MICETI: CARATTERI GENERALI - GIOVANNI DI BONAVENTURA, PHD CI "MICROBIOLOGIA E MICROBIOLOGIA CLINICA" CDS MEDICINA E CHIRURGIA UNIVERSITÀ "G ...

Miceti: caratteri generali

Giovanni Di Bonaventura, PhD

CI “Microbiologia e Microbiologia Clinica”
CdS Medicina e Chirurgia
Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara
AA 2019-2020

Funghi

•   Inizialmente classificati nel Regno Plantae, i funghi o miceti (mykes = fungo)
    costituiscono uno dei cinque Regni del mondo vivente (Monera, Protista, Fungi,
    Plantae, Animalia)
•   Eucarioti, non contengono clorofilla, producono spore e strutture filamentose
•   Parete cellulare a composizione peculiare (glucano, chitina)
•   Distribuzione ubiquitaria (suolo, acqua, aria)
•   Aerobi obbligati o facoltativi
•   Importante ruolo nel ciclo energetico C-N:
     – saprofiti: decompongono il materiale organico non vitale in nutrienti
         inorganici solubili
     – eterotrofi: utilizzano composti di carbonio organico per la nutrizione
     – rilasciano enzimi nel substrato, lo digeriscono e ne assumono i nutrienti
•   Elevato grado di adattamento all’ospite e scarsa virulenza: delle oltre 100.000
    specie fungine note, poco meno di 500 sono patogene per l’uomo

Funghi: struttura cellulare eucariotica
•   Dimensioni:
     –   10-15 m (vs batteri: 0.8-5 m)
•   Organizzazione: unicellulare o pluricellulare
•   Assenza di strutture per la locomozione
•   Assenza di capsula:
     –   ad eccezione di Cryptococcus neoformans
•   Parete cellulare:
     –   maggiormente ispessita e rigida (vs parete batterica)
     –   assenza di peptidoglicano e acidi teicoici (insensibili ai -lattamici)
     –   polisaccaridi (75%; chitina, glucano) + proteine (20%) + lipidi (5%)
     –   presenza di melanina (in funghi “dematiacei”)
•   Membrana cellulare:
     –   presenza di steroli (vs membrana batterica, tranne che in
         Mycoplasma) a funzione “stabilizzante”
•   In sede citoplasmatica, presenza di:
     –   nucleo ben definito
     –   sistemi di membrane (reticolo endoplasmico, mitocondri)
     –   ribosomi 80S
•   Disponibilità di pochi fattori di virulenza (vs batteri)

Funghi: morfologia

• Lieviti: organizzazione unicellulare

• Funghi filamentosi (ifomiceti o muffe): organizzazione
  pluricellulare

Funghi dimorfici (crescono come lieviti o muffe
a seconda delle condizioni ambientali):
   - lieviti (37°C; in vivo, nell’ospite)
   - muffe (25°C; in vitro, nell’ambiente)

Lieviti
•   Unicellulari
•   Sferici, ellissoidali (ovalari)
•   Dimensioni: 4-5 (fino a 20) m
•   Riproduzione:                             lievito con evidente
                                              solco cicatriziale
     – Gemmazione (+ frequente)
         • gemma (cicatrice di gemmazione)
                                                                                         gemmazione
         • pseudoifa (se cellule figlie rimangono in contatto)
     – Fissione binaria
         • una cellula madre si divide in due cellule figlie
         • simile a quella batterica
     – Sporulazione
         • asessuata (avviene ripetutamente; importante per la                                  pseudoifa
            riproduzione e propagazione della specie)
         • sessuata (rara)
•   Colonie (su terreno agarizzato):
     – grandi (1-3 mm), margine regolare, color crema

                                                                     Candida: colonie su agar

Funghi filamentosi
    (muffe)

•   Multicellulari
•   Composti da ife
     – strutture filamentose e tubuliformi (l: 5-50 m; d: 2-10 m)

•   Le ife possono essere suddivise in compartimenti per la presenza di pareti
    trasversali porose (setti):
     – ife settate (almeno 1 nucleo per compartimento)
     – ife asettate o cenocitiche (nuclei liberi nel protoplasma)

Funghi filamentosi
   (muffe)
L’accrescimento e la ramificazione delle ife
formano il micelio, organizzato in:

  parte vegetativa (ife vegetative o ife substrato,   reproductive
   anucleate, localizzate sul/nel substrato per        structure
   ottenerne i nutrienti)
  parte riproduttiva (ife aeree, parte cotonosa
   delle muffe) ad accrescimento apicale

                                                       vegetative
                                                       structure

            Accrescimento apicale

Modalità di riproduzione
Ogni elemento di disseminazione che proviene dalla riproduzione sessuata
   od asessuata prende il nome di spora, importante elemento
   tassonomico per l’identificazione dei miceti.

