Progettazione di Peptidi antimicrobici per applicazioni innovative nel settore dell'industria alimentare - A.Anastasio - Innovation Village

Dr. G.Palmieri                                                A.Anastasio
                 Progettazione di Peptidi antimicrobici per
                    applicazioni innovative nel settore
                         dell’industria alimentare

Dr. Y.Proroga
                              Dr. F.Capuano

Dr. G.Palmieri
Dr. M.Gogliettino
Dr. M.Balestrieri
Dr. B.Agrillo                                       Prof. A.Anastasio
                                                    Prof. R. Marrone

              Dr. L. De Stefano

                                              Prof. A. Ianieri

                     Dr. F.Pomilio
                                                          Dr. R. Tatè

International Patent, (Application No. PCT/EP2018/069304
Publication Date: 16/07/2018). Antimicrobial peptides.

Italian Patent, (Application No. 102017000080068 Publication
date 14/07/2017) Peptidi antimicrobici.

Strategie di progettazione
              di nuovi AMPs                                                  Mitochondrial
                                                                           targeting peptide

Alcuni AMPs esplicano un effetto citotossico contro
cellule tumorali, causando un danno selettivo della
membrana mitocondriale. Poichè almeno il 5%
delle proteine della membrana mitocondriale sono
presenti anche nelle membrane batteriche, è stata
ottimizzata una strategia alternativa per
l’identificazione di nuovi peptidi antimicrobici
(MTP) usando come modello specifici domini di
proteine mitocondriali note

                                        Sono state inoltre progettati nuovi AMPs a
                                        partire da diverse sequenze di Catelicidine,
                                        piccole proteine naturali antimicrobiche che
                                        presentano un'ampia variabilità di struttura e
                                        che sono presenti nei granuli dei neutrofili. Le
                                        Catelicidine sono implicate nella risposta
                                        immune innata e rivestono un importante
                                        ruolo nella difesa dell'ospite

La capacità degli AMPs di non sviluppare resistenza è dovuta a diversi fattori:

   gli AMPs sono generalmente carichi positivamente ed interagiscono
    direttamente con le membrane cellulari batteriche cariche
    negativamente attraverso un legame di tipo elettrostatico. Tali molecole
    hanno dunque come target la membrana batterica la cui riprogettazione
    rappresenterebbe una soluzione energeticamente "costosa" per la
    maggior parte delle specie microbiche;

   gli AMPs utilizzano meccanismi multipli per attaccare i batteri target,
    aumentando la probabilità di successo e diminuendo la possibilità di
    sopravvivenza batterica;

    diverse evidenze sperimentali suggeriscono che gli AMPs agiscono
    anche attraverso il sistema immunitario innato e non soltanto mediante
    un’azione diretta sui batteri target, rendendo meno probabile un
    incremento della resistenza.

Le proprietà strutturali dei peptidi progettati evidenziate
    mediante tecniche spettroscopiche di Dicroismo
                 Circolare e Fluorescenza

    Elevata stabilità strutturale dei peptidi per almeno 24 h in un ampio
               range di temperatura (15-90 °C) e di pH (2-11).

 I peptidi si strutturano solo in presenza di soluzioni micellari di SDS che
 mimano la presenza della membrana batterica. In tutti gli altri è inattivo

Le proprietà funzionali : Attività battericida del
                 peptide antimicrobico
     I valori di EC50 verso tutti i batteri
 analizzati ricadono nel range 0.1-3 mM .
Il peptide risulta essere particolarmente
 efficiente verso Listeria monocytogenes

           Controllo    HCAT

       LM1 e LM2 appartengono al serotipo 4b che è considerato il principale
                    responsabile dei casi di listeriosi umana

Le proprietà funzionali:
                                                                Attività antibiofilm (inibizione
                                                                 della formazione) del peptide
                                                                antimicrobico contro biofilm di
                                                                        L. monocytogenes

La formazione di biofilm è stata osservata al SEM a 2 diversi
         livelli di ingrandimento, 1000× e 5000×.

Il trattamento con il peptide riduce significativamente
      la formazione di biofilm sia a 50 che a 25 µM.

