche i soggetti vac- cinati.

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Introduzione La difficile gestione della leishmaniosi cani- na (LCan) sotto il profilo sia clinico che epidemiologico è in massima parte con- nessa all’indaginoso iter diagnostico di tipo integrato, che richiede il ricorso contem- poraneo a test diretti (citologia, istologia, immunoistochimica, PCR) e indiretti (sie- rologia qualitativa/quantitativa) combinati poi con i riscontri clinico-patologici. Non esiste infatti, allo stato attuale, un test dotato di indici di accuratezza assoluti (gol- den test, 100% sensibilità e specificità), i quali peraltro cambiano sulla base sia del contesto epidemiologico dal quale l’anima- le proviene, sia del suo inquadramento cli- nico. Indipendentemente dal contesto in cui il medico veterinario si trovi a operare, però, la ricerca degli anticorpi specifici ri- mane un passo fondamentale, e frequen- temente il primo intrapreso, nella diagnosi di LCan.

È stato dimostrato che la risposta immuni- taria del cane durante l’infezione da Leishmania infantum mostra una dicotomia rappresentata dal bilanciamento della sot- topopolazione di linfociti T helper CD4+ Th1 (risposta cellulo-mediata) e Th2 (ri- sposta umorale), in grado di pregiudicare sia la resistenza o la suscettibilità all’infezio- ne, sia la progressione verso una forma franca di malattia.Tale dicotomia non risulta tuttavia netta, come si osserva in corso di infezione sperimentale murina con la spe- cie dermotropa Leishmania major, ma sem- pre mista Th1-Th2, con predominanza di una sull’altra componente; infatti una pro- duzione anticorpale più o meno evidente a seconda dell’orientamento immunitario del cane è sempre presente e sfruttabile a scopo diagnostico sia in cani malati che in- fetti asintomatici. A supportare il ruolo centrale della sierologia le due classificazio- ni del paziente leishmaniotico elaborate ri- spettivamente dal Canine Leishmaniasis Working Group (CLWG), che individua 4 categorie (esposti, infetti asintomatici, infetti sintomatici, sintomatici gravi) e dal LeishVet Group, che riconosce lo stadio di malato lieve, moderato, grave e molto grave. Per entrambe, la definizione di tali categorie è basata sulla combinazione del dato siero- logico quantitativo con i risultati di ulteriori indagini di laboratorio e rilievi clinico-pato- logici.

Gli ambiti di applicazione della sierologia sono molteplici e i differenti test sierologici a disposizione risultano praticissimi sia che si operi in ambito epidemiologico, che cli- nico-pratico, purché se ne conoscano i li- miti di applicabilità. Utilità dei dati sierologici In ambito epidemiologico i dati sierologici possono essere sfruttati come segue. a) Studi di prevalenza/incidenza, fi- nalizzati a valutare le dinamiche di espan- sione dell’infezione nella popolazione cani- na di un determinato areale, utili alla defi- nizione di piani di sorveglianza e controllo. Si tenga conto che, ad esempio, in Brasile il Ministero della Salute ha individuato la popolazione canina come target per il con- trollo della trasmissione della Leishmaniosi Viscerale Umana (LVZ) prevedendo nel piano di sorveglianza l’eutanasia dei cani sierologicamente positivi.

b) Individuazione precoce di sogget- ti “esposti” o “infetti asintomatici” che, in genere, mostrano una risposta umorale rilevabile di medio-bassa intensità (compresa tra 1/40 e 1/320) e talvolta flut- tuante. Il dato sierologico associato a tali soggetti risulta di particolare importanza in quanto: 1) costituiscono il gruppo più rappresen- tativo in contesto endemico e tendono a siero-convertire già durante la stagione di trasmissione o nei mesi immediatamente successivi, fornendo una rapida idea del li- vello di pressione parassitaria al quale la popolazione canina è esposta; 2) la loro individuazione risulta utile nella pianificazione di spostamenti di animali da areali iper-endemici ad areali a bassa o nul- la endemia a motivo del loro potenziale di infettività per vettori competenti. c) Individuazione gruppi di animali non infetti da utilizzare come nucleo sta- bile di donatori nell’ambito di centri emo- trasfusionali, che sottostanno a rigide rego- le ministeriali che impongono una negati- vità a Leishmania (sierologia negativa o dubbia associata a negatività alla ricerca di- retta).

11 ■ Utilizzo e interpretazione dei test sierologici nell’era vaccinale Diagnosi di LCan La ricerca degli anticorpi specifici rimane un passo fondamentale, e frequentemente il primo intrapreso, nella diagnosi di LCan. Animali da compagnia Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Dott.ssa Fabrizia Veronesi Dipartimento di Medicina Veterinaria, Università degli Studi di Perugia Malattie parassitarie VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 11

Nella pratica clinica il ricorso alla sierologia è utile per: a) Inquadrare correttamente il sog- getto leishmaniotico nel gruppo degli “infetti malati” o dei “malati gravi”, a partire dalle linee guida elaborate dal CLWG, indispensabile sia per la prognosi che per futuri protocolli di trattamento. Il periodo di incubazione della malattia nel corso di infezioni naturali è lungo, non in- feriore ai 8 mesi, e la patogenesi della LCan nelle sue forme cliniche tipiche risulta con- nessa a una imponente risposta umorale contro il parassita (patologia da immuno- complessi), questo comporta che, al mo- mento della presentazione clinica, i cani mostrano spesso titoli anticorpali già ele- vati (IFAT > 1/640) (la sieroconversione, infatti, si osserva già a partire da 3-5 mesi successivi al contatto con il parassita), do- sabili attraverso una sierologia quantitativa e conclusivi dello stato di infezione. b) Individuazione precoce di animali “infetti asintomatici” al fine di: 1) instaurare precisi protocolli di monito- raggio (es. valutazione sierologica a caden- za trimestrale o semestrale a seconda della compliance del proprietario) per valutare movimenti anticorpali, utili a definire la pro- gressione della patologia e ridurre così, at- traverso trattamenti mirati, il danneggia- mento di organi vitali come il rene; 2) escludere la programmazione di proto- colli vaccinali, ricordiamo infatti che l’utilizzo dell’unico presidio vaccinale attualmente commercializzato in Italia (CaniLeish® - Virbac) è limitato a cani risultati negativi al- lo screening sierologico pre-vaccinale. c) Follow up terapeutico: il monitorag- gio della risposta terapeutica attraverso la cinetica anticorpale è controverso; a parte alcuni recenti lavori, la Comunità Scientifica è concorde nel considerare la diminuzione del titolo anticorpale (passaggio da un ti- tolo anticorpale a uno almeno due volte inferiore) un indice terapeutico a lungo termine. A motivo, infatti, dell’elevata emi- vita anticorpale, la riduzione del titolo an- ticorpale non risulta significativa in media prima di 6 mesi dall’inizio del trattamento, per alcuni soggetti può essere necessario anche un anno.

