D-ROMs Test E - Eugenio Luigi Iorio

 
D-ROMs Test E - Eugenio Luigi Iorio
Eugenio Luigi Iorio

                                              d-ROMs
                                              Test
                      Prima Edizione – 2003

                                              E
                                              Stress
                                              Ossidativo

               DIACRON International
La struttura molecolare riportata in copertina è la formula chimica tridimensionale rielaborata al computer della N,N -
dietilparafenilendiammina, il substrato cromogeno del d-ROMs test (brevetto DIACRON International s. a. s., Grosseto, Italia
Prefazione

      Lo stress ossidativo costituisce un capitolo relativamente recente della biochimica che, probabilmente
per il suo carattere di “trasversalità” o “interdisciplinarietà”, non ha ancora trovato una sua adeguata e
soddisfacente collocazione in medicina.
      E’ noto, infatti, che un’accentuazione dei processi ossidativi, di cui è spesso espressione un’aumentata
produzione di radicali liberi, può accelerare il fisiologico processo dell’invecchiamento e risulta associata ad
almeno 50 patologie, dall’ictus cerebrale all’infarto del miocardio, dal diabete mellito all’obesità, dal morbo di
Parkinson alla malattia di Alzheimer, dal morbo di Crohn all’artrite reumatoide, dall’AIDS al cancro, e così
via.
      Tuttavia, al contrario di queste condizioni morbose, abbastanza ben definite sotto il profilo nosografico,
lo stress ossidativo non esibisce una propria sintomatologia, non dà luogo ad un vero e proprio quadro
clinico e, pertanto, al medico che non ne sospetta l’esistenza, non fornisce elementi tali da suggerire un
adeguato approfondimento diagnostico, laddove l’esecuzione di alcune semplici indagini di laboratorio
consentirebbe un immediato inquadramento del problema, evitando al paziente una serie di conseguenze
tali da comprometterne la durata e/o la qualità della vita già nel breve o medio termine.
      A rendere più complesso questo quadro – già di per sé poco confortante – c’è da aggiungere che se il
medico, per una serie di ragioni, non sempre è adeguatamente “informato” sull’argomento, l’analista di
laboratorio non è generalmente “attrezzato” per l’esecuzione di test miranti alla valutazione dello stress
ossidativo.
      E intanto – paradossalmente – terapisti, farmacisti, allenatori sportivi e persino estetisti continuano a
prescrivere e/o suggerire al soggetto potenzialmente a rischio di stress ossidativo l’assunzione di integratori
ad attività antiossidante. E non importa se quest’ultima sia reale o presunta.
       Infatti, secondo una prassi ormai consolidata, non è abitualmente prevista l’esecuzione preliminare di
test di laboratorio, pur disponibili per la routine clinica, per dimostrare – tramite l’identificazione e la
quantificazione nei fluidi extracellulari e/o nei tessuti di adeguati marker biochimici – la necessità oggettiva di
tali formulazioni.
      In altri termini, mentre è ormai acquisito che un farmaco ipocolesterolemizzante va assunto solo dopo
che un test abbia documentato inequivocabilmente una condizione di ipercolesterolemia, è diffusa la
tendenza all’uso di antiossidanti anche quando non è necessario, proprio perché non è ancora diventata
buona prassi eseguire preliminarmente una valutazione di laboratorio dello stress ossidativo.
      Lo scopo del presente lavoro è quello di fornire una serie di evidenze scientifiche – ormai consolidate
dalla letteratura biomedica – a sostegno del concetto che solo un’adeguata valutazione di laboratorio può
consentire l’identificazione e la definizione circostanziata di una condizione di stress ossidativo e rendere
possibile, quando indicato, il monitoraggio di un’eventuale terapia antiossidante.
      Il presente lavoro vuol essere un aiuto per il clinico ed i terapisti in genere, compresi i farmacisti ed i
biologi. Esso non ripropone come un testo esaustivo nel campo della medicina di laboratorio dello stress
ossidativo ma intende fornire semplicemente una breve panoramica riguardo ai più recenti progressi nella
valutazione del bilancio ossidativo. Il più interessante test qui discusso appare essere il d-ROMs test, che
consente la valutazione del livello sierico degli idroperossidi, marker ed amplificatori del danno ossidativo
tissutale. Finora sono stati pubblicati circa un centinaio di lavori, quasi a sottolineare la sua importanza nella
pratica clinica. A questo riguardo si ringraziano per l’aiuto tutti gli Autori degli studi clinici e sperimentali
riportati in questo volume e, in particolare, Mauro Carratelli, l’ “inventore” del d-ROMs test.

Grosseto, 6 marzo 2003                                            Dr Eugenio Luigi Iorio, MD, PhD
                                                                  Science Manager Diacron International

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Indice

                                                  Indice

Prefazione                                                                                     Pag. 3

Capitolo 1 Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno                                     pag. 5
           1. 1 Generalità e definizioni                                                       pag. 5
           1. 2 Meccanismi di produzione delle specie reattive nei viventi                     pag. 7
           1. 3 Metabolismo delle più importanti specie reattive di interesse biologico        pag. 11
           1. 4 Il sistema di difesa antiossidante                                             pag. 12

Capitolo 2 Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.                            pag. 14
           2. 1 Generalità e definizioni                                                       pag. 14
           2. 2 Basi biochimiche                                                               pag. 14
           2. 3 Eziopatogenesi                                                                 pag. 17
           2. 4 Stress ossidativo e invecchiamento                                             pag. 19
           2. 5 Stress ossidativo e malattie                                                   pag. 20

Capitolo 3 Il ruolo del laboratorio nella valutazione dello stress ossidativo. Una overview.   pag. 23

Capitolo 4 I test di laboratorio per la valutazione dello status ossidante                     pag. 25
           4. 1 Il d−ROMs test                                                                 pag. 25
           4. 2 Gli altri test                                                                 pag. 38

Capitolo 5 I test di laboratorio per la valutazione dello status antiossidante                 pag. 40
           5. 1 L’OXY−Adsorbent test                                                           pag. 40
           5. 2 Il BAP test                                                                    pag. 43
           5. 3 L’-SHp test                                                                    pag. 44

Capitolo 6 La strumentazione dedicata nella valutazione dello stress ossidativo                pag. 47
           6. 1 Il sistema FREE                                                                pag. 47
           6. 2 Il sistema FRAS                                                                pag. 48

Capitolo 7 Considerazioni conclusive e linee−guida                                             pag. 50

Capitolo 8 Selezione bibliografica                                                             pag. 53
           8. 1 Bibliografia generale per autore                                               pag. 53
           8. 2 Bibliografia per aree di interesse medico                                      pag. 59

                                                     4
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno

                                                                       Capitolo 1
                                                    Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno

