Infiammazione e tumore - Marco Ciró Dip. Oncologia Sperimentale IEO Via Adamello 16, MI

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Infiammazione e tumore - Marco Ciró Dip. Oncologia Sperimentale IEO Via Adamello 16, MI
infiammazione e tumore

   Marco Ciró marco.ciro@ieo.it
   Dip. Oncologia Sperimentale IEO
   Via Adamello 16, MI
Infiammazione e tumore - Marco Ciró Dip. Oncologia Sperimentale IEO Via Adamello 16, MI
Infiammazione e cancro
Introduzione
                Evidenze di legame infiammazione-cancro
                Perché infiammazione aumenta rischio tumore
       Via intrinseca/ Via Estrinseca
                Oncogeni e infiammazione
                Relazione infiammazione cancro: il caso di NF-kB
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Il cancro é una malattia causata da difetti nei
meccanismi cellulari di controllo della stabilitá del
genoma e e della proliferazione cellulare

Se infiammazione é in grado di stimolare lo sviluppo
del cancro, questo deve avvenire attraverso la
modulazione di tali meccanismi cellulari

Tra i vari pathway attivati durante infiammazione,
NF-kB ha un ruolo centrale sia nel controllo della
risposta infiammatoria che nello sviluppo del tumore.
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NF-kB
NF-kB é un fattore trascrizionale
rapidamente attivato in risposta a stress:
        Virus- batteri (esempio: LPS) -parassiti
        shear stress (fluido su superficie)
        UV-chemoterapia-stress ossidativo
        danno al DNA
        citochine infiammatorie (esempio: TNF, IL6)

Regola
-attivazione dei linfociti
-infiammazione
-inibisce apoptosi
-stimola crescita cellulare
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Le subunitá possiedono il dominio REL di legame al DNA
REL (la piú importante: REL-A o p65)
p50
p52, derivata da proteolisi di p100

Esiste come Etrodimero di due tipi:

REL/p50: pathway canonico               Regolazione risposta infiammatoria

REL/p52: pathway non canonico           Organi linfoidi e sviluppo B cell
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NF-kB pathway canonico

                       citoplasma                NF-kB inattivo

NF-kB ha segnali di localizzazione nucleare

IkBα lega NF-kB e lo trattiene nel citoplasma

Stimoloè il complesso IkB Chinasi (trimero IKK α,β,γ) inattiva IkBα

NF-kB entra nel nucleo

                          nucleo                 NF-kB attivo
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pathway canonico
              LPS           TNF             IL-1

Ionizing
radiation
               receptors
                                                                                                          Exterior

                                   1
  Unknown                                                                                                 Cytosol
                                                         3   p65 p50
 mechanism                  TAK1
                                                                                                       Poly-
                                                                 I-κB α                        4
     2b                2a                                                                              ubiquitin
                                                                  P   P
                                            p65 p50          E3 ligase                   p65
          α                                                                                    p50
                   γ
          β                                    I-κB α                                              α
            I-κB                           Sequestered                                     P       P
          kinase                              NF- κB                  Free NF- κB                         5
                                                                                                   Proteasomal
                                                                           p65 p50                 degradation
                                                             6                                     of I- κB α

                                       7                                    Nuclear-
 Induces transcription                       p65 p50                      localization
 of target genes                                                             signals

                        Nucleus
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Come inattivare NF-kB?

I-kB SR: mutante di IkB che non púo essere inattivato da fosforilazione:
= Super Repressore costitutivo
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Pathway non canonico
        (organogenesi linfoide - sviluppo B cell)

                                                p65 p100
α
    α                      p65 p100
                                                    P
IKKα                                                           NF-kB
                                                               p65 p52

                                                             Nuclear-
         Induces transcription        p65 p52              localization
         of target genes                                      signals

                          Nucleus
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Geni target
feedback loop:        IkB

proliferazione:       MYC, Ciclina D1

anti-apoptosi:        BCL2 family (bloccano BAX), cIAP (bloccano caspasi)

Infiammazione:

         citochine                      (e.g., IL-1, IL-6, TNF-a, IFN b, GM-CSF)
         chemochine                     (e.g., IL-8, MIP-1 , MCP1, RANTES, and eotaxin),
         molecole per adesione          (e.g., ICAM, VCAM, and E-selectin)
         effettori, stress ossidativo   (e.g., iNOS and COX-2).
         risposta immunitaria           (MHC proteins)
         proteasi                       (MMP9 proteins)
NFKB ha un ruolo sia in cellule infiammatorie che in
cellule tumorali
NFKB, infiammazione e cancro
Indizi:
NF-KB é fondamentale per il processo infiammatorio
NF-kB é un attivatore di geni anti apoptotici=oncogeni
Tumori umani presentano NF-kB costitutivamente attivato

validazione del ruolo di NF-kB in modelli murini
Epatite e carcinoma del fegato (HCC:hepatocellular carcinoma)
Carcinogenesi chimica e HCC
Hepatocellular Carcinoma (HCC)
High mortality rate due to late stage diagnosis
-resection and transplantation are mostly ineffective
-Commonly used drugs are mostly ineffective
-emergence of therapy resistance tumor