La riproduzione avviene attraverso:
    1. il trasporto di frammenti del tallo (corpo vegetativo)
    2. la formazione di organi specializzati (spore) destinati alla:
         – riproduzione vegetativa (asessuata), mediante produzione di spore
           asessuate
         – riproduzione sessuata, mediante organi maschili e femminili che
           formano spore sessuate

Nel ciclo vitale di un fungo, le due modalità di riproduzione, sessuata ed
   asessuata, possono essere presenti entrambe, escludersi od
   alternarsi.

Funghi – riproduzione
       Sporulazione asessuata
Nei Funghi Imperfetti (Deuteromiceti) è l’unico tipo di sporulazione nota; quella
sessuata (stato “perfetto”) manca oppure non è, ad oggi, ancora conosciuta.

•      Produzione di spore asessuate (mitospore):
        – in strutture specializzate derivanti dalle ife:
            • conidi (prodotte dai conidiofori; es. Penicillium)
            • sporangiospore (prodotte nello sporangio sacculiforme; es. Zygomycetes)

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    Penicillium: 1. Conidiospore; 2. Fialidi; 3.   Zygomycetes: 1. Sporangio; 2. Sporangioforo;
    Vescicola; 4. Conidioforo; 5. Ife settate      3. Endospore; 4. Ife non settate; 5. Rizoidi

Riproduzione asessuata
Penicillium spp.

Funghi – riproduzione
     Sporulazione asessuata
•    Produzione di spore asessuate (mitospore):
      – per   modificazione delle ife (tallospore):
          •   Artrospore (cilindriche, a parete spessa, prodotte per frammentazione dell’ifa)
          •   Clamidospore (a parete ispessita, prodotte dal rigonfiamento di un tratto ifale)
          •   Blastospore (prodotte per gemmazione di una cellula parentale, possibile
              formazione di pseudoife)

    artrospore
                                   clamidospore
                                                                   blastospore

Funghi – riproduzione
 Sporulazione sessuata
• Chiamata anche “stato perfetto”
• Ambientale (raramente presente nell’ospite od in vitro)               oospore
• Plasmogamia + cariogamia + meiosi
• Produzione di spore sessuali:
    – Oospore: derivano dalla fecondazione di una struttura femminile
      (oogonio) da parte di una cellula maschile (anteridio)
    – Zigospore: fecondazione eterotallica ifa+/ifa- a formare una singola
      spora a parete spessa
    – Ascospore: formate all’interno dell’asco, racchiuso in un corpo
      fruttifero o ascocarpo, variabile per forma e dimensione                zigospore
    – Basidiospore: formate nella parte finale di una struttura chiamata
      basidio; tipiche dei funghi eduli e di grosse dimensioni

                             basidiospore                          ascospore

Riproduzione asessuata/sessuata
Zygomycetes

Classificazione esemplificativa
   dei principali patogeni fungini

Suddivisione in 4 phyla (divisioni) sulla base delle differenze nelle strutture
   riproduttive:

• Ascomycota – riproduzione sessuata mediante ascospore
    • comprende la maggior parte dei funghi di rilevanza clinica: Candida albicans,
     Histoplasma capsulatum, Pneumocystis carinii, Blastomyces
• Funghi mitosporici (già Deuteromycota o Funghi Imperfetti) – riproduzione
  asessuata mediante conidi; (riproduzione sessuata ignota)
    • Aspergillus, Fusarium, Tricophyton, Scedosporium, Candida
• Basidiomycota – riproduzione sessuata mediante basidiospore
    • Cryptococcus, Malassezia
• Zygomycota – riproduzione sessuata mediante zigospore; riproduzione
  asessuata mediante sporangiospore
    • Rhizopus, Mucor, Rhizomucor