d) Individuazione precoce dei casi di recrudescenza. La sierologia può essere utilizzata per monitorare la ripresa di sti- molazione antigenica da parte del parassita e quindi il rialzo anticorpale tra una recidi- va e la successiva. Test sierologici formulati per la ricerca anticorpale in corso di LCan Esiste un’ampia gamma di tecniche siero- logiche applicabili alla diagnosi di LCan. Esse si dividono in test qualitativi [Immunocromatografici-ICT, es. Speed Leish K™ (Virbac), ELISA rapidi (SNAP test® (IDEXX)], i quali forniscono un risul- tato dicotomico presenza/assenza di anti- corpi espresso attraverso la comparsa di bande o spots reattivi; test quantitativi, i più attendibili e utilizzati sia in campo pra- tico-clinico che epidemiologico, in quanto consentono la definizione del livello anti- corpale (titolo finale, end-point), diretta espressione della concentrazione di anti- corpi presenti e quindi dell’intensità della stimolazione antigenica, e di utilissimo orientamento per l’inquadramento del pa- ziente leishmaniotico.

Esistono, inoltre, tecniche come Western blotting che, pur avendo degli indici di ac- curatezza elevatissimi, non sono applicabili alla pratica routinaria ma sono utilizzati, ad esempio, nelle prove comparative tra test come analisi ottimali di confronto. IFAT Test allestito a partire da antigeni corpu- scolati (promastigoti in toto/antigeni crudi) di L. infantum, ancora ritenuto dal Manuale OIE (World Organization for Animal Health, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals) il metodo sierologico di riferimento (golden test), non a caso è il test ancora utilizzato sia dall’Istituto Superiore di Sanità che dal Centro di Referenza Nazionale per la Leishmaniosi (CReNal). È dotato di elevata sensibilità e specificità (prossima al 100%), a eccezione di aree endemiche del Centro e Sud America, dove la presenza contemporanea di Trypanosoma cruzi ne riduce l’indice pre- dittivo positivo per cross-reazione, seppur a basso titolo, o in condizioni di alterazione dell’assetto immunitario come in corso di patologie su base autoimmunitaria (vedi lu- pus eritematoso sistemico) o altre malattie infettive (vedi ehrlichiosi, toxoplasmosi). Il cut-off (titolo soglia che garantisce sensi- bilità e specificità ottimali) varia da 1/80 a 1/160, in funzione dell’areale di rilievo (me- dici veterinari che operano in areali a me- dia e stabile endemia partono da cut off di positività di 1/160 e considerano 1/80 e 1/40 dubbi, di contro nelle Regioni del nord Italia si considerano come piene po- sitività anche titoli di 1/80). È stato inequivocabilmente dimostrato che alti tassi anticorpali in IFAT (≥ 1/1280, quat- tro volte il titolo soglia) sono associati a elevati livelli di parassitismo e forniscono una diagnosi definitiva di malattia. Il limite insito in questa metodica è rappresentato da: a) lettura soggettiva del preparato che tal- volta può far variare da operatore a ope- ratore la soglia di positività anche di un pa- io di titoli (da 1/40 a 1/160), con ripercus- sioni sull’inquadramento del cane leishma- niotico; b) natura della risposta anticorpale rilevata nei confronti di tutte le componenti del parassita, comprese le proteine ESP del vaccino attualmente in commercio. 12 Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Animali da compagnia Malattie parassitarie VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 12

ELISA Esistono numerosi test ELISA (Leiscan® Leishmania ELISA Test, Esteve Veterinaria; ID Screen® Leishmaniasis Indirect Test,VET-Innovate ID Diagnostics; Leishmania 96® , Agrolabo S.p.A.) messi a punto per la diagnosi di LCan, la cui sensi- bilità e specificità dipende dalla natura degli antigeni impiegati (estratti solubili interi di promastigoti e amastigoti, proteine ricom- binanti e proteine purificate). I test che uti- lizzano estratti solubili in toto (antigeni cru- di) hanno la resa in termini soprattutto di specificità più bassa e sensibilità leggermen- te inferiore all’IFAT, soprattutto negli infetti asintomatici; al contrario, quelli che utilizza- no proteine ricombinanti (es. RA2, rK9, rK26 e rK39) o purificate, mostrano indici di accuratezza del tutto sovrapponibili all’IFAT per tutti gli inquadramenti clinici. I risultati ottenuti dall’applicazione di tali tecniche si esprimono in valori di lettura densofotometrica (densità ottica, DO) e vengono poi convertiti sulla base di un campione di riferimento in valori percen- tuali corrispondenti ai titoli anticorpali in- dividuabili con IFAT. La consuetudine all’uti- lizzo dell’IFAT, crea talvolta delle confusioni nell’interpretazione dei risultati ELISA, in quanto essi si esprimono secondo scale di valori differenti rispetto al test di riferimen- to, ma che consentono comunque l’inqua- dramento in titoli bassi, medi e alti. L’errore più volte riscontrato consiste nell’utilizzo di un test di conferma diagno- stica pre-trattamento di un tipo e post- trattamento di un altro, in questi casi la dif- formità della scala di valori rende difficile la valutazione dello scarto osservato (sie- roconversione in positivo o in negativo). Test rapidi I saggi immunocromatografici (ICT) e i test in ELISA rapida (SNAP test) sono estre- mamente diffusi nella pratica clinica, in quanto hanno l’indubbio vantaggio di esse- re veloci da utilizzare e di facile interpreta- zione. Essi sono dotati di un’ottima specifi- cità, legata all’utilizzo di antigeni come l’epi- topo immunodominante K39 (K39) del ki- netoplasto di amastigoti di L. infantum e L. donovani utilizzato come fonte antigenica del test commerciale RK39® DipStickTest (DiaSys), o le kinesine utilizzate nello Speed Leish K™ (Virbac) che captano la reattività sierica verso componenti paras- sitarie specifiche e non verso componenti generiche del parassita come accade con l’utilizzo di test allestiti a partire da antigeni crudi (IFAT o alcune ELISA). Questa affinità elettiva consente a tali test di mantenersi negativi laddove la risposta anticorpale sia evocata da frazioni proteiche purificate dif- ferenti da quelle utilizzate come fonte an- tigenica vaccinale, non interferendo pertan- to con gli anticorpi prodotti in corso di vaccinazione con CaniLeish® (Virbac).

