Clonazione e cellule staminali

Clonazione
        e
cellule staminali

Cellule staminali embrionali

Processo normale:
lo spermatozoo feconda una cellula uovo creando una singola cellula che
ha la potenzialità di formare un organismo intero

La cellula dopo la fecondazione è totipotente: la sua capacità di diventare
qualsiasi tipo di cellula è totale e tale rimane per le prime ore/divisioni

Dopo 4 giorni, queste cellule totipotenti formano una blastocisti (una sfera
cava) costituita da uno strato di cellule esterno (da cui si svilupperà la
placenta) e dalle cellule interne (che daranno origine a tutte le altre cellule
del corpo umano).

Cellule staminali embrionali (2)
•   Le cellule interne della blastocisti sono pluripotenti : esse danno origine a molti tipi
    cellulari.

•   Le cellule pluripotenti vanno incontro ad una ulteriore specializzazione in cellule
    staminali multipotenti: (es. Una cellula multipotente del sangue può dar origine a
    tutti i differenti tipi di cellule del sangue; una cellula multipotente della pelle può
    produrre tutti i diversi tipi cellulari della pelle; etc)

Cellule staminali embrionali (3)

Al momento vi sono due metodi per ottenere cellule multipotenti: dalla
 massa di cellule interne allo stadio di blastocisti; e da tessuti fetali da
gravidanze interrotte (in particolare dalla regione del feto destinata a
                   dar origine ai testicoli o alle ovaie)

Cellule staminali embrionali

                                      Embrione

                           Cellule staminali
                           Cresciute su
Il differenziamento
diretto da fattori di      Fibroblasti embrionali di
crescita e di              topo irradiati
differenziamento (ancora
non conosciuti)

   Osso, Pelle, Muscolo, Nervi, etc.

Cellule staminali embrionali (4)

• Le cellule dalla massa interna della blastocisti forniscono
  una cultura di cellule prluripotenti o multipotenti per usi
  futuri;

• Terapia cellulare: il problema principale è il rigetto da
  parte del sistema immune del paziente se le cellule
  staminali utilizzate derivano da un donatore eterologo
  (spesso non conosciuto).

Cellule staminali adulte (1)

• Nell’adulto sono presenti cellule staminali multipotenti,
  anche se inizialmete si pensava che fossero troppo
  specializzate per essere pluripotenti

• Alcuni studi recenti hanno indicato che le cellule
  multipotenti dell’adulto in alcune condizioni possono avere
  la capacità di essere pluripotenti
  (es. Cellule staminali del midollo osseo nel ratto hanno
  generato cellule epatiche; cellule staminali neurali nei topi
  si sono sviluppate in cellule del sangue)

• Ancora non è chiara quale sia il rapporto tra
  pluripotenzialità e multipotenzialità per le cellule staminali
  dell’adulto

Cellule staminali adulte: possibili problemi

• Le cellule staminali dell’adulto, se non vengono conservate
  e devono essere ottenute quando ve ne è necessità, non
  possono essere utili;

• Le cellule staminali adulte sono infatti presenti in minime
  quantità;

• Le cellule staminali adulte potrebbero non avere inoltre le
  stesse capacità di proliferare delle cellule staminali più
  giovani.

Il dibattito

La ricerca sulle cellule staminali

Embrionali                 Adulte

      Quando inizia la vita?

Cellule staminali: altri problemi da risolvere…

• Hanno la capacità di essere mantenute senza differenziarsi,
  (problema: per quanto tempo?)
• Sembra che abbiano la potenzialità di svilupparsi per formare
  qualsiasi tessuto
  (problema: come è possibile controllare questo differenziamento?)

Produzione di cellule differenziate da cellule ES di topo in coltura

Obiettivi principali nello sviluppo delle terapie di
                  trapianto a partire da cellule ES

                         Cellule umane ES

          Stabilire colture pure di specifici tipi cellulari

                    Testare le funzioni fisiologiche

Dimostrare l’efficacia   Dimostrare la sicurezza       Testare metodi che
                                                       prevengono il rigetto

                            Trials nell’uomo

Che cosa è il clonaggio?

La duplicazione di un individuo; es. due gemelli identici

         Questo è detto clonaggio riproduttivo.

 Espansione di cellule, tessuti o organi con patrimonio
      genetico identico alla cellula di partenza

         Questo è detto clonaggio terapeutico.