                 1. 1 Generalità e definizioni                                                             ossidanti. Infatti, la durata stimata della sua
                                                                                                           esistenza è dell’ordine dei nanosecondi.
     I radicali liberi o, più semplicemente, radicali,                                                          Viceversa, il trifenilmetile [(C6H5)3–C*] è un
sono atomi o raggruppamenti di atomi aventi in uno                                                         radicale che, in opportune condizioni, può essere
degli orbitali esterni delle specie che li                                                                 persino isolato in soluzione, proprio per la sua
costituiscono uno o più elettroni spaiati,                                                                 relativa stabilità o inerzia chimica. Lo stesso
indipendentemente dalla carica elettrica espressa;                                                         radicale             catione        della          N,N-
per      esempio,       il   radicale  della    N,N-                                                       dietilparafenilendiammina,         appena        citato,
dietilparafenilendiammina, il substrato cromogeno                                                          costituisce un esempio di radicale relativamente
del d-ROMs test (vedi in seguito), è un classico                                                           stabile (figura 1. 1).
esempio di radicale catione, cioè carico                                                                        I radicali liberi vengono classificati sulla base
positivamente (figura 1. 1).                                                                               della natura dell’atomo al quale appartiene
                                                                                                           l’orbitale con l’elettrone spaiato. Esistono, quindi,
                                                                                                           radicali liberi centrati sull’ossigeno, sul carbonio,
                                                                                                           sull’azoto, o sul cloro, solo per citare quelli di più
            Ne                                      O                           O
                                                                                                H          immediato interesse in patologia umana.
                                                                                                                Nella presente trattazione, tuttavia, si farà
    Un atomo di Ne                       Un atomo di O                  Il radicale idrossile (*OH)
                                                                                                           riferimento prevalentemente ai radicali liberi
  Solo elettroni appaiati               Due elettroni spaiati                Un elettrone spaiato          centrati sull’ossigeno, noti più semplicemente come
    Atomo (stabile)                              Radicali liberi dell’ossigeno (instabili)
                                    CH 3-CH 2                                                              radicali liberi dell’ossigeno.
                                                              +
                                            N                 NH2
                                                                                                                Quest’ultimo, infatti, oltre ad essere uno degli
                                    CH 3-CH 2
                    Il radicale catione della N,N-dietilparafenilendiammina                                elementi quantitativamente più importanti della
                             (il substrato cromogeno del d-ROMs test)
                          Un esempio di radicale relativamente stabile                                     materia vivente, nonché la fonte primaria della vita
                                                                                                           stessa, attraverso una serie di meccanismi – non
                            Figura 1. 1 Atomi e radicali                                                   ultimo la stessa respirazione cellulare – induce
                                                                                                           continuamente la formazione di specie chimiche
     In funzione della distribuzione della carica                                                          con caratteristiche di reattività.
(nube elettronica) e/o del proprio potenziale di                                                                A tal riguardo, occorre sottolineare che i
ossido-riduzione, i radicali liberi presentano una                                                         radicali liberi dell’ossigeno rientrano nella più
reattività più o meno spiccata, legata alla tendenza                                                       grande famiglia delle specie reattive dell’ossigeno
spontanea ad esistere come entità aventi tutti gli                                                         (reactive oxygen species, ROS).
elettroni disposti in coppie, condizione che                                                                    Con questo termine si intende una classe di
corrisponde alla stabilità o inerzia chimica. Ne                                                           specie chimiche reattive derivate dall’ossigeno, di
deriva che non tutti i radicali sono ugualmente                                                            natura non necessariamente radicalica, tutte
reattivi. In genere, quanto più è elevato il rapporto                                                      accomunate dalla tendenza più o meno spiccata ad
fra carica e volume, tanto più un radicale libero è                                                        ossidare vari substrati organici (carboidrati, lipidi,
reattivo e, pertanto, tenderà a raggiungere la                                                             amminoacidi, proteine, nucleotidi, ecc.).
propria stabilità strappando elettroni a qualsiasi                                                              Classici esempi di ROS di natura radicalica
specie chimica con la quale viene a contatto,                                                              sono l’ossigeno singoletto e il radicale idrossile.
ossidandola (compatibilmente con il suo potenziale                                                         L’ozono ed il perossido di idrogeno, invece, sono
di ossido-riduzione) (figura 1. 2).                                                                        specie reattive non radicaliche dell’ossigeno.
                                                                                                                I radicali liberi, comunque centrati, possono
                                                                                                           essere generati attraverso diversi meccanismi e,
                                                                                                           una volta formati, danno luogo generalmente ad
                                                ossidazione                      Elettrone spaiato         una serie di reazioni a catena, nel corso delle quali
                                                                                                           il sito radicalico può essere trasferito o,
        A        +          C           C                       A       +        C            C            eventualmente, inattivato.
  Radicale libero        Molecola bersaglio             Nuova molecola          Nuovo radicale
                                                                                                                Si distinguono, pertanto, tre step nelle reazioni
   (ossidante)         (es. doppio legame C -C)         (ridotta, stabile)    (ossidato, instabile)
                                                                                                           radicaliche a catena: inizio, propagazione e termine
                                                                                                           (figura 1. 3).

        Figura 1. 2 I radicali liberi agiscono come ossidanti

     In tal senso, il radicale ossidrile (HO*) è uno
dei radicali liberi più instabili e, quindi, reattivi ed

                                                                                                       5
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno
                             Fotolisi/
                             pirolisi
                                                  Interazione con
                                                metalli di transizione
                                                                                      Scissione
                                                                                     di perossidi
                                                                                                              Scissione di
                                                                                                              azocomposti
                                                                                                                                    particolari molecole con alcuni metalli di transizione
                              A:B                           : OBFe                        : OR                RN : : NR
      Inizio                      +hν
                                                       AO            2+
                                                                                     RO
                                                                                           +hν                       – N2
                                                                                                                                    (figura 1. 5).
                                                                Fe 3+

                             A • + •B                 AO • + OB -                  RO• + •OR                    R • + •R

                          Trasferimento               Addizione                  Frammentazione            Ri-arrangiamento
                               A•                         R•                         R:C – C*=                R:C – C*=                                    Men+1      Men
                                                                                                                                                                                                                -
                                     R:H
Propagazione                                                CH2 =CH–

                                                                                           =C = C =
                                                                                                                                            A      B                               A           +        B
                                    A:H

                               R•                   R–CH 2 –CH* –                        R•                   =C* – C:R                     Molecola                         Radicale libero          Anione

                                    Combinazione                                          Disproporzione
                                         A• + • B
                                                                                                                                                               Men   Men+1
                                                                                         –C• – –C•–                                                                                                             +
                                                                                              +
     Termine                                                                             –C–    –C–                                        A       B                               A           +        B
                                                                                   – C=                      –C–
                                                                                                    +                                       Molecola                         Radicale libero          Catione
                                         A:B                                       – C=                      –C–

       Figura 1. 3 Schema delle reazioni radicaliche a catena
                                                                                                                                          Figura 1. 5 Interazione con metalli di transizione
     I principali meccanismi attraverso cui si
generano i radicali liberi – step 1, reazione di inizio                                                                                   Nell’interazione con i metalli di transizione,
– sono la scissione omolitica e l’interazione con i                                                                                 l’elettone generato dall’ossidazione di un metallo di
metalli di transizione.                                                                                                             transizione in forma ionica (es. da Fe2+ a Fe 3+ o da
     Con il termine di scissione omolitica si intende                                                                               Cu+ to Cu 2+) spezza un legame covalente di una
la divisione di una molecola a livello di uno dei suoi                                                                              molecola bersaglio, generando così un radicale
legami covalenti per effetto della somministrazione                                                                                 libero e un anione.
di energia (termica, pirolisi, o radiante, radiolisi)                                                                                     Alternativamente, l’elettrone richiesto per
con generazione        di   due       nuove    specie                                                                               ridurre un metallo di transizione in forma ionica (es.
chimiche, ciascuna con un elettrone spaiato,                                                                                        da Fe3+ a Fe 2+ o da Cu2+ to Cu +) viene estratto dal
elemento distintivo dei radicali liberi (figura 1. 4,                                                                               legame covalente di una molecola bersaglio, che si
A).                                                                                                                                 decompone in un radicale libero ed un catione.
                                                                                                                                          Attraverso questo meccanismo, per esempio,
                                                                                                                                    il ferro (Fe2+/Fe3+) o il rame (Cu +/Cu2+) agiscono da
 A                                                                                                                                  catalizzatori in una sequenza di reazioni di ossido-
               A     B                        Energia                            A             +               B
                                                                                                                                    riduzione generando radicali alcossilici (RO*) e
               Molecola                                                   Radicale libero 1             Radicale libero 2           perossilici (R–O–O*) a partire dai perossidi
                                                                                                                                    (R–O–O–R).
 B                                                                                        +                                -              Nel caso più semplice – descritto per la prima
               H     Cl                        Acqua                             H             +               Cl                   volta da Fenton – uno ione ferroso (Fe2+),
               Molecola                                                       Catione                       Anione
                                                                                                                                    ossidandosi a ione ferrico (Fe3+), cede il suo
                                                                                                                                    elettrone ad una molecola di perossido di idrogeno
                                                                                                                                    (H2O2) e ne scinde uno dei legami covalenti,
        Figura 1. 4 Scissione omolitica (A) e ionizzazione (B)                                                                      generando un radicale libero (il radicale idrossile,
                                                                                                                                    HO*) ed un anione (ione ossidrile).
     E’ bene sottolineare che la scissione omolitica                                                                                      A sua volta, lo ione ferrico (Fe3+) si riduce –
è ben diversa dalla ionizzazione che si osserva,                                                                                    rigenerandosi come qualsiasi catalizzatore – a
per esempio, dopo aver disciolto in acqua molecole                                                                                                     2+
                                                                                                                                    ione ferroso (Fe ), strappando un elettrone da una
aventi almeno un legame covalente polarizzato (es.                                                                                  seconda molecola di perossido di idrogeno, che è
HCl). In questo caso, le molecole d’acqua, a causa                                                                                  scissa in un radicale libero (un radicale peridrossile
della loro polarità e, dunque, senza alcuna                                                                                         (HOO*), e un catione (uno ione idrogeno, H+)
somministrazione di energia, riescono a spezzare                                                                                    (figura 1. 6).
uno dei legami covalenti polarizzati della molecola
di soluto generando due specie chimiche caricate
di segno opposto, un catione ed un anione (H+ e                                                                                                                                OH-
   -
Cl , rispettivamente, nell’esempio considerato)
                                                                                                                                                H-O-O-H                                        H-O*
(figura 1. 4, B).                                                                                                                              Perossido di                                Radicale
     E’ evidente che nella ionizzazione, al contrario                                                                                           idrogeno
                                                                                                                                                                 Fe2+        Fe3+          idrossile
della scissione omolitica, il doppietto elettronico di
legame della molecola originaria non viene                                                                                                       H-O-O*                                 H-O-O-H
separato ma resta come tale in una delle “neonate”                                                                                               Radicale                               Perossido di
                                                                                                                                                peridrossile                             idrogeno
specie ioniche (l’anione).                                                                                                                                       H+
     Un classico esempio di scissione omolitica è la
radiolisi o fotolisi dell’acqua che genera un atomo                                                                                     Figura 1. 6 Decomposizione del perossido di idrogeno
di idrogeno ed un radicale idrossile (vedi più
avanti).                                                                                                                                Allo stesso modo, anche gli idroperossidi sono
     Oltre che per scissione omolitica, i radicali liberi                                                                           scissi, per azione catalitica del ferro, in radicali
possono essere prodotti in seguito all’interazione di                                                                               alcossilici (RO*) e perossilici (ROO*) (figura 1. 7).