La loro sensibilità, di contro, varia con- siderevolmente a seconda dell’in- quadramento del cane: in genere è ottimale (> 97%) in soggetti infetti sintomatici e sintomatici gravi, i quali mostrano titoli IFAT inequivocabilmente positivi e spesso medio-alti (≥ 1/160), e nei soggetti inequivocabilmente negati- vi all’IFAT (non infetti e non esposti), mentre si riduce notevolmente (< 60%) nel gruppo degli infetti asin- tomatici e negli esposti, che mostrano in genere titoli IFAT bassi o dubbi (1/40 o 1/80). Per test rapidi è stato dimostrato un aumento di sensibilità di circa il 15% a fron- te di una lettura protratta oltre quella indi- cata dalla casa produttrice (30 min versus 20 min per Speed Leish K™). Studi comparativi condotti utilizzando co- me test di riferimento IFAT e WB hanno saggiato le performance diagnostiche dei test rapidi di più comune utilizzo nella pra- tica clinica [Speed Leish K™ (Virbac), rK39® Dipstick (DiaSys), Witness® Leishmania (Symbiotics), SNAP® Leishmania Test (IDEXX)] applicandoli in vari contesti epi- demiologici e clinici.Tali studi hanno delinea- to un comune ambito di utilizzo di tali test: essi non si prestano a indagini di tipo epidemiologico, in quanto spesso non rilevano la condizione di “espo- sto” di estrema importanza sotto il profilo epidemiologico; di contro, il loro utiliz- zo può essere promosso “in clinic” soprattutto in corso di sospetto cli- nico. Ad ogni modo, anche nella pratica cli- nica è sempre auspicabile l’utilizzo seriale di un test rapido di screening seguito da un approccio sierologico di tipo quantitativo (ELISA o IFAT), per escludere false negati- vità connesse a cani con bassi titoli anticor- pali e per quantificare il livello anticorpale, di orientamento per l’inquadramento clini- co del paziente leishmaniotico.

Vaccinazione Non esiste allo stato attuale un vaccino pienamente efficace per il controllo della LCan; è tuttavia oramai universalmente ac- cettato che la resistenza alla LCan dipenda in primo luogo dallo sviluppo già dal primo contatto con il parassita di una specifica e dominante risposta Th1 che consenta al- l’animale di gestire prima l’infezione e poi la malattia e che pertanto i presidi immu- nizzanti debbano avere in primis la finalità di modulare tale risposta. Attualmente in Europa è commercializzato CaniLeish® (Virbac)*, vaccino spento le cui componenti sono rappresentate rispettiva- mente da proteine escrete secrete purificate 13 Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Animali da compagnia Malattie parassitarie Dubbio 1/40-1/80 >35% < 150% Basso 1/160-1/640 >150%< 300% Medio-alto >1/640 ≥ 300 Titolo IFAT ELISA VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 13

(ESP) (LiESP), una parte di proteine del sur- face antigenico di superficie (Promastigote Surface antigen, PSA) di L. infantum, e da un adiuvante (QA-21), una frazione altamente purificata della Quillaja saponaria. L’azienda produttrice riporta chiaramente nella scheda tecnica del prodotto il target di destinazione (cani non infetti) del presidio immunizzante e il “modus operan- di” per la conduzione dello screening sie- rologico pre e post-vaccinale. Studi in essere stanno valutando l’opzione dell’utilizzo del vaccino come agente im- munoterapico in animali già infetti per bloccare la progressione della malattia, ma non esistono allo stato attuale evidenze definitive che supportino tale utilizzo. Interferenza tra vaccinazione e test sierologici I trials di efficacia hanno dimostrato che il vaccino CaniLeish® (Virbac) evoca una imponente risposta di tipo Th1 in grado di bloccare l’instaurarsi dell’infezione attiva in circa il 50% degli animali esposti ma soprattutto di abbattere del 70% il rischio di pro- gressione verso la malattia,e che ta- le profilo persiste per un intero anno dopo la vaccinazione, richiedendo un ri- chiamo su base annuale in grado di garanti- re un persistente risultato. Accanto alla ri- sposta immunitaria di tipo cellulo-mediato Leishmania-specifica (Th1-protettiva),è stata osservata,però,anche una costante risposta umorale contro le componenti vaccinali ESP e PSA di CaniLeish® , in grado di interferire sugli indici predittivi positivi di test diagno- stici di tipo quantitativo, allestiti con antigeni crudi come l’IFAT. Per questi test risulta dif- ficile, infatti, discriminare gli anticorpi di ori- gine vaccinale da quelli evocati all’infezione naturale da L. infantum, aspetto di non mini- male importanza se consideriamo la poten- zialità di infezione anche in cani vaccinati. È stato dimostrato che in realtà la risposta anticorpale verso le componenti vaccinali evoca la produzione di sottoclassi di IgG differenti (es. IgG2) da quelle stimolate in corso di infezione attiva, ma tale aspetto ri- sulta di difficile valutazione in ambito clini- co-pratico.