Che cosa significa?

    Generalmente noi otteniamo il 50% del nostro
patrimonio genetico da un genitore e il 50% dall’altro

Nel clonaggio il 100% dell’informazione genetica deriva
                  da un unico individuo

                         può
                      produrre…

Strategia di base per il clonaggio degli organismi
• Rimuovere il nucleo di un oocita
  (problema: quale informazione epigenetica si perde?)

• Rimpiazzarlo con il nucleo di una cellula somatica
  dell’individuo da clonare
  (problema: può un nucleo somatico essere “riprogrammato” allo stato di
  gamete)

• Attivare lo sviluppo
  (problema: può un nucleo somatico supportare uno sviluppo di un
  organismo intero? O ha perso la sua totipotenza?)

• Trasferire la blastocisti nell’utero di una madre
  donatrice

CLONAZIONE

DOLLY

Curva di sopravvivenza: embrioni clonati

CLONAZIONE TERAPEUTICA

      Si esegue come il clonaggio riproduttivo, ma
              l’embrione non è impiantato

 Le cellule staminali vengono raccolte dall’embrione

Le cellule staminali sono utilizzate per generare vari tipi
di cellule e rimpiazzare cellule difettose dell’organismo
            (es.: morbo di Parkinson, diabete)

Clonaggio “terapeutico”:
derivazione di cellule staminali
    embrionali dal paziente

  Solter and Gearhart, Science 1999

Il trasferimento del nucleo da cellule somatiche
          (Somatic cell nuclear transfer-SCNT)

SCNT può essere utilizzato per prelevare qualsiasi cellula somatica
da un paziente e, usando un uovo donatore, sviluppare una blastocisti

           Solter and Gearhart, Science 1999

CLONAZIONE TERAPEUTICA:
             è tecnicamente possibile…?(a)

Nel febbraio 2004 la prestigiosa rivista scientifica Science ha pubblicato un
lavoro condotto da ricercatori coreani che riportavano il primo esempio di
ottenimento di una linea di cellule staminali embrionali da cellule umane
clonate!

Utilizzando più di 200 cellule uovo ottenute da 16 donne volontarie i ricercatori
hanno descritto un protocollo per ottenere cellule staminali embrionali delle
stesse donatrici.

(Hwang et al, Science, 12 Febbraio 2004)

CLONAZIONE TERAPEUTICA:
                    è tecnicamente possibile…(b)
La linea cellulare ES sarebbe stata ottenuta inserendo il nucleo di una cellula
del cumulo (cellula somatica che si trova intorno agli oociti in via di
maturazione) in un oocita dal quale il nucleo è stato rimosso.

       Oocita
          e
 Cellula del cumulo

dello stesso individuo

 Con questa tecnica è possibile ottenere cellule staminali embrionali con gli stessi
                                 geni del paziente.
                          Non vi sono rischi di rigetto!

1: Science. 2004 Mar 12;303(5664):1669-74. Epub 2004 Feb 12.    Related Articles, Links

Erratum in:
*          Science. 2005 Dec 16;310(5755):1769.
Comment in:
*          Science. 2004 Apr 16;304(5669):388-9.
*          Science. 2004 Aug 13;305(5686):944-5; author reply 944-5.
*          Science. 2004 Mar 12;303(5664):1581.
*          Science. 2005 Dec 23;310(5756):1903.
*          Science. 2005 Dec 2;310(5753):1402-3.

Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned
blastocyst.
Hwang WS, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ,
Ahn C, Hwang JH, Park KY, Cibelli JB, Moon SY.

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) technology has recently been used to generate animals with a
common genetic composition. In this study, we report the derivation of a pluripotent embryonic stem
(ES) cell line (SCNT-hES-1) from a cloned human blastocyst. The SCNT-hES-1 cells displayed
typical ES cell morphology and cell surface markers and were capable of differentiating into embryoid
bodies in vitro and of forming teratomas in vivo containing cell derivatives from all three embryonic
germ layers in severe combined immunodeficient mice. After continuous proliferation for more than 70
passages, SCNT-hES-1 cells maintained normal karyotypes and were genetically identical to the somatic
nuclear donor cells. Although we cannot completely exclude the possibility that the cells had a
parthenogenetic origin, imprinting analyses support a SCNT origin of the derived human ES cells.