Malattie causate da Funghi

1. Malattie da Ipersensibilità
      – Reazione allergica a spore e muffe:
          • a seguito di protratta esposizione a spore
          • polmonite da ipersensibilità (rinite, asma bronchiale, alveolite)
2. Micotossicosi
      – Intossicazione a seguito di ingestione di funghi che producono
        tossine (metaboliti secondari):
          • alcaloidi dell’ergotammina (vasocostrizione con necrosi e gangrena;
            ossitocici)
          • aflatossine (metaboliti bisfuranocumarinici prodotti da Aspergillus
            flavus): potenti cancerogeni nell’animale (uomo ?)
3. Infezione

Infezione fungina

Nonostante la diffusione praticamente ubiquitaria dei funghi (oltre 100.000
specie note), soltanto in alcune situazioni essi causano una infezione (500
specie nell’immunocompromesso, 100 specie in soggetti «normali»).

Nel determinismo di una infezione fungina giocano un ruolo critico:
  1. Resistenza (o sensibilità) dell’ospite
  2. Dimensioni dell’inoculo
  3. Virulenza fungina

“Resistenza” naturale all’infezione
   La maggior parte delle infezioni fungine viene contratta da sorgenti
    esogene/ambientali. In teoria, tutti i funghi patogeni per l’uomo vivono
    nell’ambiente con una diffusione ubiquitaria (suolo, acqua, aria)

   Pochi i patogeni “franchi”; sono per lo più “opportunisti”. I funghi
    patogeni generalmente mostrano un basso potenziale patogeno, poiché gran
    parte dei soggetti possiede una elevata resistenza all’infezione:
      immunità cellulo-mediata (fagociti, neutrofili, macrofagi alveolari)
      immunità umorale: ruolo minore (opsonizzazione fungina)
      cute: integrità, pH, turnover epiteliale, flora batterica commensale,
        contenuto in acidi grassi
      le superfici mucose ostacolano la colonizzazione fungina
      fattori umorali (transferrina) limitano la crescita fungina

“Sensibilità” all’infezione
•   Principali fattori di rischio:
     – Alterata (ridotta) risposta immune dell’ospite dovuta a:
          • patologie preesistenti (diabete mellito scompensato, AIDS)
          • iatrogena (terapia citotossica, radioterapica, steroidea,
            immunosoppressiva)
     – Interruzione della continuità del tegumento (ustioni, lesioni da oggetti
        taglienti)
     – Presenza di substrati abiotici colonizzabili (impianti protesici)
     – Alterazioni della normale flora batterica residente (intestinale,
        vaginale) secondarie a terapia antibiotica a spettro esteso

Virulenza fungina
1. Capacità di sopravvivere nei tessuti
    • Dimorfismo muffa-lievito (Histoplasma spp, Coccidioides spp,
      Blastomyces spp, Sporothrix spp) e dimorfismo lievito-pseudoifa
      (Candida spp): maggiore predisposizione alla disseminazione ematica
      (lievito) e/o alla diffusione nei tessuti (muffe)
2. Capacità di contrastare le difese dell’ospite
    •   Sopravvivenza intrafagocitaria (resistenza a radicali tox O2),
        neutralizzando l’azione degli enzimi lisosomiali (C. immitis,
        H. capsulatum)
    •   Protezione da specie reattive dell’ossigeno (ROS) (produzione del
        pigmento melanina in C. neoformans e A. fumigatus)
    •   Interferenza sulla fagocitosi (capsula polisaccaridica in C. neoformans)
3. Produzione di tossine ed enzimi
    • Rilascio di cheratinasi (Dermatofiti), fosfolipasi (C. albicans)
4. Termotolleranza (22-35°C)

VIE DI INGRESSO
                                        BOCCA
                     VIE RESPIRATORIE
                                                OCCHIO
• Inalazione
(istoplasmosi,
coccidiomicosi, aspergillosi)
• Ingestione
(funghi eduli)
• Transcutanea
(sporotricosi)
• Virulentazione di funghi                          CUTE
saprofiti sulle superfici
muco-cutanee a seguito di
dismicrobismo (candidosi)