Facendo riferimento alla cinetica anticor- pale osservata in corso di vaccinazione con CaniLeish® , è stato osservato che, in una percentuale variabile tra il 20% e il 90% dei cani“correttamente” vaccinati e“richiama- ti”, nei mesi successivi all’intervento vacci- nale si ha una moderata produzione anti- corpale rilevabile dall’IFAT, la quale in gene- re si attesta su titoli medio-bassi (≥ 1/40 e ≤ 1320) raggiungendo il picco intorno al 4° mese; di fatto è possibile osservare titoli anche elevati (≥1/1280), che in condizioni pre-vaccinali sarebbero considerati conclu- sivi di malattia.Tale positivizzazione, che ini- zialmente sembrava transitoria, nella realtà persiste in una buona percentuale di casi per mesi (minimo 6), subendo una pro- gressiva diminuzione che comunque tende a mantenere il test IFAT comunque positi- vo (≥ 1/40).Tale positività subisce inoltre un rialzo in concomitanza del booster an- nuale, raggiungendo una intensità sovrap- ponibile a quella evocata dal primo ciclo vaccinale.

Sulla base di tali riscontri si vengono a de- lineare dei netti ambiti di utilizzo dei diffe- renti test diagnostici a nostra disposizione per ottenere la massima resa diagnostica, sia in fase pre che post-vaccinale. In particolare è necessario tenere conto dei limiti delle tecniche rapide nello scree- ning pre-vaccinale, considerati i deficit di sensibilità che tali tecniche hanno nel rile- vare lo stato di esposto e talvolta di infetto asintomatico da escludere per regola dalla profilassi vaccinale. In questa fase sono da prediligere le tecniche quantitative tradizio- nali che forniscono maggiore affidabilità nella captazione di tutte le possibili catego- rie di animali. Di contro, nella fase post-vac- cinale l’utilizzo esclusivo delle tecniche quantitative tradizionali può essere fuor- viante. La resa in fase di monitoraggio post- vaccinale dei test rapidi quali Speed Leish K™ (Virbac) rispetto all’IFAT riflettono le affinità differenziali delle fonti antigeniche utilizzati nei due test diagnostici verso gli anticorpi prodotti nel corso di infezione at- tiva o nel corso di vaccinazione. Queste regole generali non tengono con- to, però, di tutte quelle variazioni sull’anda- mento della risposta ai test connesse all’er- rato utilizzo del presidio immunizzante (es. cani che nel post-vaccinale sviluppano pa- tologie che richiedono la somministrazione prolungata di alti dosaggi di corticosteroidi, cani vaccinati ma non richiamati annual- mente, cani vaccinati la cui anamnesi non riferisca della profilassi vaccinale alla quale sono stati sottoposti), che purtroppo risul- tano di frequente riscontro nella routine. È possibile concludere pertanto che: a) il modus operandi più corretto e che si presta al minor numero di errori interpre- tativi resta il ricorso a un iter diagnostico di tipo integrato (esami diretti e indiretti), in grado di confutare in via definitiva l’eventuale stato di infezione; b) la vaccinazione resta, a nostro avviso, una valida possibilità da prospettare solo però ad animali sotto attento e costante controllo; in alternativa diventa uno stru- mento in grado di alterare dinamiche di in- fezione ben note e quindi di più facile ge- stione e di interferire con la resa di test diagnostici che fanno parte del nostro re- taggio culturale e che conservano, di fatto, rese ottimali in situazioni note. * http://bit.ly/EMA_CaniLeish 14 Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Animali da compagnia Malattie parassitarie VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 14

I l controllo della LCan è particolarmen- te importante nei soggetti donatori di sangue, perché è stato dimostrato il ri- schio di trasmissione di agenti infettivi at- traverso i prodotti trasfusionali. Secondo la Linea guida relativa all’eser- cizio delle attività veterinarie riguardanti la medicina trasfusionale in campo vete- rinario (2016), istituita dal Ministero della Salute, i cani donatori devono essere cli- nicamente sani e sottoposti ad esame cli- nico completo oltre che a prove di labo- ratorio, tra cui profilo emato-biochimico completo, e test sierologici (IFAT o PCR), per Leishmania infantum, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum, e Babesia canis.

Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare i parametri ematologici, biochi- mici e sierologici in un gruppo di cani sani vaccinati con CaniLeish® che partecipano a un programma di donazione volontaria di sangue presso il Centro trasfusionale ve- terinario dell’Università di Pisa. Materiali e metodi Criteri di selezione Sono stati inclusi nello studio n° 21 cani di proprietà che partecipano a un pro- gramma di donazione volontaria di san- gue presso l’Università di Pisa e 3 cani non donatori. In particolare 14 femmine e 10 maschi, di età compresa fra i 2 e i 7 anni (9 Boxer, 4 meticci, 3 Golden Retriever, 2 Dobermann e 6 di altre raz- ze). I criteri di selezione usati per inclu- dere i cani come donatori di sangue so- no stati i seguenti: gruppo DEA (Dog Erythrocyte Antigen) uno negativo, assen- za di qualsiasi segno o sintomo clinico di malattia, valori di emocromo completo (CBC), profilo biochimico del siero (SBP) ed elettroforesi delle proteine sieriche (SPE) entro i valori di riferimento; test sierologico (IFAT) negativo o positività a basso titolo senza altri segni per L. infan- tum, E. canis e A. phagocytophilum e test Speed Leish KTM negativo. Inoltre, tutti i cani hanno ricevuto una protezione re- golare contro gli ectoparassiti, con far- maci repellenti e/o antifeeding applicati localmente.