                                                                                                                                6
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno

                                                                                                 radicali liberi reagiscono tra loro dando luogo ad
                                                 OH-                                             una molecola non più reattiva (figura 1. 9).

                  R-O-O-H                                      R-O*
               Idroperossido                                Radicale
                                                            alcossile
                                       Fe2+    Fe3+

                  R-O-O*                                   H-O-O-H                                           R            +         R1                 R       R1
                   Radicale                               Idroperossido
               (idro)perossile                                                                        Radicale libero 1       Radicale libero 2          Nuova
                                       H+                                                               (ossidante)            (antiossidante )         molecola

              Figura 1. 7 Decomposizione degli idroperossidi

     In assenza di catalizzatori, la scissione dei                                                               Figura 1. 9 Reazione di combinazione
perossidi – che dà luogo ad un’unica specie
radicalica, quella alcossilica – può avvenire solo in                                                 Il primo radicale agisce come ossidante,
seguito a somministrazione di energia (figura 1. 3).                                             mentre il secondo si comporta come un generico
     Un’ultima modalità di formazione di radicali                                                antiossidante (vedi appresso).
liberi, tra quelle di maggiore rilevanza biologica, è                                                 Questo meccanismo viene sfruttato per
la decomposizione degli azocomposti, dalla quale                                                 bloccare una reazione radicalica e in generale, un
originano, per sottrazione di azoto molecolare (N2)                                              qualsiasi processo radicalico a catena può essere
radicali alchilici (figura 1. 3).                                                                interrotto grazie all’intervento di agenti denominati,
     Una volta innescata, una reazione radicalica a                                              genericamente antiossidanti.
catena tende a propagarsi (step 2).
     Si distinguono 4 meccanismi fondamentali di                                                          1. 2 Meccanismi di produzione
propagazione           delle     reazioni radicaliche:                                                    delle specie reattive nei viventi
trasferimento, addizione, frammentazione e
riarrangiamento.                                                                                     Negli organismi viventi i ROS sono generati nel
     Tra questi, il più comune nell’ambito delle                                                 corso della normale attività metabolica cellulare;
reazioni radicaliche è il trasferimento. In questa                                               alcuni   agenti   esogeni,      tuttavia, possono
modalità, il radicale libero – generato da una delle                                             incrementarne la produzione, anche con
precedenti reazioni di inizio – attacca una molecola                                             meccanismo diretto (figura 1. 10).
sottraendo ad essa uno dei suoi atomi
(generalmente un atomo di idrogeno). Il risultato
finale è la formazione di una nuova specie reattiva
e, in pratica, il trasferimento del sito radicalico                                                              Agenti                            Metabolismo
(figura 1. 8A).                                                                                                  esterni                            cellulare

                                                                                                                                      Produzione
A
                                                                                                                                        di ROS
          A       +        R           H             A         H       +         R

    Radicale libero        Molecola                    Nuova               Nuovo radicale
     (ossidante)           bersaglio                  molecola              (ossidante)

B
                                                                                                   Figura 1. 10 Meccanismo generale di produzione dei ROS
     O            H    +       R           H     R         +       H         O         H
                                                                                                      E’ possibile individuare almeno 5 fonti
      Radicale                 Substrato       Radicale
      ossidrile                organico         alchile
                                                                             Acqua
                                                                                                 metaboliche primarie di radicali liberi, in rapporto al
                                                                                                 sito cellulare prevalentemente interessato nella
                      Figura 1. 8 Reazione di trasferimento
                                                                                                 produzione dei ROS stessi: la plasmamembrana, i
                                                                                                 mitocondri, i perossisomi, il reticolo endoplasmatico
    Con questo meccanismo, per esempio, il                                                       liscio (microsomi) e il citosol. E’ bene precisare che
radicale ossidrile (HO*) attaccando una molecola                                                 in ciascuna di queste sedi i ROS vengono prodotti
organica (R-H), strappa a questa un atomo di                                                     o spontaneamente o per effetto di reazioni
idrogeno, generando, accanto ad una molecola                                                     catalizzate da enzimi o da metalli di transizione (es.
d’acqua (H 2O), un radicale alchilico (R*) (figura 1.                                            ferro o rame) (figura 1. 11).
8, B). Con questo meccanismo, il sito radicalico si
trasferisce dal radicale ossidrile al radicale alchile.
    Infine, una reazione radicalica a catena può
arrestarsi (termine, step 3) o per combinazione o
per disproporzione.
    In particolare, nella combinazione, che è la
reazione inversa della scissione omolitica, due

                                                                                             7
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno

                                                                            dovrebbe concludersi, una volta sintetizzato l’ATP,
                                                                            con la produzione di H2O (riduzione tetravalente
     NADPH ossidasi
     Lipoossigenasi
                                                  NADH deidrogenasi
                                                  Citocromo ossidasi        dell’ossigeno molecolare). Tuttavia, già in
                                                                            condizioni normali, questo processo non è perfetto,
                                                                            per cui in maniera non facilmente controllabile una
                                                                            certa quota di elettroni (1-2%) sfugge al sistema di
                                                                            trasporto dei vari coenzimi (es. ubichinone,
     Xantina ossidasi
     Aldeide ossidasi
                                                    Citocromo P 450
                                                     Citocromo b 5
                                                                            flavoproteine, citocromi, ecc.) e reagisce
                                                                            direttamente        con    l’ossigeno       molecolare,
                                                                            generando, così, anione superossido e /o
                                                                            perossido di idrogeno (riduzione uni- e bivalente
   Figura 1. 11 Fonti cellulari primarie di produzione di ROS               dell’ossigeno molecolare).
                                                                                 Per avere un’idea di questo processo, si
     La plasmamembrana rappresenta una delle                                consideri che è stato calcolato che durante un
fonti più importanti di ROS, particolarmente (ma                            esercizio fisico intenso nei muscoli scheletrici, a
non esclusivamente) nei leucociti polimorfonucleati                         causa      dell’intensa   stimolazione       metabolica
(PMN). Infatti, nella plasmamembrana di queste                              cellulare la quota di questo shunt elettronico può
cellule sonolocalizzati diversi enzimi, quali la                            raggiungere il 15% dell’ossigeno utilizzato dai
NADPH ossidasi e le lipoossigenasi, la cui                                  mitocondri.
attivazione si accompagna alla produzione,                                       Il fenomeno della riduzione uni o bivalente
rispettivamente di anione superossido e di                                  dell’ossigeno molecolare avviene, nei mitocondri,
intermedi metabolici con caratteristiche chimiche di                        senza l’intervento di enzimi, al contrario di quanto
perossidi.                                                                  osservato in altre sedi cellulari (figura 1. 13).
      La NADPH ossidasi è un enzima che catalizza
la formazione di anione superossido da
NADPH(H+) ed ossigeno molecolare, in seguito a                                                                Riduzione tetravalente
stimolazione specifica dei PMN, per esempio da                                     1e -                1e -                   1e -             1e -
parte di endotossine, batteri, o anticorpi).                                  O2                O2.                 H2O2                HO.            H2O
     La reazione, che avviene verosimilmente in                                                       2 H+                                     1H +
due tappe, è resa possibile dall’aumentata
                                                                                   Riduzione           Riduzione                 Riduzione bivalente
disponibilità di NADPH(H+), per l’aumentata                                        univalente          univalente
ossidazione del glucosio attraverso          lo shunt                                     Riduzione bivalente
degli esosi, e di ossigeno molecolare, nell’ambito
del cosiddetto “respiratory burst” (figura 1. 12).
                                                                              Figura 1. 13 Modalità di riduzione dell’ossigeno molecolare