-associated with chronic Liver injury:
HBV infection, HCV infection, alcoholic cirrhosis.
NB HBV increase risk by 100 fold

                     Prevention!
L'epatite virale è un processo infiammatorio (acuto o
cronico), che provoca la morte (necrosi) delle cellule del
fegato (epatociti) a causa dell'attacco da parte di virus
epatotropi (HBV/HCV)
     Come risponde l’organo danneggiato?

              iperplasia controllata
fegato: capacitá rigenerante
                                iperplasia controllata
Gli epatociti si dividono raramente.
Tuttavia, possiedono la capacità di riprodursi in risposta a:
- fattori di crescita
- distruzione/asportazione di una parte del fegato stesso
Capacitá fondamentale dopo l'asportazione chirurgica o in seguito a lesioni (lesioni virali, tossiche o
ischemiche).

              la capacità di rigenerazione del fegato viene
              compromessa da danno eccessivo:
              - malattie croniche (epatite)
              - danni ripetuti (alcol: >50g/giorno/piú anni)

                              Conseguenza:
                              epatociti verranno sostituiti da tessuto
                              cicatriziale (fibrosi) fino a portare alla cirrosi epatica.
commento

Ripopolazione del fegato e cancro

Un ambiente ricco in stimoli proliferativi puó favorire la selezione di una
cellula “iniziata” (pre tumorale)
Infiammazione - tumore

            Colangite
          Infiammazione vie biliari

    Hepatocellular carcinoma
Topi MDR2-/-
                Modello murino di epatite
Malattie epatobiliari:
Gli epatociti secernono la bile nei canalicoli biliari, che sono spazi tra epatociti
adiacenti.
La bile é composta da acidi biliari e fosfolipidi.

MDR2: glicoproteina di membrana che media la secrezione dei fosfolipidi della
bile, famiglia degli ABC transporter.

Topi MDR2 -/- :
Un difetto nella secrezione della bile:
acidi biliari in assenza di fosfolipidi,che sono ritenuti negli epatociti, sono tossici e
causano danno delle membrane e epatite
→modello di malattia epatobiliare, é considerato un modello di malattia cronico
del fegato, precisamente di Colangite, cioé infiammazione delle vie biliari.

All’etá di 4 - 6 mesi i topi mdr2 (-/-) sviluppano foci di HCC.
Topi MDR2-/-
Modello murino di epatite
NF-kB e HCC in topi MDR2-/-
Sistema:
Topi MDR2 -/- sviluppano epatite e poi HCC a 6 mesi

Domanda:
quale ruolo per NF-kB?

Metodo:
Inattivazione di NF-kB nel fegato di topi MDR2-/-

Come?:
Attivazione specifica nel fegato di IkB super-repressor
NF-kB é attivato nei topi
       MDR2-/-

+/+              -/-            HCC from -/-

Immunoistochimica con antiNF-KB (p65)
Cosa succede se inattiviamo NF-kB?
       (attivando IkBSR con sistema TET-OFF)

In assenza di DOX, il gene é                           In presenza di DOX, il gene
acceso, ikBSR inattiva NF-kB                           é spento, NF-kB é attivo

                               IkBSR           IkBSR

        In presenza di DOX, il gene é spento, NF-kB é attivo
        In assenza di DOX, il gene é acceso, ikBSR inattiva NF-kB
IkBSR inibisce NF-kB nel fegato

 Staining nucleare di p65 é indice di attivitá di NF-kB:
 KO = MDR2-/-
 DM = MDR2-/-, IkBSR
Se inattiviamo NF-kB? (attivando IkBSR)
           meno HCC!

                                                      IkbSR spento
                                       IkbSR acceso
                             MDR2-/-

                                       MDR2-/-

                                                      MDR2-/-
In che modo NF-kB favorisce
     lo sviluppo di HCC
Una funzione di NF-kB é inibire apoptosi.

Ipotesi:
NF-kB favorisce HCC perché inibisce apoptosi
Se cosí fosse, IkBSR dovrebbe far diminuire HCC
perché aumenta il livello di apoptosi.

Quindi:
Qual é il livello di apoptosi in topi MDR2-/- rispetto a
topi MDR2-/- con NF-kB inattivato (da IkBSR)?
modello
MDR2-/-

 epatite     dox

 NF-kB      IkBSR

 apoptosi

 HCC
Inibizione di NF-kB (da parte di IkBSR) aumenta apoptosi e riduce
                          incidenza HCC

Se blocco TNF, blocco NF-KB: tolgo l’inibizione dell’apoptosi,
e apoptosi aumenta.
Quali geni target di Nf-kB?

Famiglia IAP:
legandosi alle caspasi (anche già attivate) ne
inibiscono l’attività enzimatica e ne promuovono
ubiquitinazione e degradazione
Quali cellule producono TNF e
 quali hanno NF-kB attivato?