                  VIE UROGENITALI

                                        ANO

COLONIZZAZIONE
                                   BOCCA
               VIE RESPIRATORIE
                                           OCCHIO

Il fungo divide ad un dato
sito anatomico senza
arrecare danno all’ospite

                                               CUTE

                 VIE UROGENITALI

                                   ANO

INFEZIONE
                                    BOCCA
                 VIE RESPIRATORIE
                                            OCCHIO

Invasione e moltiplicazione
del fungo nel tessuto
dell’ospite con produzione
di un danno cellulare
locale (almeno inizialmente)
                                                CUTE

                  VIE UROGENITALI

                                    ANO

Classificazione delle principali micosi
– Micosi superficiali (Malassezia furfur, Trichosporon spp)
    • limitate allo strato esterno di cute e capelli (di cui i funghi si nutrono)
– Micosi cutanee (dermatofiti: Microsporum spp; non dermatofiti: Candida spp)
    • invadono in profondità epidermide e annessi cutanei (unghia, capelli)
– Micosi subcutanee (Sporothrix shenckii)
    • infezioni del derma, tessuto sottocutaneo, muscolo e fasce
– Micosi sistemiche (Histoplasma, Coccidioides, Blastomyces)
    • inizialmente limitate al polmone (ma anche seni paranasali, tratto
      enterico), successivamente possono diffondere ad altri organi
– Micosi opportunistiche (Aspergillus, Candida, Cryptococcus)
    • causate da funghi che sono patogeni soltanto nell’ospite
      immunocompromesso

Micosi - classificazione

Le infezioni micotiche NON sono contagiose.

La maggior parte dei patogeni fungini è saprofita del suolo e le relative
   infezioni non sono quindi generalmente trasmissibili tra individui
         (fatta eccezione per Candida e qualche dermatofita).

  Gli episodi epidemici (outbreaks) sono causati da una esposizione
      ambientale comune piuttosto che dovuti alla trasmissibilità.

Farmaci antifungini
Uno dei primi chemioterapici (iodio orale) venne usato come antimicotico già nel
1903; tuttavia, lo sviluppo di molecole per il trattamento di infezioni fungine è
stato fortemente limitato (a causa di):

   Ridotta efficacia terapeutica (vs infezioni batteriche) per:
    – scarsa tossicità selettiva in quanto i target cellulari terapeutici hanno struttura
      simile rispetto a quelli della cellula «ospite»: presenza di steroli sia nella cellula
      ospite (colesterolo) che in quella fungina (ergosterolo)
    – la maggior parte dei funghi è in grado di detossificare, modificando (per
      idrossilazione) la struttura dell’antifungino
    – limitato investimento in R&S di nuove molecole, soprattutto a causa della minore
      prevalenza delle infezioni micotiche rispetto a quelle batteriche
   La frequenza delle infezioni fungine è aumentata solo recentemente
    a causa di:
     - aumentato numero di pazienti “a rischio” per le infezioni micotiche
     - aumentata consapevolezza, laboratoristica e clinica
     - impiego di procedure diagnostiche/chirurgiche invasive (protesi, cateteri)
     - aumentato consumo di farmaci e malattie immunosoppressive

Farmaci antifungini
Le molecole ad attività antifungina possono agire a differenti livelli:
  • inibizione della sintesi di parete cellulare (echinocandine)
  • alterazione della funzionalità di membrana (polieni)
  • inibizione della sintesi di membrana (azoli)
  • inibizione della sintesi di acidi nucleici (analoghi nucleosidici)
  • alterata formazione di microtubuli (griseofulvina)

Farmaci antifungini
Echinocandine
•   Metaboliti di Penicillium griseofulvum
•   Caspofungina, anidulafungina, micafungina
•   Fungicidi: inibiscono la sintesi di β-glucani (glicano-sintasi), componenti
    caratteristici di parete cellulare, aumentando la permeabilità parietale
•   Somministrazione e.v., bassa tossicità
•   Utilizzate in associazione con altri farmaci per il trattamento di infezioni
    sistemiche da Aspergillus, Candida spp. e Pneumocystis jirovecii in
    soggetti immmunocompromessi

Farmaci antifungini
Polieni
•   Metaboliti secondari di Streptomyces spp
•   Macrolidi lattonici ciclici: amfotericina B, nistatina