Reports
                               This article has been retracted

       Patient-Specific Embryonic Stem Cells Derived from Human SCNT
                                 Blastocysts
  Woo Suk Hwang,1,2* Sung Il Roh,3 Byeong Chun Lee,1 Sung Keun Kang,1 Dae Kee
 Kwon,1 Sue Kim,1 Sun Jong Kim,3 Sun Woo Park,1 Hee Sun Kwon,1 Chang Kyu Lee,2
 Jung Bok Lee,3 Jin Mee Kim,3 Curie Ahn,4 Sun Ha Paek,4 Sang Sik Chang,5 Jung Jin
 Koo,5 Hyun Soo Yoon,6 Jung Hye Hwang,6 Youn Young Hwang,6 Ye Soo Park,6 Sun
  Kyung Oh,4 Hee Sun Kim,4 Jong Hyuk Park,7 Shin Yong Moon,4 Gerald Schatten7*

Patient-specific, immune-matched human embryonic stem cells (hESCs) are anticipated to be
     of great biomedical importance for studies of disease and development and to advance
 clinical deliberations regarding stem cell transplantation. Eleven hESC lines were established
  by somatic cell nuclear transfer (SCNT) of skin cells from patients with disease or injury into
  donated oocytes. These lines, nuclear transfer (NT)–hESCs, grown on human feeders from
  the same NT donor or from genetically unrelated individuals, were established at high rates,
 regardless of NT donor sex or age. NT-hESCs were pluripotent, chromosomally normal, and
    matched the NT patient's DNA. The major histocompatibility complex identity of each NT-
    hESC when compared to the patient's own showed immunological compatibility, which is
important for eventual transplantation. With the generation of these NT-hESCs, evaluations of
  genetic and epigenetic stability can be made. Additional work remains to be done regarding
   the development of reliable directed differentiation and the elimination of remaining animal
   components. Before clinical use of these cells can occur, preclinical evidence is required to
   prove that transplantation of differentiated NT-hESCs can be safe, effective, and tolerated.
                                             Reports

Reports: "Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line
derived from a cloned blastocyst" by W. S. Hwang et al. (12 Mar. 2004,
p. 1669). Contrary to the statements in the second paragraph of text and
first paragraph of the supporting online material, which indicated that
there was no financial payment to oocyte and cumulus cell donors,
some oocyte donors were financially compensated for their donation
with a payment of approximately U.S. $1,400.

Originally published in Science Express on 12 January 2006
Science 20 January 2006:
Vol. 311. no. 5759, p. 335
DOI: 10.1126/science.1124926
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Letters
Retraction of Hwang et al., Science 308 (5729) 1777-1783. Retraction of Hwang et al.,
Science 303 (5664) 1669-1674.

Editorial Retraction
The final report from the investigation committee of Seoul National University (SNU) (1)
has concluded that the authors of two papers published in Science (2, 3) have engaged in
research misconduct and that the papers contain fabricated data. With regard to Hwang et
al., 2004 (2), the Investigation Committee reported that the data showing that DNA from
human embryonic stem cell line NT-1 is identical to that of the donor are invalid because
they are the result of fabrication, as is the evidence that NT-1 is a bona fide stem cell
line. Further, the committee found that the claim in Hwang et al., 2005 (3) that 11 patient-
specific embryonic stem cells line were derived from cloned blastocystsis based on fabricated
data. According to the report of the Investigation Committee, the laboratory "does not possess
patient-specific stem cell lines or any scientific basis for claiming to have created one."
Because the final report of the SNU investigation indicated that a significant amount of the data
presented in both papers is fabricated, the editors of Science feel that an immediate and
unconditional retraction of both papers is needed. We therefore retract these two papers and
advise the scientific community that the results reported in them are deemed to be invalid.

Potenziali usi del clonaggio
• Rimpiazzare organi o altri tessuti

•Salvare specie a rischio

•Infertilità (?)

•Creare un donatore (?)

•Rimpiazzare un figlio morto (?)

Problemi con il clonaggio
• Basso tasso di successo (per ottenere Dolly ci sono voluti 276 tentativi)

•Tumori

•Difetti genetici

•Difetti della crescita (Sindromi da crescita eccessiva)

•Invecchiamento precoce (età genetica)

•Richiesta di un grande quantitativo di oociti

•Ridotta adattabilità della specie (uniformità genetica)

…..Scarse conoscenze…