1) NADPH + O 2 → NADP* + H + O 2
                                     +     *
                                                                                 In altre parole, da un punto di vista
2) NADP* + O 2 → NADP + O 2
                        +      *
                                                                            squisitamente chimico la produzione di radicali
   Figura 1. 12 Meccanismo d’azione della NADPH ossidasi                    liberi nel corso della fosforilazione ossidativa è
                                                                            esattamente una modalità non enzimatica di
     Il sistema della lipoossigenasi, localizzato                           produzione di specie reattive.
anch’esso a livello della plasmamembrana,                                        In realtà, come si è appenna accennato, la
comprende tre enzimi, la 5-, la 12-, e la 15-                               generazione di radicali liberi negli organismi viventi
lipoossigenasi, che catalizzano la formazione, a                            è strettamente legata ai fenomeni vitali e, pertanto,
partire dall’acido arachidonico, del 5-, del 12- e del                      costituisce un fenomeno “fisiologico” che avviene
15-HPETE, rispettivamente. Queste sostanze sono                             continuamente nel corso di reazioni di
chimicamente degli idroperossidi acidi, un gruppo                           ossidoriduzione       attraverso     meccanismi      sia
particolare di ROS spesso indicati con la sigla di                          enzimatici che non enzimatici.
ROM (reactive oxygen metabolites, cioè metaboliti                                A questo punto è opportuno sottolineare che,
o derivati reattivi dell’ossigeno).                                         oltre ai mitocondri, esistono anche altre fonti non
     La produzione di ROS a livello della                                   enzimatiche di radicali liberi nelle cellule. Per
plasmamembrana dei PMN, per attivazione della                               esempio, i perossinitriti generano spontaneamente
NADPH ossidasi e/o delle lipossigenasi, avviene,                            radicale idrossile e radicale nitrossido.
tipicamente, nel corso di processi reattivi (es.                                 Tuttavia, le reazioni non enzimatiche più
infezioni,          immunoreazioni         patogene,                        importanti sotto il profilo biologico per la produzione
infiammazioni).                                                             di radicali liberi sono quelle catalizzate da metalli di
     I mitocondri rappresentano la fonte metabolica                         transizione. In queste reazioni, che richiedono
primaria di ROS perché sulle loro creste sono                               generalmente ferro o rame allo stato ridotto
localizzati i complessi enzimatici della catena                             (rispettivamente Fe2+ e Cu +) il perossido di
respiratoria deputati alla fosforilazione ossidativa.                       idrogeno (generato attraverso varie metaboliche,
Idealmente, il trasferimento di elettroni dal NAD                           come si preciserà più avanti) è scisso in radicale
ridotto al citocromo C e da questo all’ossigeno                             idrossile e        ione ossidrile per inglobamento

                                                                        8
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno

dell’elettrone strappato al metallo di transizione,                   citocromo P450. Quest’ultimo gioca un ruolo di
che     viene     rilasciato in  forma    ossidata                    primo piano nei processi di detossificazione.
(rispettivamente Fe3+ e Cu 2+), secondo il                                  Il citocromo P450 agisce come donatore
meccanismo sopra discusso dell’interazione con                        immediato di elettroni in molte reazioni di
metalli di transizione:                                               idrossilazione, in particolare quelle che avvengono
                                                                      all’interno degli epatociti e che sono finalizzate
                                                                      all’inattivazione di ormoni (es. steroidei) e composti
                      → HO* + OH + Fe
                            2+                   -        3+
           HOOH + Fe                                                  non fisiologici (xenobiotici, quali tossici e farmaci
                      oppure
           HOOH + Cu → HO* + OH +Cu
                    +            -    2+                              idrofobici che vengono in tal modo resi più solubili
                                                                      e meno tossici).
                                                                            Il citocromo P 450 è una proteina a ferro eminico
    Analoga reazione subiscono gli idroperossidi,                     presente non solo nel reticolo endoplasmatico del
che generano il radicale alcossile:                                   fegato ma anche nei mitocondri della corticale del
                                                                      surrene che, in un processo molto complesso e
                                                                      non ancora perfettamente chiarito, fa da trait-
                      → RO* + OH + Fe
                            2+                   -          3+                                   +
           ROOH + Fe                                                  d’union fra l’NADPH(H ) (donatore di elettroni) e
                      oppure
           ROOH + Cu → RO* + OH + Cu
                    +            -    2+                              substrato da idrossilare. In tale complessa reazione
                                                                      un substrato idrossilabile (SH) reagisce con
                                                                      NADPH(H+) ed ossigeno molecolare (O 2) per
     Gli enzimi che rigenerano metalli di transizione                 formare il corrispondente derivato idrossilato
allo stato ridotto costituiscono un complesso                         (S-OH), insieme a NADP+ ed acqua.
indicato con la sigla MCO (sistemi di ossidazione                           Una produzione di radicali liberi avviene nella
metallo-catalizzata). Essi comprendono la xantina                     cellula anche nel corso di numerose altre reazioni
ossidasi, la NADPH e la NADH ossidasi, l’acido                        biochimiche,       come      ad     esempio     durante
nicotinico idrossilasi, il sistema del citocromo P450,                l’ossidazione      dell’ipoxantina a xantina e della
la NADH reduttasi (coenzima chinonico), la                            xantina ad acido urico, che contrassegnano la fase
succinico-reduttasi (coenzima chinonico) e varie                      finale del catabolismo dei nucleotidi purinici
proteine a ferro-zolfo non eminico. I chinoni e i                     (AMP•IMP•inosina•ipoxantina•xantina•acido
gruppi prostetici flavinici ridotti generati da questi                urico).
enzimi riducono a loro volta i metalli di transizione,                      Ambedue le suddette reazioni sono catalizzate
provocando la riduzione diretta dell’ossigeno                         dalla xantina deidrogenasi, un enzima a molibdeno.
molecolare a radicale idrossile e/o a perossido di                    In particolari condizioni, come nel corso del
idrogeno (attraverso la mediazione o meno                             cosiddetto danno da ischemia-riperfusione, la
dell’anione superossido) (figura 1. 14).                              xantina deidrogenasi è convertita in xantina
                                                                      ossidasi (probabilmente per clivaggio proteolitico
                                  FH 2                                calcio-dipendente). Quest’ultima, utilizzando come
          QH2
                                  O2                                  accettore finale di elettroni direttamente l’ossigeno,
             QH*,     H-                     QH*, H-                  genera perossido di idrogeno e anione
                                  O2*                                 superossido,        a      partire,    rispettivamente,
                    2H+
                           x2
                                                     Fe(III)          dall’ipoxantina e dalla xantina (figura 1. 15).
            O2                    O2
                      H2 O 2              Fe(II)
                F                                     FH+
                                                                              Ipoxantina   Xantina                Xantina   Acido urico
                          *OH + OH- + Fe (III)
         Figura 1. 14 Sistemi MCO e ciclo del ferro                                             ← Xantina ossidasi →

                                                                               H2O + O 2    H2 O2                      O2       O2 -
     Oltre alla plasmamembrana ed ai mitocondri,
anche i perossisomi rappresentano una fonte
importante di ROS. In questi organuli cellulari,
infatti, avviene un particolare processo di
ossidazione degli acidi grassi, che è diverso da                         Figura 1. 15 Produzione di ROS dal catabolismo purinico
quello convenzionale (β−ossidazione). Nella prima
tappa di tale sequenza di reazioni, una                                   Altre reazioni che generano radicali liberi sono
flavoproteina estrae una coppia di atomi di                           descritte nella sintesi delle catecolammine.
idrogeno da una molecola          di acido grasso                         Da quanto esposto finora, si evince che i ROS
attivato(acil-CoA)    trasferendola   direttamente                    rappresentano intermedi quasi obbligati del
all’ossigeno molecolare, con formazione di                            metabolismo cellulare. E poiché la loro produzione
perossido di idrogeno (successivamente inattivato                     è strettamente legata ai fenomeni vitali, a ragione
dalla catalasi).                                                      essi sono stati definiti “insostituibili compagni di
     Nel reticolo endoplasmatico (microsomi) la                       viaggio” della nostra esistenza.
produzione di specie reattive passa attraverso il