Somministrazione del vaccino Il vaccino liofilizzato CaniLeish® , conser- vato a + 4/10 °C, è stato ricostituito con il suo solvente e somministrato ai cani per via sottocutanea nella regione del garrese. Gli animali sono stati monitorati per 30 minuti, al fine di osservare l’insor- genza di eventuali reazioni avverse. I pro- prietari sono stati invitati a segnalare qualsiasi reazione sospetta o effetto ne- gativo eventualmente verificatisi e, in tal caso, a riportare l’animale in ambulatorio per un controllo. Il vaccino è stato som- ministrato secondo il protocollo indicato nelle istruzioni del produttore: primo ci- clo di 3 inoculazioni, a distanza di 3 setti- mane, e richiami annuali con una singola inoculazione.

Protocollo di studio I cani sono stati divisi in 3 gruppi a seconda della fase di vaccinazione: - Gruppo 1: 5 cani (III richiamo annuale); - Gruppo 2: 10 cani (II richiamo annuale); - Gruppo 3: 7 cani, (I richiamo annuale); - Gruppo 4: 6 cani (I ciclo nel periodo 2015-2016). I tempi (T) in giorni dei controlli erano: -T0 (basale); -T1 (2° inoculo vaccino); -T2 (3° inoculo vaccino); -T3 (2 mesi post 3° inoculo vaccino); -T4 (1° richiamo annuale); -T5 (2° richiamo annuale); -T6 (3° richiamo annuale); In tutti i tempi da T0 a T6 sono stati ese- guiti CBC, SPE, Prot C reattiva, IFAT Leishmania e Speed Leish K™ a T4,T5,T6 anche PCR qualitativa (Starita et al., 2016). Risultati e Conclusioni Analisi emato-biochimiche Non sono risultati statisticamente significa- tivi i dati relativi a CBC e allo striscio di sangue.

Per quanto concerne il SBP, si è registrata nel 29,8% dei casi una iperproteinemia fino a 8,4 g/dl (range di riferimento 5,8-7,8 g/dl), che però non è risultata statisticamente si- gnificativa. Significativo (p

babilmente riconducibile allo sviluppo di ri- sposta infiammatoria e immunitaria post- vaccinale; infatti, altri Autori avevano già ri- portato un innalzamento dei valori di Proteina C Reattiva, ceruloplasmina e ap- toglobina in soggetti infetti da Leishmania e asintomatici (Martinez-Subiela, 2002). Per quanto riguarda i risultati relativi a SPE, l’analisi statistica mostra una significatività (p

Segnalamento e anamnesi Bullmastiff mantello rosso di 10 mesi, ma- schio di nome Red. Il cane è stato acquistato all’età di 5 mesi (giugno 2016) presso un allevamento ama- toriale sito a Varese; attualmente vive a Perugia. È stato regolarmente vaccinato e sver- minato ed è sottoposto a profilassi an- ti-vettoriale con prodotti spot-on a ba- se di piretroidi. Vive in giardino con un altro cane di età di 2 anni e viene ali- mentato con mangime secco di buona qualità.

Nel novembre 2016 Red viene condotto a visita dal medico veterinario per males- sere generale, mancanza di appetito e presenza di forfora diffusa soprattutto sul dorso. Esame obiettivo generale Lieve abbattimento Temperatura rettale: 38,7 °C Mucose: rosee e prive di lesioni Stato di idratazione: buono Stato di nutrizione: buono Funzioni organiche: mantenute Lieve linfoadenomegalia retromandibolare Palpazione addome: niente di rilevante Auscultazione torace: niente di rilevante Esame obiettivo particolare di cute e annessi cutanei Dermatite esfoliativa secca non pruriginosa a carico di dorso e fianchi Diagnosi differenziale - Dermatosi vitaminica A-sensibile - Dermatosi zinco-sensibile - Seborrea primaria idiopatica - Cheyletiellosi - Leishmaniosi Iter diagnostico • Ispezione del pelo, scotch test, passaggio del mantello con un pettine a denti stretti e visione del materiale raccolto allo stereo- microscopio: negativo.

• Esami emato-biochimici ed elettroforesi delle proteine sieriche: niente di rilevante. • Indagini sierologiche per Leishmania in- fantum: positivo con titolo IFAT finale 1/160. • Ricerca diretta del DNA parassitario (PCR) di Leishmania infantum da esfoliato oculo-congiuntivale e puntato linfonodale dei linfonodi retromandibolari: negativo. Diagnosi Dermatite probabilmente di origine caren- ziale, da trattare eventualmente mediante somministrazione di integrazioni specifiche, 17 ■ Caso studio n° 1:Red Bullmastiff con dermatite esfoliativa secca non pruriginosa e positività sierologica per Lcan.

Animali da compagnia Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Dr.ssa Manuela Diaferia Dipartimento di Medicina Veterinaria Università degli Studi di Perugia Malattie parassitarie © Inna Astakhova - shutterstock.com VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 17

non attribuibile a LCan. La positività siero- logica dimostra lo stato di “esposizione” dell’animale a Leishmania (si ricorda che per soggetto esposto si intende un cane senza alterazioni cliniche e/o clinico pato- logiche dimostrabili attribuibili a LCan, nel quale i test parassitologici diretti risultino negativi, ma siano evidenziabili titoli anti- corpali specifici < 4 volte il valore soglia del laboratorio di riferimento). Ipotesi 1)Trasmissione trans-plancentare dell’infe- zione.

