D-ROMs Test E - Eugenio Luigi Iorio
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Eugenio Luigi Iorio
d-ROMs
Test
Prima Edizione – 2003
E
Stress
Ossidativo
DIACRON InternationalLa struttura molecolare riportata in copertina è la formula chimica tridimensionale rielaborata al computer della N,N - dietilparafenilendiammina, il substrato cromogeno del d-ROMs test (brevetto DIACRON International s. a. s., Grosseto, Italia
Prefazione
Lo stress ossidativo costituisce un capitolo relativamente recente della biochimica che, probabilmente
per il suo carattere di “trasversalità” o “interdisciplinarietà”, non ha ancora trovato una sua adeguata e
soddisfacente collocazione in medicina.
E’ noto, infatti, che un’accentuazione dei processi ossidativi, di cui è spesso espressione un’aumentata
produzione di radicali liberi, può accelerare il fisiologico processo dell’invecchiamento e risulta associata ad
almeno 50 patologie, dall’ictus cerebrale all’infarto del miocardio, dal diabete mellito all’obesità, dal morbo di
Parkinson alla malattia di Alzheimer, dal morbo di Crohn all’artrite reumatoide, dall’AIDS al cancro, e così
via.
Tuttavia, al contrario di queste condizioni morbose, abbastanza ben definite sotto il profilo nosografico,
lo stress ossidativo non esibisce una propria sintomatologia, non dà luogo ad un vero e proprio quadro
clinico e, pertanto, al medico che non ne sospetta l’esistenza, non fornisce elementi tali da suggerire un
adeguato approfondimento diagnostico, laddove l’esecuzione di alcune semplici indagini di laboratorio
consentirebbe un immediato inquadramento del problema, evitando al paziente una serie di conseguenze
tali da comprometterne la durata e/o la qualità della vita già nel breve o medio termine.
A rendere più complesso questo quadro – già di per sé poco confortante – c’è da aggiungere che se il
medico, per una serie di ragioni, non sempre è adeguatamente “informato” sull’argomento, l’analista di
laboratorio non è generalmente “attrezzato” per l’esecuzione di test miranti alla valutazione dello stress
ossidativo.
E intanto – paradossalmente – terapisti, farmacisti, allenatori sportivi e persino estetisti continuano a
prescrivere e/o suggerire al soggetto potenzialmente a rischio di stress ossidativo l’assunzione di integratori
ad attività antiossidante. E non importa se quest’ultima sia reale o presunta.
Infatti, secondo una prassi ormai consolidata, non è abitualmente prevista l’esecuzione preliminare di
test di laboratorio, pur disponibili per la routine clinica, per dimostrare – tramite l’identificazione e la
quantificazione nei fluidi extracellulari e/o nei tessuti di adeguati marker biochimici – la necessità oggettiva di
tali formulazioni.
In altri termini, mentre è ormai acquisito che un farmaco ipocolesterolemizzante va assunto solo dopo
che un test abbia documentato inequivocabilmente una condizione di ipercolesterolemia, è diffusa la
tendenza all’uso di antiossidanti anche quando non è necessario, proprio perché non è ancora diventata
buona prassi eseguire preliminarmente una valutazione di laboratorio dello stress ossidativo.
Lo scopo del presente lavoro è quello di fornire una serie di evidenze scientifiche – ormai consolidate
dalla letteratura biomedica – a sostegno del concetto che solo un’adeguata valutazione di laboratorio può
consentire l’identificazione e la definizione circostanziata di una condizione di stress ossidativo e rendere
possibile, quando indicato, il monitoraggio di un’eventuale terapia antiossidante.
Il presente lavoro vuol essere un aiuto per il clinico ed i terapisti in genere, compresi i farmacisti ed i
biologi. Esso non ripropone come un testo esaustivo nel campo della medicina di laboratorio dello stress
ossidativo ma intende fornire semplicemente una breve panoramica riguardo ai più recenti progressi nella
valutazione del bilancio ossidativo. Il più interessante test qui discusso appare essere il d-ROMs test, che
consente la valutazione del livello sierico degli idroperossidi, marker ed amplificatori del danno ossidativo
tissutale. Finora sono stati pubblicati circa un centinaio di lavori, quasi a sottolineare la sua importanza nella
pratica clinica. A questo riguardo si ringraziano per l’aiuto tutti gli Autori degli studi clinici e sperimentali
riportati in questo volume e, in particolare, Mauro Carratelli, l’ “inventore” del d-ROMs test.