                                                                  9
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno

      Appare evidente che in ciascun sito cellulare,                      maniera sostanziale sulla produzione di radicali
la produzione di specie reattive ha una sua                               liberi.
specifica funzione. Infatti, è stato riconosciuto che i                        Fra gli agenti chimici in grado di stimolare la
ROS giocano un ruolo importante “al servizio della                        produzione di radicali liberi è da citare l’ozono (un
vita” perché sono coinvolti non solo nel                                  ROS) che genera direttamente radicali perossilici
metabolismo cellulare ma anche nei “processi                              per interazione con composti fenolici.
reattivi”, quali infezioni e infiammazioni. In verità,                         I due casi finora considerati (radiazioni e
l’anione superossido e gli altri ROS vengono                              ozono) costituiscono esempi di produzione diretta
generati      sulla     superficie     esterna    della                   di specie reattive.
plasmamembrana dei leucociti attivati. Queste                                  Altri agenti chimici, invece, quali gli idrocarburi
specie reattive attaccheranno componenti estranei                         aromatici policiclici o taluni farmaci, inducono un
quali batteri indebolendone la parete e rendendoli                        aumento della produzione dei radicali liberi
più facilmente accessibili alla fagocitosi e, in                          attraverso un meccanismo indiretto, attivando il
definitiva, alla loro distruzione. Queste attività                        sistema del citocromo P450 a livello microsomiale.
“immunologiche” si estrinsecano non solo nei                                   Agenti biologici che tipicamente inducono un
confronti di componenti estranei ma anche contro                          aumento della produzione di ROS per attivazione
componenti “self” quali tessuti o organi trapiantati                      metabolica specifica sono i batteri, nell’ambito del
(reazione di rigetto). Questa strategia viene anche                       fisiologico processo di difesa dalle infezioni, e
utilizzata nel corso della guarigione di organi o                         taluni anticorpi, nell’ambito di alcune reazioni
tessuti soggetti a traumi. Infatti, i leuociti migrano                    immunopatogene. In questi casi, come accennato
nell’area lesa, si attivano e iniziano a bombardare                       a proposito della plasmamembrana, sono chiamati
le cellule danneggiate con i radicali liberi che                          direttamente in causa i PMN. Questi ultimi, infatti,
accelerano la loro distruzione, allontanamento dei                        possiedono oltre alla citata NADPH ossidasi, una
sottoprodotti di lisi, e il corrispondente recupero                       serie di enzimi direttamente coinvolti nella
(rigenerazione).                                                          produzione e, in parte, inattivazione di specie
      La produzione di radicali liberi da parte delle                     chimiche reattive, quali la superossidodismutasi
cellule può, talvolta, subire un incremento notevole                      (SOD), la mieloperossidasi (MPx), la catalasi (CAT)
per effetto di stimolazioni esterne. Infatti, agenti                      e la glutatione perossidasi (GPx) (figura 1. 17).
fisici, chimici e biologici, da soli o in combinazione
tra loro, possono indurre direttamente la                                        Batteri, endotossine , anticorpi              NADPH ossidasi
                                                                                                                         NADPH + O 2 → NADP . + H + + O2.
generazione di ROS o aumentarne la “fisiologica”                            Ossidazione diretta    ↑ Captazione di         NADP . + O → NADP + + O .
                                                                                                                                       2               2
produzione attraverso una specifica stimolazione                               del glucosio           ossigeno

metabolica.                                                                                                               Superossido dismutasi (SOD)
                                                                              Generazione di       ↑ Disponibilit à di
      Tra gli agenti fisici, sono da segnalare le                              NADPH + H +            ossigeno              2 O 2. + 2 H + → H 2 O 2 + O 2

radiazioni ionizzanti e i raggi UV. Ambedue queste
                                                                                  Attivazione NADPH ossidasi
fonti energetiche possono indurre il fenomeno della                                                                          Mieloperossidasi (MPx)
                                                                                                    .                       HCl + H2O2 → H2O + HClO
scissione omolitica dell’acqua, detto anche radiolisi                                             O2
o fotolisi a seconda del tipo di radiazione coinvolto                                              SOD                            Catalasi (CAT)
(figura 1. 16).                                                                                H2O2                            2 H2O 2 → 2H 2O + O 2

                                                                                            MPx CAT        GPx
                                                                                                                          Glutatione perossidasi (GPx)
                                                                                   HClO                H2O               2 GSH + H2O2 → 2H 2O + GSSG

                                                                            Figura 1. 17 Produzione reattiva di ROS da parte dei PMN

    H    R        H         UV        H         R     +      H
                                                                               La SOD catalizza la trasformazione dell’anione
        Acqua                             Radicale        Radicale
                                                                          superossido in perossido di idrogeno che, a sua
                                          idrossile       idrogeno        volta, può essere inattivato ad acqua per azione
                                                                          della CAT o della GPx. Tuttavia, la disponibilità di
                                                                          cloruri – anche a concentrazioni fisiologiche –
                                                                          rende il perossido di idrogeno substrato della MPx.
                Figura 1. 16 La fotolisi dell’acqua                       Il risultato finale è la produzione di un agente
                                                                          altamente ossidante, l’acido ipocloroso (HClO).
     In questa reazione la molecola d’acqua                               Come verrà precisato in seguito, l’HClO può
assorbe energia e la utilizza per scindere uno dei                        attaccare numerosi substrati organici e, in
suoi due legami covalenti con l’idrogeno: i prodotti                      particolare, amminoacidi e proteine, per produrre
saranno due radicali liberi, il radicale idrossile e                      cloroammine, una potenziale fonte di radicali
l’atomo di idrogeno. Considerato che un organismo                         alcossilici e perossilici.
vivente è costituito prevalentemente da acqua e                                Infine, giova ricordare che un aumento della
che trascorre gran parte della sua vita sotto l’effetto                   produzione di radicali liberi può osservarsi in
di radiazioni (UV o ionizzanti che siano) appare                          situazioni “fisiologiche”, come ad esempio dopo un
evidente quanto questo fenomeno incida in                                 intenso sforzo muscolare o nel corso di numerose
                                                                          malattie. In quest’ultimo caso, spesso, non è chiaro

                                                                     10
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno

fino a che punto i ROS siano la causa o l’effetto                                                               discussa fotolisi dell’acqua e la decomposizione del
della patologia considerata (vedi più avanti).                                                                  perossido di idrogeno (figura 1. 20).
                                                                                                                Respirazione
      1. 3 Metabolismo delle più importanti                                                                      polmonare          O2*                       H2O                     H2O2
      specie reattive di interesse biologico                                                                                        Reazione di Haber-Weiss
                                                                                                                                                                 Radiolisi
                                                                                                                                                                        Reazione di Fenton

     Le più comuni specie reattive di interesse                                                                     O2
                                                                                                                                       Catena
                                                                                                                                                              HO*      Scissione spontanea   HONOO
                                                                                                                                     respiratoria
biologico sono quelle centrate sull’ossigeno,                                                                                    Riduzione univalente
sull’azoto, sul carbonio e sul cloro (tabella 1. 1).                                                                                                                  Reazione con ozono
                                                                                                                                                        RH
   Tabella 1. 1 Specie reattive di maggiore interesse biologico                                                                                                                       Fenoli
 Specie chimica       Formula               Natura       Specie chimica            Formula        Natura                                                H2O
        Ozono            O3                  N-R             Ossido nitrico          NO*            R
                           *
 Anione superossido      O2                   R             Diossido nitrico         NO2*           R
                        1
 Ossigeno singoletto     O2*                 R (?)           Acido nitroso          HNO2           N-R
Perossido di idrogeno   H2O2                 N-R         Tetrossido di azoto         N2O4          N-R                                                         R*
  Radicale idrossile    HO*                   R            Triossido nitrico         N2O3          N-R
                                                                                           -
  Radicale alcossile    RO*                   R              Perossinitrito         ONOO           N-R                    Figura 1. 20 Metabolismo del radicale idrossile
Radicale idroperossile ROO*                   R          Acido perossinitroso      ONOOH           N-R
                                                                                        2+
    Idroperossido      ROOH                  N-R           Catione nitronio          NO            N-R
 Semichinone ( CoQ)      Q*                   R           Alchil-perossinitrito    ROONO           N-R               Infine, il perossido di idrogeno viene generato
   Fenossile (vit E)    E-O*                  R            Acido ipocloroso          HClO          N-R
N-R: specie non radicalica.                                                                                     prevalentemente attraverso meccanismi di tipo
R: specie radicalica.                                                                                           enzimatico e per via enzimatica è generalmente
                                                                                                                inattivato o dà luogo alla formazione di specie
     Tra le specie reattive primarie dell’ossigeno                                                              chimiche più ossidanti (figura 1. 21).
citate nel paragrafo precedente, l’ossigeno
singoletto rappresenta una varietà radicalica che
può originarsi per eccitazione dell’ossigeno                                                                    Respirazione   Superossido                                         Amminoacido
                                                                                                                 polmonare      dismutasi                                            ossidasi
molecolare o per combinazione di radicali
perossilici (figura 1. 18).
                                                                                                                                       Catena                                                Xantina
                                                                                                                    O2               respiratoria             H2O2      Ossidazione mista    ossidasi
                                                                                                                                  Riduzione bivalente                      ipoxantina