2) Contatto con il parassita durante il pe- riodo di soggiorno aVarese. 3) Contatto con il parassita nell’areale um- bro. Per verificare la prima ipotesi, viene richie- sta all’allevatore di controllare lo status sie- rologico della madre. Il test IFAT eseguito sul siero della madre in due distinti labora- tori conferma la negatività. La positivizzazione è attribuibile pertanto alla stimolazione antigenica evocata dal contatto ripetuto del cane con flebotomi infetti durante la stagione di trasmissione, questa può essere avvenuta sia a Varese, prima dell’acquisto dell’animale, che a Perugia. Considerando l’assetto epidemio- logico di LCan in ambito italiano la possi- bilità che il cane abbia subito un’elevata pressione parassitaria nel soggiorno a Varese è piuttosto improbabile dal mo- mento che la provincia si trova in un areale a bassa e sporadica endemia e che il sog- getto è stato acquistato poco dopo l’inizio della stagione di trasmissione, quando la quota di flebotomi infetti circolanti è mini- ma. Di contro la permanenza durante tut- to il picco di trasmissione a Perugia, areale a moderata e stabile endemia supporta maggiormente l’ipotesi che l’animale abbia subito la massima stimolazione antigenica utile alla sieroconversione in tale contesto. Discussione La sieropositività riscontrata è l’espressione di una stimolazione antigenica evocata dal contatto con il parassita; considerando che il pe- riodo di sieroconversione è in media 3-5 mesi,risulta normale al termine di una stagione di trasmissione (fine novembre) trovare una sieropositi- vità a basso titolo come quella riscon- trata in Red.

Di contro, è difficile pensare che al termine della stagione il cane avesse già concluso il periodo di incubazione della malattia, ma- nifestando già lesioni dermatologiche. Proprio per determinare la re- sponsabilità o meno di Leishmania infantum risulta essenziale affian- care all’esame sierologico la ricer- ca diretta (PCR) del DNA parassi- tario (che nel nostro caso è risultata negativa). Infine, ribadiamo l’importanza di far riferi- mento sempre alla stessa tecnica diagno- stica (evitare quindi di alternare test in IFAT con test in ELISA) e ricorrere allo stesso laboratorio, al fine di valutare correttamen- te i risultati e le eventuali variazioni nel tempo.

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Anamnesi Mei: Labrador, femmina sterilizzata, 7 anni Diagnosi di leishmaniosi da 3 anni. Difficoltà nella gestione terapeutica (erano stati utilizzati diversi farmaci in quanto il ca- ne mostrava gravi reazioni avverse al glu- cantime; ecograficamente aveva segni di mineralizzazione a livello renale, per cui il dosaggio dell’allopurinolo era mantenuto basso; il cane veniva trattato con cicli di miltefosina). Portata a visita specialistica in quanto da 6 mesi presentava una singola lesione ul- cerativa al cuscinetto metatarsale + linfa- denomegalia regionale (popliteo). Non erano presenti altre lesioni cutanee o si- stemiche.

Il medico veterinario curante aveva intrapre- so una terapia topica, ma senza successo. PCR su puntato dal linfonodo megalico: positiva per Leishmania. IFI per Leishmania infantum: positiva, con ti- tolo di 1/160 finale. Tutti gli altri esami di laboratorio (profilo emato-biochimico e urinario) erano nella norma. Diagnosi differenziale - Ulcera indotta da Leishmania (per pre- senza diretta del parassita o per danno im- munomediato) - Ulcera da altra causa: trauma +/- associa- to ad infezione secondaria; vasculite; rea- zione avversa a farmaco; neoplasia; sindro- me paraneoplastica Iter diagnostico • Esami citologici - Lesione sotto al cuscinetto: materiale ematico, pochi fibroblasti (compatibili con il processo di cicatrizzazione), macrofagi - Linfonodo regionale: materiale ematico • Esame bioptico (area al margine dell’ul- cera): mostrava un moderato infiltrato in- fiammatorio, caratterizzato prevalente- mente da macrofagi, associati a un numero inferiore di linfociti, neutrofili e plasmacel- lule e rari mastociti. Nel citoplasma di iso- lati macrofagi si evidenziavano alcuni ele- menti la cui morfologia, seppur suggestiva, non era indicativa di amastigoti di Leishmania.

Diagnosi Dermatite linfoistiocitaria cronica, grave, da multifocale a confluente. In considerazione del pattern istologico e dell’anamnesi, sono stati eseguiti esami biomolecolari (PCR) per la ricerca di DNA di Leishmania a partire dal tessuto incluso in paraffina.Tali indagini sono risul- tate positive. 19 ■ Caso studio n° 2:Mei Labrador in terapia per Leishmaniosi con ulcera metatarsale. Animali da compagnia Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Dr.ssa Chiara Brachelente Dipartimento di Medicina Veterinaria Università degli Studi di Perugia Malattie parassitarie Foto 1. Labrador, femmina sterilizzata, 7 anni. Focale ulcera cronica presente sul cuscinetto tarsale del terzo dito dell'arto posteriore sinistro. L'area centrale dell'ulcera rappresenta la sede del prelievo bioptico, effettuato due settimane prima (per gentile concessione della dott.ssa Alessandra Fondati).

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Come interpretare questo risultato positi- vo della PCR, visto che sappiamo che il ca- ne è già sierologicamente positivo per Leishmania? La lesione cutanea è dovuta o no al paras- sita? In questo caso l’ulcera è un segno di LCan? Ci sono diverse condizioni che aiutano a dare una risposta: - lesione clinica descritta nell’ambito dei quadri dermatologici associati a LCan; - esame istopatologico compatibile con LCan; - presenza diretta del parassita dimostrata mediante PCR (anche se l’esame gold stan- dard sarebbe l’IF o immunoistochimica di- retta su tessuto).

Terapia •Terapia con gel dermatologico riepiteliz- zante e bendaggio • Ripresa della terapia per leishmaniosi mediante aumento del dosaggio dell’allo- purinolo • Dieta a basso contenuto di purine (per i problemi di mineralizzazione renale) • Aggiunto domperidone, che aumenta la risposta immunitaria cellulo-mediata • Dopo 12 settimane si è registrata una guarigione clinica completa della lesione dermatologica, con una modica residua ipercheratosi. Discussione Quando ci troviamo di fronte a lesioni der- matologiche in un cane che vive in una zo- na endemica per LCan può trattarsi di: - lesioni da Leishmania in un cane malato; - lesioni non causate da Leishmania in un cane malato (quindi c’è un’altra causa per i segni clinici cutanei); - lesioni non causate da Leishmania in un cane infetto ma non malato.