Funzionalizzazione di PET commerciale con il peptide
                      antimicrobico
 tramite attivazione superficiale con plasma ad ossigeno

Prove preliminari di attività antimicrobica ed antimuffa su
            prodotti carnei e lattiero-caseari

Le proprietà strutturali e funzionali:
               la stabilità e l’attività dei peptidi in forma legata

 E’ stata sviluppata una strategia sperimentale per la modifica covalente di superfici
  polimeriche (un esempio è dato dal PET) tramite plasma freddo a radio frequenza con il
  peptide antimicrobico

 Tale trattamento ha consentito di ottenere polimeri funzionalizzati che hanno mostrato
  una significativa attività antimicrobica, antifungina ed antimuffa

 Attraverso tale procedura è stata ottenuta una buona resa di immobilizzazione del peptide

 Il sistema si è rivelato altamente stabile in diverse condizioni ambientali con una totale
  assenza di rilascio dei peptide dal polimero

                                                                           AMiBP2
                                                                          Pep2
                                                       Pep2

Schema di processo per la modifica della superficie di PET ed aggancio del peptide
                                 antimicrobico

Rappresentazione schematica del protocollo sperimentale adottato per la
             funzionalizzazione dei frammenti di SMPET

Funzionalizzazione di nanoparticelle metalliche con il peptide
antimicrobico tramite attivazione superficiale con plasma ad
                          ossigeno

 Prove preliminari di attività antimicrobica ed antimuffa su
             prodotti carnei e lattiero-caseari

Nell’ultimo decennio le nanoparticelle sono state oggetto di un crescente interesse
per le svariate applicazioni biotecnologiche, dovuto alle loro uniche proprietà

Attività fungicida (lieviti e muffe) di PET-peptide su campioni di carne

                    Controllo                                  PET-pepetide
                  Lieviti e muffe                              Lieviti e muffe

            PET funzionalizzato al terzo utilizzo, effetti contro lieviti e muffe a 6 giorni di
      trattamento. Matrice: carne (10 g di campione di carne presi da entrambe le superfici, a
                                   contatto e non con il polimero)

I POSSIBILI VANTAGGI ….
 Peptide di origine naturale, potenzialmente non tossico la cui attività si
  manifesta solo in presenza del batterio patogeno;

 Peptide con elevata stabilità e resistenza in diverse condizioni di pH e
  temperatura;

 Possibilità di utilizzo per funzionalizzare
  materiali come dimostrato nel caso delle nanoparticelle d’oro che presentano
  una grande versatilità ed possibilità di impiego in svariati campi di
  applicazione grazie alle loro uniche proprietà; in particolare si sono
  dimostrati essere un ottimo strumento per applicazioni nel campo della
  biomedicina ed in diversi altri settori quali quello della disinfezione e/o
  sanitizzazione

 Ampio spettro di attività: è attivo
contro diversi batteri Gram+ e Gram-;

 Potenzialmente efficace
verso batteri antibiotico-resistenti.

Alcune Pubblicazioni

 G. Palmieri, M. Balestrieri, F. Capuano, Y.T.R. Proroga, F. Pomilio, P. Centorame, A. Riccio, R. Marrone, A. Anastasio. Bactericidal and
  antibiofilm activity of bactenecin-derivative peptides against the food-pathogen Listeria monocytogenes: New perspectives for
  food processing industry (2018) Int J. Food Microbiol 279, 33-42
 L. Falcigno, G. Palmieri, M. Balestrieri, Y. T.R. Proroga, A. Facchiano, A. Riccio, F. Capuano, R. Marrone, G. Campanile, A. Anastasio.
  NMR and computational data of two novel antimicrobial peptides. Data in Brief (2016). 8, 562–569
 G. Palmieri, M. Balestrieri, Y.T.R. Proroga, L. Falcigno, A. Facchiano, A. Riccio, F. Capuano, R. Marrone, G. Neglia, A. Anastasio. New
  antimicrobial peptides against foodborne pathogens: From in silico design to experimental evidence. Food Chemistry (2016). 211,
  546-554
 F.P Nocera, A Riccio, G Palmieri, Y Proroga, A Balestrieri, L Falcigno, FP Di Nocera, A Anastasio. Structural characterization and
  antimicrobial activity of innovative compounds: a novel strategy for in silico peptides design (2015), Amino Acids 47, 1645
 A. Riccio, L. De Martino, M. Balestrieri, R. Marrone, G. Iovane A. Anastasio New synthetic cathelicidin peptides with anti-microbial
  activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus . (S. Marzocco, L. Severino, S. Adesso, A. Ariano, L. Neglia, A. Anastasio
  Safety assessment of two antimicrobial peptides with food industry potential application: in vitro study (2015) Amino Acids 47,
  1652