                                                                                                                               Reaz. di Haber-Weiss      Catalasi Perossidasi     Mieloperossidasi
                    O2                                                            ROO*
                                                                                                                                                                         Superossido dismutasi
                                                                                                                          HO*                                 H2O                                ClO-
                              Eccitazione                         Combinazione

                                                1O
                                                     2                                                                Figura 1. 21 Metabolismo del perossido di idrogeno

                                                                                                                     Le specie reattive primarie dell’ossigeno
                                                                                                                possono attaccare qualsiasi substrato organico,
                                                                                                                generando specie reattive secondarie, note anche
  Figura 1. 18 Modalità di generazione dell’ossigeno singoletto                                                 come metaboliti o derivati reattivi dell’ossigeno,
                                                                                                                quali gli idroperossidi. Questi ultimi, a loro volta, in
     Molto più complessa è, invece, la formazione                                                               particolari condizioni, possono dare origine a
dell’anione superossido (figura 1. 19).                                                                         specie chimiche particolarmente reattive quali i
                                                                                                                radicali perossile e alcossile.
  Respirazione           NADPH                                                     Citocromi
   polmonare             ossidasi                                                   P450 e 5 b
                                                                                                                     Le specie reattive centrate sull’azoto di
                                                                                                                maggiore rilevanza biomedica comprendono
                            Ossidazione mista NADPH                Autoossidazione
                                                                                                                varietà sia radicaliche che non radicaliche. Fra le
                               Catena                                                      Xantina
                                                                                                                prime sono da citare l’ossido nitrico (NO*) e il
        O2                   respiratoria                  e        Ossidazione mista      ossidasi             biossido nitrico (NO 2*); fra le seconde, piuttosto
                                                                       ipoxantina
                         Riduzione univalente
                                                                                                                numerose, ricordiamo, invece, l’acido nitroso e il
                                                                                                                perossinitrito.
                                                                                                                     L’ossido nitrico, un gas considerato per
                         Reazione di Haber-Weiss          O2         Superossido dismutasi
                                                                                                                decenni un inquinante ambientale, viene prodotto,
                                                                                                                insieme alla L-citrullina, a partire dall’amminoacido
               HO*                                                                               H2O2
                                                                                                                L-arginina, in una reazione catalizzata dall’enzima
                                                                                                                ossido nitrico sintetasi (nitric oxide synthase, NOS).
           Figura 1. 19 Metabolismo dell’anione superossido
                                                                                                                Quest’ultimo possiede la singolare proprietà di
                                                                                                                ospitare sulla stessa catena polipeptidica due
    Il radicale idrossile, noto per la sua enorme                                                               domini ad azione catalitica, uno reduttasico ed uno
potenzialità istolesiva, può derivare da un’ampia                                                               ossigenasico, e richiede come cofattori NADPH e
serie di reazioni, tra le quali spiccano la già
                                                                                                                pteridina ridotta. La NOS esiste in numerose

                                                                                                           11
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno

isoforme, alcune costitutive (cellule endoteliali,                                                       potenziale tossicità di questa specie reattiva. Infatti,
piastrine, SN) ed altre inducibili (macrofagi, PMN,                                                      sebbene il perossinitrito svolga un’importante
cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, epatociti)                                                 azione microbicida e tumoricida, la generazione di
                                                                                                                                  -
(figura 1. 22).                                                                                          un eccesso di ONOO si accompagna a lesioni
                                                                                                         tissutali di tipo ossidativo. Specificamente, il
                                                                                                         perossinitrito è responsabile della nitrazione dei
            H2N                                 H2N
                          +
                                                                                                         residui fenolici delle tiroxine, che conduce alla
                        NH2                                   O
                                                                                                         formazione di nitrotirosina, un marker della tossicità
               HN                                  HN
                                                                                                         tissutale dell’NO. A pH neutro, il perossinitrito,
                                                                                                         genera, a sua volta, l’acido perossinitroso
                                NOS
                            NADPH, O 2 , BH4
                                                                    +       NO                           (ONOOH). Quest’ultimo può attaccare diverse
         H2N                                 H2N
                                                                                                         molecole con produzione secondaria di radicale
                        O                                    O
                                                                                                         idrossile ed altri intermedi reattivi. Tuttavia, in
                                                                                                         quanto radicale libero, l’NO può anche svolgere
               HO                                  HO
               L-arginina                          L-citrullina         Ossido nitrico
                                                                                                         un’attività antiossidante, come scavenger dei
                                                                                                         radicali alcossilici e perossilici. La prevalenza
                                                                                                         dell’una o dell’altra azione dipende dalle
            Figura 1. 22 Biosintesi del l’ossido nitrico                                                 concentrazioni relative delle singole specie reattive
                                                                                                         implicate.
     Nei sistemi biologici, l’NO agisce come un                                                               Oltre alle specie reattive dell’ossigeno e
importante messaggero intra- ed inter-cellulare                                                          dell’azoto, assumono rilevante importanza, infine, i
regolando molte funzioni quali la pressione                                                              radicali centrati sul carbonio (importanti intermedi
arteriosa, la respirazione, la coagulazione del                                                          della per ossidazione lipdica) e le specie reattive
sangue, e alcune attività cerebrali. Esso, inoltre,                                                      del cloro (in particolare l’acido ipocloroso,
gioca un ruolo determinante nella difesa dalle                                                           responsabile della formazione delle cloroammine).
infezioni batteriche e nella prevenzione dei tumori.
Tuttavia, se generato in quantità abnormi esso è
anche un potente killer cellulare.
                                                                                                              1. 4 Il sistema di difesa antiossidante
     Nell’NO gli elettroni spaiati del livello
energetico più esterno (cinque appartenenti                                                                   I ROS sono specie chimiche potenzialmente
all’azoto e sei all’ossigeno) generano una specie                                                        lesive. Per questo motivo, gli organismi viventi
chimica non carica, dotata di proprietà                                                                  hanno sviluppato nel corso di millenni di evoluzione
paramagnetiche e, dunque, un radicale.                                                                   un complesso sistema di difesa antiossidante,
     In quanto radicale libero, l’NO reagisce                                                            costituito da un insieme di enzimi, di vitamine, di
rapidamente con altre specie aventi elettroni                                                            oligoelementi ed altre sostanze simil-vitaminiche.
spaiati; l’effetto può essere un’ossidazione, una                                                             Tali antiossidanti possono essere classificati
riduzione oppure il legame con altre molecole, in                                                        secondo diversi criteri: sulla base dell’origine, in
funzione del microambiente (figura 1. 22).                                                               endogeni ed esogeni, sulla base della natura
                                                                                                         chimica, in enzimatici e non enzimatici, e sulla
                                                                                                         base della solubilità, in liposolubili e idrosolubili.
                                        L-arginina                                                            Sulla base, invece, del meccanismo d’azione
                                                                                                         prevalente, gli antiossidanti fisiologici possono
                       NO3-             NOS                                                              essere agevolmente riuniti in 4 gruppi principali:
                            Redox
                                                                  L-citrullina                           antiossidanti preventivi, scavenger, agenti di riparo
                pH
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno

     Gli scavenger, che agiscono attraverso vari                                             antiossidante fisiologico di un organismo. Per
meccanismi, possono essere di natura idrofila                                                esempio, un corretto esercizio fisico o l’adozione di
(albumina, urato, ascorbato, urato) oppure lipofila                                          un regime alimentare corretto ed equilibrato sono
(carotenoidi, vitamina E, ubichinolo).                                                       misure di per sé in grado di controllare il
     Secondo alcuni ricercatori, gli scavenger                                               metabolismo ossidativo attraverso la riduzione
dovrebbero essere distinti dagli antiossidanti                                               della produzione di specie reattive e l’induzione di
propriamente detti. Infatti, mentre gli scavenger                                            enzimi ad attività antiossidante .
(es. α−tocoferolo) sono agenti che riducono la                                                    Il sistema di difesa antiossidante è
concentrazione di radicali liberi rimuovendoli dal                                           regolarmente distribuito nell’organismo, sia a livello
mezzo in cui si trovano, gli antiossidanti (es.                                              extracellulare che a livello intracellulare.
difenilammina), invece, sono agenti che inibiscono                                                A livello dei liquidi extracellulari e, in
il processo dell’autoossidazione, di cui costituisce                                         particolare, nel plasma, l’insieme delle sostanze
un importante esempio l’irrancidimento dei grassi.                                           potenzialmente in grado di cedere equivalenti
Questo fenomeno, ben noto in scienza                                                         riducenti (atomi di idrogeno o singoli elettroni) sì da
dell’alimentazione, viene definito autoossidazione                                           soddisfare “l’avidità di elettroni” che rende i radicali
perché avviene attraverso una sequenza                                                       liberi instabili costituisce la cosiddetta barriera
autocatalitica di reazioni radicaliche in presenza di                                        antiossidante. Ne fanno parte, nel plasma, tutte le
ossigeno. Alternativamente si può usare il termine                                           proteine e, in particolar modo, l’albumina, la
di perossidazione, in quanto lo stesso processo                                              bilirubina, l’acido urico, il colesterolo, e i vari
genera intermedi con caratteristiche di perossidi                                            antiossidanti esogeni introdotti con l’alimentazione
(R–O–OR) (figura 1. 23).                                                                     o sotto forma di integratori dietetici (ascorbato,
                                                                                             tocoferolo, polifenoli ecc.). Un ruolo di particolare
                           RH
                                 *OH                                                         importanza è svolto, nel contesto di questa
                           H2O
                                                   RH H2 O
                                                                           R*
                                                                                             barriera, dai gruppi tiolici (-SH).
                                  R*
                                                    O2                                            All’interno delle cellule il sistema di difesa
                                                   ROO*                                      antiossidante ha una sua ben                  precisa
                                 ROO*
                    R*                                                                       compartimentalizzazione (figura 1. 24).
        ROOH             ROH     ROOR
                                                                                                      Vitamina E                                      Selenio
               RH                                                                               Acidi grassi poliinsaturi                            Vitamina E
                                                       RH: molecola organica
                    RO*                 RO*   O2                                                       β-carotene                                    Ubichinone
                                                       ROOH : idroperossido
                                                       ROO*: radicale idroperossilico
                                                       RO*: radicale alcossilico

 Figura 1. 23 Il processo di autoossidazione o perossidazione
                                                                                                       Glutatione
                                                                                                                                                     Vitamina E
                                                                                                       Ascorbato
                                                                                                                                                     β-carotene
                                                                                                        Selenio

                                                                                                                            Vitamina E,
    Attraverso questo processo alcuni grassi alimentari                                                                     Ascorbato     Catalasi
                                                                                                                            β-carotene

irrancidiscono      e le biomembrane degli organismi                                         Figura 1. 24 Compartimentalizzazione dei sistemi antiossidanti

viventi vengono ossidate.                                                                         Il sistema antiossidante comprende alcuni
                                                                                             enzimi        (superossidodismutasi,        catalasi     e
     Gli     agenti      di    riparo      comprendono                                       perossidasi) ed una serie di sostanze assunte
esclusivamente enzimi che intervengono dopo che                                              dall’esterno (vitamine e sostanze analoghe ad
il danno da specie reattive si è instaurato. La loro                                         attività      antiossidante,    quali     i     polifenoli,
azione – spesso sequenziale – prevede dapprima                                               oligoelementi ecc). Alcuni di questi agenti sono
l’identificazione del segmento molecolare ossidato,                                          liposolubili (es. tocoferoli) e, entrando nella
poi la separazione del frammento ormai                                                       compagine delle biomembrane, costituiscono la
inutilizzabile e, infine, la sistensi e l’inserimento di                                     prima linea di difesa contro l’attacco dei radicali
un nuovo segmento in sostituzione di quello                                                  liberi. Altri, invece, sono idrosolubili (es. ascorbato)
danneggiato. Appartengono agli agenti di riparo le                                           ed intervengono soprattutto nel contesto della
idrolasi (glicosidasi, lipasi, proteasi), le trasferasi e                                    matrice solubile del citoplasma e degli organuli
le polimerasi, tutte indispensabili per la riparazione                                       cellulari.
del danno da radicali liberi di importanti molecole o
strutture cellulari (es. DNA, membrane, ecc).
     Infine, gli agenti di adattamento comprendono
tutte quelle sostanze o tecniche o procedure
attraverso le quali è possibile potenziare il sistema

                                                                                        13
Capitolo 2. Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.

                                                                   Capitolo 2
                                              Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.

                  2. 1 Generalità e definizioni                                                               stress ossidativo e le relative implicazioni sul piano
                                                                                                              diagnostico e terapeutico.
      Lo stress ossidativo è una particolare                                                                      Comunque determinatasi, infatti, l’eccessiva
condizione indotta da un’accentuazione in senso                                                               produzione      di   specie     reattive,  non      più
pro-ossidante dell’equilibrio dinamico fra processi                                                           adeguatamente controllata dai sistemi di difesa
ossidativi    e    riduttivi  che     hanno      luogo                                                        antiossidanti, provoca una serie di alterazioni
continuamente in ogni cellula, quale espressione                                                              funzionali e strutturali della cellula, che possono
fisiologica    delle     complesse     trasformazioni                                                         condurre all’apoptosi o addirittura alla necrosi
biochimiche del metabolismo terminale.                                                                        (tabella 2. 1).
     Sulla base di questo tentativo di inquadrare un
aspetto della biochimica dinamica che è tuttora                                                               Tabella 2. 1 Alterazioni biochimiche cellulari nello s. ossidativo
                                                                                                              •    Perossidazione biomolecole (glicidi, lipidi, amminoacidi, nucleotidi…)
oggetto di ampio dibattito fra i ricercatori, lo stress                                                       •    Ossidazione e deplezione di GSH
ossidativo si configura come un fenomeno che                                                                  •    Ossidazione dei tioli proteici
                                                                                                              •    Ossidazione dei nucleotidi piridinici
riguarda, almeno in prima battuta, la singola cellula                                                         •    Lesioni del DNA ed attivazione della poli(ADP-ribosio)polimerasi
che, per effetto della propria attività metabolica,                                                           •    Alterazioni dei meccanismi di trasduzione del segnale
non di rado sotto lo stimolo di agenti ad essa                                                                •    Alterazioni dell’omeostasi ionica
                                                                                                              •    Alterazioni del citoscheletro
esterni, è costretta a subire gli effetti                                                                     •    Inibizione della glicolisi
potenzialmente lesivi di una serie di reazioni                                                                •    Deplezione di NAD +
indesiderate che accompagnano quei processi                                                                   •    Caduta del potenziale di membrana mitocondriale
                                                                                                              •    Deplezione di ATP
ossidativi da cui dipende la sua stessa esistenza.                                                            •    Aumento della permeabilità della membrana plasmatica

                           2. 2 Basi biochimiche                                                                   Sul piano generale, queste lesioni – dapprima
                                                                                                              cellulari e poi tissutali – saranno responsabili,
    I ROS rappresentano una minaccia mortale                                                                  infine, di patologie d’organo, quali ad esempio il
per la vita della cellula che ne tiene sotto controllo                                                        morbo di Crohn o la pancreatite, oppure di
la produzione grazie ad un efficiente sistema di                                                              condizioni sistemiche, quali l’invecchiamento
difesa. Tuttavia, in particolari condizioni, quando la                                                        precoce, l’aterosclerosi e così via.
produzione di ROS è eccessiva e/o la capacità di                                                                   Comunque, va sottolineato ancora una volta
smaltire questi ultimi si riduce, la cellula è costretta                                                      che non sempre è possibile stabilire se i radicali
a subire il danno da radicali liberi.                                                                         liberi sono la causa oppure l’effetto delle lesioni
    Trasferendo il discorso all’intero organismo,                                                             osservate.
possiamo definire lo stress ossidativo come una                                                                    Le principali cause di aumentata produzione di
particolare forma di stress chimico indotto dalla                                                             ROS sono da individuarsi in fattori ambientali,
presenza di una quantità eccessiva di specie                                                                  situazioni fisiologiche, stile di vita, fattori
reattive per un’aumentata produzione delle stesse                                                             psicologici, malattie e fattori iatrogeni, ecc. (tabella
e/o per una ridotta capacità di smaltirne le quantità                                                         2. 2).
comunque prodotte ( figura 2. 1).
                                                                                                                  Tabella 2. 2 Cause di aumentata produzione di specie reattive
    Radiazioni,farmaci, metalli pesanti                                   Ridotta assunzione                           Eziologia                                Examples
  Fumo di sigaretta, alcool, inquinamento                                 e/o diminuita sintesi
  Esercizio fisico inadeguato, sedentarietà                      e/o ridotta capacità di utilizzazione             Fattori ambientali                   Radiazioni, inquinamento
          Infezioni ed altre malattie                          e/o aumentato consumo di antiossidanti                Stati fisiologici                       Gravidanza (?)
                                                                                                                      Stile di vita       Alimentazione, alcool, fumo, esercizio fisico incongruo
                                                                                                                   Fattori psicologici                  Stress psico-emotivo (?)
                                                                                                                        Malattie         Traumi, infiammazioni, infezioni, vasculopatie, neoplasie
           Specie reattive ↑                               Difese antiossidanti ↓                                   Fattori iatrogeni              Farmacoterapia, radioterapia, raggi X