NFkB   epatociti

       endotelio
TNF
       macrofagi
NFKB funziona sia
      in cellule
infiammatorie che in
   cellule tumorali
MODELLO di carcinogenesi
     chimica di HCC
NF-kB, cellule e citochine infiammatorie
Carcinogeni e HCC:
                          DEN
                     diethylnitrosamina

                                   DNA alkylation

Induzione HCC in topi adulti:
-Trattamento singolo DEN
       -Trattamento con promotore per 6 mesi
              -Comparsa HCC intorno ai 6-8 mesi

DEN                                            HCC
                       promotore
                                                     mesi
DANNO

HCC
DANNO

Ruolo NF-kB

  HCC
DEN

CELLULE NECROTICHE

  Attivazione macrofagi

          TLR

    Produzione di IL6

Stimolazione cell tumorali

          HCC
Trattamento con DEN induce proliferazione (ripopolamento)
nel fegato

Proliferazione in vivo é dipendente da NF-kB

                                   Wt
                                   NF-kB-/-

              Proliferazione misurata nel fegato come % di cellule positive alla BrdU
Il trattamento con DEN induce IL6
             Questa induzione dipende da NF-kB
                  WT                  NF-kB-/-

Immunoistochimica per IL6 su sezioni di fegato da topi wt o NF-kB -/-
Funzione di IL6 in HCC indotta da DEN:
     In assenza di IL6 si ha meno danno e meno risposta
     proliferativa (in vivo)

Danno misurato come rilascio       Proliferazione misurata nel fegato
di transaminasi (ALT)              come % di cellule positive alla BrdU
Esiste un effetto di genere

Alti livelli Estrogeni inibiscono rilascio di IL6 e proteggono da HCC
Funzione di IL6 in HCC indotta da DEN:
IL6 é richiesta per sviluppo del tumore
E quindi aumenta il survival se togliamo IL6
Quali sono le cellule responsabili del rilascio di IL6?
Kupffer celI (KC): i macrofagi residenti del fegato!
        KC isolate e trattate in piastra con LPS o frammenti necrotici:
        producono IL6 solo se la via di trasduzione del TLR4 é integra
NB: naturalmente fonte di “tissue damage” é anche epatite
conclusioni
Le cellule e i mediatori dell’infiammazione sono una
presenza importante dell’ambiente tumorale

Lo stato infiammatorio favorisce insorgenza e progressione
del tumore

- Infiammazione precede e favorisce l’insorgenza del tumore
- Attivazione oncogenica induce un’ambiente infiammatorio
che favorisce la tumorigenesi
Terapia anti-infiammatoria come terapia antitumorale

Farmaci antiinfiammatori possono avere sia azione
profilattica che terapeutica
riducono incidenza o rallentano la crescita tumorale:
Inibitori delle ciclo-ossigenasi (aspirina, inbitori di COX2) = riduzione
incidenza Colon Cancer, Breast cancer

Agire sull’infiammazione pro-tumorale: strategie.

¤Inibizione di dei pathway che mediano la crescita/sopravvivenza
delle cellule tumorali in risposta alle citochine infiammatorie
(inibizione di NFKB)
¤Sequestro delle citochine /chemochine/recettori che mantengono il
microambiente infiammatorio (antiIL6, anti TNF, anti CCR2)
¤modulare la risposta infiammatoria che segue la terapia
¤Eliminare cellule infiammatorie responsabili della progressione
tumorale, preservando le cellule responsabili della risposta
immunitaria
¤Inibizione selettiva di citochine pro-tumorali.
Gli enzimi COX-2 hanno favoriscono di tumorigenesi

         COX2             Prostaglandine                               Blocco apoptosi
AA                                                                     Migrazione
                                                                       Neoangiogenesi
                           Prostaciclina

ALti livelli di COX-2 sono presenti in tumori di diversa origine tissutale:
Breast, Prostate, Pancreas, SKin, LUng, Bladder, Heqad and NEck.

Inibitori di COX-2 sono stati studiati come trattamento anti-tumorale

MECCANISMO:
-COX-2 crea ambiente infiammatorio pro-tumorale
NSAID inibiendo COX-2 bloccano rilascio di metaboliti attivi di Acido Arachidonico.

Controindicazioni: vedi slide precedenti
Evidenze epidemiologiche che NSAID riducono rischio tumore

1983 prima osservazione:
regressione di polipi al retto in pazienti che assumono NSAID

2012: una serie di tre studi su ampia coorte di pazienti suggerisce uso di
Apsirina nel trattamento del tumore e prevenzione di metastasi.
utilizzo giornaliero di ASpirina:
- riduce il rischio di Colon Cancer
-riduce rischio di metastasi.
- riduce mortalitá

2015: rischio di effetti collaterali aumentano con etá dei pazienti

Trattamento e prevenzione dei tumori
Add-ASpirin Trial, 2015 - ongoing
" It will recruit 11,000 participants to help find out whether regular aspirin use
after treatment for an early stage cancer can prevent the cancer from coming
back and preventing death
“therapy induced inflammation”
                       Ulteriore livello di complessitá

Le principali opzioni terapeutiche è inducono infiammazione
sistemica o locale
Causa: danno tissutale o morte di cellule tumorali

Chirurgia -> danno tissutale /infezioni
Chemioterapia / Radioterapia -> induzione di necrosi
Puoi anche leggere