Secondo una recente classificazione (Saridomichelakis–Koutinas,Vet Dermatol., 25: 61-71, 2014) delle manifestazioni cuta- nee in corso di LCan, la dermatite ulcera- tiva rientra tra le tre forme principali di le- sioni associate a Leishmania.Tuttavia un più recente criterio di classificazione (Ordeix– Fondati,Atti SIDEV 2015) distingue le ma- nifestazioni cutanee in forme tipiche (più comuni, direttamente correlate alla presen- za del parassita) e forme atipiche (nelle quali è difficoltoso non tanto dimostrare la presenza del parassita, quanto la sua re- sponsabilità eziologica, in quanto si hanno lesioni comuni ad altre patologie). Le for- me tipiche si evidenziano clinicamente co- me papule, scaglie, croste, placche e ulcere; le forme atipiche sono invece quadri in cui si evidenzia Leishmania, ma in cui è difficile dimostrare il ruolo diretto o indiretto degli amastigoti nel determinismo della lesione. Le dermatiti ulcerative compaiono sia tra le forme tipiche che fra quelle atipiche. È però considerata tipica della LCan solo quella dei punti di appoggio (vale a dire ul- cere delle prominenze ossee del carpo e del tarso); la dermatite ulcerativa dei cusci- netti, invece, insieme a quella delle estre- mità (punta delle orecchie e della coda), è considerata una forma atipica perché sem- bra essere legata non tanto alla presenza diretta del parassita, quanto a un disturbo di circolo dovuto alla patologia da immu- nocomplessi (vasculite) e va messa in dia- gnosi differenziale con altre cause di vascu- lite.

Meccanismi immunopatogenetici delle forme ulcerative in corso di LCan: 1) ulcerazione secondaria al processo in- fiammatorio, come nel caso dei punti di appoggio, giunzioni muco-cutanee e pla- num nasale; 2) trauma locale; in questo caso l’evento primario è un trauma di qualsiasi natura dove, successivamente e in maniera aspe- cifica, durante i processi di cicatrizzazione vengono richiamati localmente i macrofagi i quali, in animali infetti, veicolano nel loro citoplasma amastigoti di Leishmania. Questo meccanismo è stato dimostrato sia in Medicina umana che veterinaria come complicazione dei processi di guarigione di ferite chirurgiche, oppure nei casi di lei- shmaniosi ulcerativa associati a dermatite da leccamento delle estremità; 3) danno vascolare (vasculiti da immuno- complessi),in particolare a livello delle estre- mità (cuscinetti, padiglioni auricolari, coda). Quale è stato il meccanismo patogenetico nel nostro caso studio? L’aspetto clinico era compatibile con un dan- no vascolare,tuttavia l’aspetto istopatologico non era compatibile con una patogenesi im- munomediata (si trattava infatti di dermatite piogranulomatosa, con presenza intralesio- nale del parassita). Inoltre, nel nostro caso, una patogenesi immunomediata da precipi- tazione di immunocomplessi era poco pro- babile,poiché il titolo anticorpale dell’animale era basso.Pertanto l’ipotesi più plausibi- le è quella di un trauma a livello del cuscinetto che ha dato origine a una soluzione di continuo; trattandosi di un cane infetto, nella zona del trau- ma sono poi arrivati gli amastigoti di Leishmania che hanno quindi ostaco- lato la cicatrizzazione. Meno probabile l’ipotesi di una patogenesi simil punto di ap- poggio (cioè lesione ulcerativa secondaria al processo infiammatorio).

20 Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Animali da compagnia Malattie parassitarie Foto 2.Labrador,femmina sterilizzata,7 anni.Dermatite linfoistiocitaria e neutrofilica (granulomatosa e piogra- nulomatosa) cronica, grave, da multifocale a confluente, che interessa il derma superficiale, medio e profondo. VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 20

Segnalamento e anamnesi Labrador, maschio intero, 3 anni di nome Chace. Nell’aprile del 2016 i padroni si so- no trasferiti da Roma nel comune di Perugia. Nell’agosto del 2016 Chace viene condot- to, per la prima volta, presso l’ambulatorio di un collega libero professionista per la presenza di un diradamento di pelo a ca- rico della regione del muso (in particolare a livello perioculare e della canna nasale). I proprietari, pur non avendo con sé al mo- mento della visita il libretto sanitario del- l’animale, riferiscono che Chace è regolar- mente vaccinato e sverminato, nonché trattato mensilmente con un prodotto spot-on a base di permetrine da maggio fi- no a ottobre.

Il cane vive prevalentemente in casa (con possibilità di accesso al giardino durante il giorno) ed è la prima volta che mostra problemi di natura dermatologica. Diagnosi differenziali - Dermatofitosi - Demodicosi - Leishmaniosi Iter diagnostico Il collega esegue, nell’ordine: 1) un raschiato cutaneo profondo, risultato negativo; 2) un esame colturale del pelo per la ricer- ca di dermatofiti, che ha dato esito negati- vo; 3) un esame sierologico in IFAT per la ri- cerca di anticorpi verso Leishmania infan- tum presso i laboratori del Dipartimento di MedicinaVeterinaria di Perugia, risultato positivo, con titolo 1/320 IgG finale; 4) esami emato-biochimici ed elettroforesi delle proteine sieriche che non hanno evi- denziato alterazioni compatibili con LCan o altre patologie; 5) esami biomolecolari per la ricerca diret- ta del DNA di Leishmania (PCR da esfolia- to oculo-congiuntivale) negativa. Dati gli accertamenti fatti e le “circostan- ziate” manifestazioni cutanee, il collega de- cide di prescrivere degli integratori per il pelo e si riserva di rivalutare il caso a di- stanza di qualche settimana.