                                          Danno cellulare
                                                                                                                  Bisogna sottolineare che il fumo di sigaretta,
                                                                                                              l’abuso di alcool ed altri fattori correlati con lo stile
    Malattie              Demenza,            Invecchiamento    Infiammazioni,             Altre              di vita sono responsabili dell’aumento della
 cardiovascolari        M. di Parkinson           precoce            tumori               malattie
                                                                                                              produzione di ROS. Lo stesso effetto è indotto da
 Figura 2. 1 Eziopatogenesi schematica dello stress ossidativo
                                                                                                              un’attività    fisica   incongrua      (eccessiva       o
                                                                                                              insufficiente). Infine, è riconosciuto il ruolo dei
                                                                                                              numerose malattie, su base disreattiva o infettiva
   E’ ovvio che il discorso è ben più complesso,                                                              (es. artrite reumatoide e infezioni batteriche) nel
ma il concetto appena esposto è sufficiente per                                                               favorire l’incremento dei ROS.
comprendere i principali aspetti fisiopatologici dello                                                            Una riduzione delle difese antiossidanti è da
                                                                                                              imputarsi sostanzialmente ad un deficit assoluto o

                                                                                                         14
Capitolo 2. Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.

relativo di antiossidanti, comunque determinatosi.
In tale contesto, alcune malattie, quali la celiachia,                                                                        R–H + HO* → R* + H 2O
possono provocare uno stress ossidativo riducendo                                                                                 R* + O2 → ROO*
la disponibilità di antiossidanti assunti con
l’alimentazione (tabella 2. 3).                                                                                                ROO* → ROOH + R 1*

           Tabella 2. 3 Cause di ridotte difese antioossidanti                                                                  R1* + R 1* → R 1*–R1*
               Eziologia                                              Esempi
Ridotta assunzione di AO                                  Ipovitaminosi, diete monotone                       Figura 2. 3 Reazioni radicaliche e produzione di perossidi
Ridotto assorbimento di AO                          Sindromi da malassorbimento, celiachia
Ridotta capacità di utilizzazione di AO            Deficit dei mec. di captazione e/o trasporto
Insufficienza dei sistemi enzimatici AO                    Fattori genetici e/o iatrogeni                         Il radicale *OH, avendo un elettrone spaiato, è
Eccessivo consumo di AO                             Eccessiva produzione di specie reattive
Assunzione di farmaci                               Sovraccarico del sistema microsomiale                   molto reattivo e, giunto a contatto con il substrato
Malattie                                                                Vari                                R-H, strappa a quest’ultimo un atomo di idrogeno
AO: antiossidanti
                                                                                                            per raggiungere la sua stabilità.
     A proposito delle malattie, va precisato che                                                                 In questo modo, però, il sito radicalico è ora
esse alcune di esse si accompagnano ad                                                                      trasferito al substrato che si trasforma in radicale
un’aumentata produzione di specie reattive, altre                                                           R*. Quest’ultimo, in presenza di ossigeno
ad una riduzione delle difese antiossidanti, altre                                                          molecolare, è convertito in radicale (idro)perossile
ancora, infine, alla combinazione di ambedue i                                                              ROO*, un nuovo radicale che, a sua volta, può
meccanismi.                                                                                                 attaccare un altro substrato organico R1H
     Spesso, tuttavia, non è chiaro se i radicali liberi                                                    trasformandosi in idroperossido ROOH.
                                                                                                                  La reazione a catena ormai innescata
ne siano la causa oppure l’effetto o addirittura un
                                                                                                            continuerà a partire dall’ultimo radicale generato
semplice epifenomeno.
                                                                                                            (R1*), fino a quando non interverrà un meccanismo
     Dal punto di vista biochimico, considerando il
                                                                                                            di terminazione (es. reazione di combinazione, R1*
fenomeno all’interno della cellula, è indubbio che
                                                                                                            + R 1*, per produrre R1-R1) oppure un antiossidante.
all’origine delle alterazioni funzionali e strutturali vi
è un aumento della produzione di specie reattive                                                                  Il fenomeno della perossidazione – è bene
per stimolazione parziale o generalizzata del                                                               ribadirlo – non è esclusivo dei lipidi, ma può
metabolismo, spesso sotto la spinta di fattori                                                              interessare qualsiasi substrato organico, dagli
esogeni. I ROS, resisi disponibili in grandi quantità,                                                      amminoacidi alle proteine, dai carboidrati ai
sono in grado di attaccare qualsiasi substrato con il                                                       nucleotidi.
quale giungono a contatto, strappando ad essi                                                                     Non v’è dubbio, tuttavia, che i lipidi,
l’elettrone o gli elettroni necessari per raggiungere                                                       specialmente se insaturi, e, quindi, con doppietti di
la propria stabilità. Ciò, a sua volta, innesca                                                             legame “disponibili” a soddisfare l’avidità di
processi radicalici a catena che, se non bloccati                                                           elettroni dei radicali liberi, costituiscano target
                                                                                                            importanti dell’attacco ossidativo, in particolar
tempestivamente, possono provocare gravi
                                                                                                            modo se inseriti nel contesto di biomembrane e,
conseguenze sul piano, dapprima funzionale, poi
anche strutturale (figura 2. 2).                                                                            come tali, maggiormente esposti all’azione
                                                                                                            radicalica.
                                 Agenti esterni, attività metabolica                                              La perossidazione lipidica segue lo schema
 Anione superossido O 2.
                                                                   Ossigeno singoletto 1O2                  generale delle reazioni radicaliche appena
  Radicale idrossile HO*
Radicale peridrossile HO 2*
                                                                  Perossido di idrogeno H2O 2               discusso, con la variante che, se ad essere colpito
                                                                                                            è un acido grasso poliinsaturo, quale l’acido
                                Substrati organici RH (glicidi, lipidi,
                                  amminoacidi, nucleotidi , etc.)                                           arachidonico, ad essere attaccato dal radicale
       Metallidi transizione/                                             Metallidi transizione/            istolesivo HO* è uno dei doppi legami C-C.
        Sistemi enzimatici                                                 Sistemi enzimatici
                                      Idroperossido R-OOH                                                         In questo caso specifico, la sottrazione di un
                                     Radicale alcossile R-O*
                                   Radicale idroperossile R-OO*                                             atomo di iidrogeno da parte del radicale idrossile
                                                                                  Superamento difese
                                                                                     antiossidanti          genera un radicale centrato sul carbonio, che
                     Alterazioni funzionali e/o strutturali della cellula                                   rapidamente va incontro ad una redistribuzione dei
Figura 2. 2 Patogenesi dello stress ossidativo: aspetti biochimici                                          doppi legami trasformandosi in diene coniugato.
                                                                                                            Quest’ultimo, in presenza di ossigeno si trasforma
     Fra i vari meccanismi cito- ed isto-lesivi                                                             in radicale perossilico.
assume rilevante importanza quello correlato con                                                                  Il    radicale    perossilico   corrispondente
la formazione degli idroperossidi (ROOH), una                                                               rappresenta un composto chiave in questa
classe di derivati o metaboliti reattivi dell’ossigeno                                                      sequenza di reazioni, perché può essere non solo
(reactive oxygen metabolites, ROM).                                                                         trasformato in idroperossido, ma andare incontro,
     Questo meccanismo, tipico delle reazioni                                                               per la sua peculiare struttura chimica, ad ulteriore
radicaliche a catena, viene innescato dall’attacco,                                                         degradazione fino a malonildialdeide e, infine, a
da parte di un ROS (per esempio, il radicale                                                                pentano, se sono disponibili ulteriori donatori di
istolesivo *OH), di un generico substrato organico                                                          idrogeno (e, in ultima analisi, fino a completa
R-H (es. un glicide, un lipide, un amminoacido, un                                                          utilizzazione del sistema antiossidante) (figura 2.
nucleotide ecc.) (figura 2. 3).                                                                             4).

                                                                                                       15
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