•   Fungicidi: legano gli steroli di membrana, danneggiandola
•   Scarsa tossicità selettiva: nefrotossicità, febbre, anemia
•   Amfotericina B, maggiore affinità vs. cellula fungina
    (ergosterolo) nella cui membrana forma dei pori che ne
    aumentano la permeabilità con effetto dose-dipendente.
    Principale opzione terapeutica (i.v.) per le infezioni
    sistemiche.
•   Nistatina, analogo strutturale di amfotericina B,
    impiegata per il trattamento topico di candidosi
    orofaringee (mughetto), vaginali (vaginiti) e
    mucocutanee

Farmaci antifungini
Derivati azolici                                      imidazolo      fluconazolo

•   Maggior gruppo di antifungini disponibile in commercio
•   Scarsa tossicità
•   Fungistatici. Danno di membrana: blocco della sintesi di ergosterolo per
    inibizione della demetilazione 14- del suo precursore (24-metilene
    diidrolanosterolo) ad opera di una C-14- demetilasi
•   Imidazoli (due atomi di N nell’anello azolico):
     – miconazolo, econazolo, ketoconazolo
•   Triazoli (tre atomi di N nell’anello azolico):
     – fluconazolo, itraconazolo
•   Somministrati per via orale per profilassi e nel
    trattamento di candidiasi muco-cutanee, dermatofiti
    ed alcune infezioni sistemiche
    (meningite criptococcica e da coccidioidi)

Farmaci antifungini
Analoghi nucleosidici
• 5-fluorocitosina (pirimidina fluorata polare)
• Fungistatico
• Pro-farmaco antimetabolita: penetrato nella cellula
  fungina (permeasi), viene convertito in acido 5-
  fluorouracile (forma attiva), quindi incorporato nel DNA
  (al posto dell’uracile) bloccandone la sintesi
• Somministrata per i.v., è farmaco di elezione per
  meningite fungina (attraversa la barriera emato-
  encefalica e -liquorale) ed altre infezioni sistemiche da
  Candida, Aspergillus e Cryptococcus neoformans
• Azione sinergica con amfotericina B (che aumenta la
  permeabilità cellulare)
• Rilevante tossicità (epatica, nausea, diarrea, anemia
  aplastica) sebbene le cellule umane non abbiano
  l’enzima per l’attivazione del pro-farmaco
• Induce rapidamente resistenza nei ceppi sensibili

Farmaci antifungini
Griseofulvina
•   Metabolita di Penicillium griseofulvum
•   Fungistatico, mediante differenti meccanismi di azione:
     – disgregazione del fuso mitotico durante la divisione
     – si concentra nello strato corneo dove forma una barriera in grado
       di bloccare la crescita e la penetrazione fungina
     – inibizione sintesi acidi nucleici
     – inibizione sintesi proteica
•   Somministrata per via orale, per il trattamento di gravi micosi cutanee
    ed ungueali (dermatofiti)

•   Effetti collaterali: cefalee, disturbi
    gastrointestinali, reazioni allergiche
•   Non attiva verso C. albicans ed altri agenti
    di infezioni sistemiche (probabilmente
    causato da un deficit di captazione)

Tests di sensibilità in vitro
•   E’ necessario valutare la sensibilità agli agenti antifungini per le stesse
    ragioni considerate nei tests di antibiotico-sensibilità:
     – definire una terapia mirata nei confronti dell’agente eziologico
     – predire l’outcome clinico associato alla terapia
     – monitorare l’emergenza di farmaco-resistenze
     – predire la efficaci di nuove molecole
•   Differenti metodiche: sia in fase liquida che solida, manuali (Kirby-Bauer,
    Epsilometer test, brodo-diluizione) ed automatizzate
•   Tuttavia, la predittività per la risposta clinica è limitata da una scarsa
    standardizzazione, particolarmente per gli azoli e la 5-fluorocitosina:
     – preparazione dell'inoculo (nel caso dei funghi filamentosi si associa anche la
       scelta delle strutture di fungo da studiare ovvero ife o conidi)
     – tipo di terreno da utilizzare
     – la durata dell'incubazione
     – i criteri di interpretazione
     – la riproducibilità e la corrispondenza dei dati in vitro con la risposta clinica

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