Nel mese di dicembre 2016, i proprie- tari riportano Chace a visita per un peg- gioramento del quadro dermatologico, con estensione delle lesioni di natura alopecica a carico di gran parte del mu- so e a livello della regione dei fianchi; il collega a questo punto decide di inviare il cane presso uno specialista in derma- tologia. 21 ■ Caso studio n° 3:Chace Labrador con diradamento del pelo a livello perioculare e di canna nasale. Animali da compagnia Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Dr.ssa Giulia Morganti Dipartimento di Medicina Veterinaria Università degli Studi di Perugia Malattie parassitarie © taylon - shutterstock.com VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 21

Visita specialistica Esame obiettivo generale: niente di rilevante Temperatura: 38,4°C; mucose: rosee; stato di idratazione: buono; linfonodi esplorabili: lievemente aumentato il linfonodo pre-sca- polare destro, gli altri nella norma; funzioni organiche: mantenute; temperamento viva- ce; palpazione addome: niente di rilevante; auscultazione torace: niente di rilevante; ispezione dei testicoli: normali in dimensio- ni e consistenza. Esame obiettivo particolare di cute e annessi cutanei Presenza di aree alopeciche multifocali, non pruriginose, simmetriche, a carico della re- gione della testa (periorbitale, temporale, labiale, planum nasale, auricolare) e dei fianchi.

Diagnostico differenziale Dermatofitosi Demodicosi Leishmaniosi Endocrinopatie Malattie immuno-mediate Iter diagnostico e risultati • Scotch test: negativo. • Raschiati profondi: negativi. • Esame con lampada di Wood: negativo. • Esame colturale per dermatofiti: negativo. • Esami emato-biochimici ed elettroforesi delle proteine sieriche: niente di rilevante. • Indagini sierologiche svolte presso il Dipartimento di Medicina Veterinaria di Perugia mediante IFAT per la ricerca di an- ticorpi di Leishmania infantum: positivo con titolo finale di 1/80 (due titoli inferiore ri- spetto alla precedente indagine svolta 4 mesi prima presso la medesima struttura e con la medesima metodica). • Ricerca diretta di DNA parassitario (PCR) di Leishmania infantum condotta a partire da esfoliato oculo-congiuntivale e puntato linfonodale: negativa. • Biopsia cutanea: quadro istopatologico compatibile con una alopecia non infiam- matoria; il ritrovamento di alcuni bulbi pili- feri degenerati e con segni di infiammazio- ne faceva sospettare la presenza di una pa- tologia immuno-mediata a carico dei bulbi piliferi stessi (tipo alopecia areata). Con i risultati alla mano (esame istopa- tologico non compatibile con LCan, ri- cerca diretta su target altamente sensi- bili di DNA parassitario negativa, titolo sierologico 1/80 - che ricordiamo essere espressione di uno stato di esposizione e non di infezione da LCan), lo speciali- sta esclude in via definitiva l’infezione da Leishmania e che le lesioni dermatologi- che osservate fossero riconducibili a LCan.

Diverse ipotesi vengono avanzate dallo specialista al fine di giustificare lo scarto di titolo anticorpale verso Leishmania (1/320 versus 1/80) osservato a distanza di 4 mesi: Ipotesi 1) Errore laboratoristico: a tale proposito, l’utilizzo del medesimo la- boratorio e della stessa metodica esclude ragionevolmente una variabilità di risultato inter-laboratorio. Ipotesi 2) Presenza di cross-reazioni con altri agenti infettivi: tale positività risulta del tutto aspecifica e di solito si at- testa su titoli bassi (1/40-1/80). Ipotesi 3) Reazione aspecifica da au- to-anticorpi presenti nel corso di al- cune malattie autoimmunitarie (es. lupus eritematoso sistemico): anche in questa fattispecie, i titoli che si riscontrano sono in genere bassi (1/40-1/80). Ipotesi 4) Presenza di stimolazione anticorpale da parte di antigeni vac- cinali: il dato relativo alla vaccinazione con CaniLeish® non era stato riportato in anamnesi.

Ai proprietari veniva pertanto chiesto di mostrare il libretto sanitario di Chace dal quale si evinceva che il cane nel febbraio del 2016 (prima del trasferimento presso la nuova residenza) era stato sottoposto al richiamo annuale con CaniLeish® . Chace è stato quindi sottoposto ad un ul- teriore prelievo di sangue per l’esecuzione del test in-clinic Speed Leish KTM (Virbac), risultato negativo. Questo ha fornito un’ul- teriore definitiva conferma di come l’ani- male non fosse affetto da LCan e che la positività ad IFAT riscontrata fosse solo espressione della presenza di anticorpi evocati dalla stimolazione antigenica vacci- nale.

Conclusioni Ripercorrendo la storia di Chace è mol- to probabile che il titolo IFAT di 1/320 riscontrato alla prima visita condotta ad agosto fosse la conse- guenza del booster vaccinale effet- tuato a febbraio: in corrispondenza della vaccinazione, infatti, si assiste ad una moderata produzione anti- corpale rilevabile dall’IFAT che in genere si attesta su titoli medio- bassi (≥ 1/40 e ≤ 1/320) e che rag- giunge il picco intorno al 4° mese post-inoculazione subendo poi una progressiva diminuzione che comun- que tende a mantenere il test IFAT positi- vo (≥ 1/40-1/80).

Il caso presentato sottolinea l’importanza di includere nella lista di domande utili alla raccolta anamnestica anche uno specifico riferimento alla profilassi vaccinale per Leishmania e di annotare l’esecuzione di ta- le misura profilattica nel libretto di ciascun animale, così da poter utilizzare gli adeguati test laboratoristici disponibili e non incor- rere in complicati “rebus” diagnostici. 22 Virbacnews n° 7 - Speciale leishmaniosi - novembre 2017 Animali da compagnia Malattie parassitarie VIRBAC NEWS 7.qxp_VIRBAC NEWS 7 10/11/17 12:26 Pagina 22

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