Grosseto, 6 marzo 2003 Dr Eugenio Luigi Iorio, MD, PhD
Science Manager Diacron International
3Indice
Indice
Prefazione Pag. 3
Capitolo 1 Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno pag. 5
1. 1 Generalità e definizioni pag. 5
1. 2 Meccanismi di produzione delle specie reattive nei viventi pag. 7
1. 3 Metabolismo delle più importanti specie reattive di interesse biologico pag. 11
1. 4 Il sistema di difesa antiossidante pag. 12
Capitolo 2 Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici. pag. 14
2. 1 Generalità e definizioni pag. 14
2. 2 Basi biochimiche pag. 14
2. 3 Eziopatogenesi pag. 17
2. 4 Stress ossidativo e invecchiamento pag. 19
2. 5 Stress ossidativo e malattie pag. 20
Capitolo 3 Il ruolo del laboratorio nella valutazione dello stress ossidativo. Una overview. pag. 23
Capitolo 4 I test di laboratorio per la valutazione dello status ossidante pag. 25
4. 1 Il d−ROMs test pag. 25
4. 2 Gli altri test pag. 38
Capitolo 5 I test di laboratorio per la valutazione dello status antiossidante pag. 40
5. 1 L’OXY−Adsorbent test pag. 40
5. 2 Il BAP test pag. 43
5. 3 L’-SHp test pag. 44
Capitolo 6 La strumentazione dedicata nella valutazione dello stress ossidativo pag. 47
6. 1 Il sistema FREE pag. 47
6. 2 Il sistema FRAS pag. 48
Capitolo 7 Considerazioni conclusive e linee−guida pag. 50
Capitolo 8 Selezione bibliografica pag. 53
8. 1 Bibliografia generale per autore pag. 53
8. 2 Bibliografia per aree di interesse medico pag. 59
4Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno
Capitolo 1
Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno
1. 1 Generalità e definizioni ossidanti. Infatti, la durata stimata della sua
esistenza è dell’ordine dei nanosecondi.
I radicali liberi o, più semplicemente, radicali, Viceversa, il trifenilmetile [(C6H5)3–C*] è un
sono atomi o raggruppamenti di atomi aventi in uno radicale che, in opportune condizioni, può essere
degli orbitali esterni delle specie che li persino isolato in soluzione, proprio per la sua
costituiscono uno o più elettroni spaiati, relativa stabilità o inerzia chimica. Lo stesso
indipendentemente dalla carica elettrica espressa; radicale catione della N,N-
per esempio, il radicale della N,N- dietilparafenilendiammina, appena citato,
dietilparafenilendiammina, il substrato cromogeno costituisce un esempio di radicale relativamente
del d-ROMs test (vedi in seguito), è un classico stabile (figura 1. 1).
esempio di radicale catione, cioè carico I radicali liberi vengono classificati sulla base
positivamente (figura 1. 1). della natura dell’atomo al quale appartiene
l’orbitale con l’elettrone spaiato. Esistono, quindi,
radicali liberi centrati sull’ossigeno, sul carbonio,
sull’azoto, o sul cloro, solo per citare quelli di più
Ne O O
H immediato interesse in patologia umana.
Nella presente trattazione, tuttavia, si farà
Un atomo di Ne Un atomo di O Il radicale idrossile (*OH)
riferimento prevalentemente ai radicali liberi
Solo elettroni appaiati Due elettroni spaiati Un elettrone spaiato centrati sull’ossigeno, noti più semplicemente come
Atomo (stabile) Radicali liberi dell’ossigeno (instabili)
CH 3-CH 2 radicali liberi dell’ossigeno.
+
N NH2
Quest’ultimo, infatti, oltre ad essere uno degli
CH 3-CH 2
Il radicale catione della N,N-dietilparafenilendiammina elementi quantitativamente più importanti della
(il substrato cromogeno del d-ROMs test)
Un esempio di radicale relativamente stabile materia vivente, nonché la fonte primaria della vita
stessa, attraverso una serie di meccanismi – non
Figura 1. 1 Atomi e radicali ultimo la stessa respirazione cellulare – induce
continuamente la formazione di specie chimiche
In funzione della distribuzione della carica con caratteristiche di reattività.
(nube elettronica) e/o del proprio potenziale di A tal riguardo, occorre sottolineare che i
ossido-riduzione, i radicali liberi presentano una radicali liberi dell’ossigeno rientrano nella più
reattività più o meno spiccata, legata alla tendenza grande famiglia delle specie reattive dell’ossigeno
spontanea ad esistere come entità aventi tutti gli (reactive oxygen species, ROS).
elettroni disposti in coppie, condizione che Con questo termine si intende una classe di
corrisponde alla stabilità o inerzia chimica. Ne specie chimiche reattive derivate dall’ossigeno, di
deriva che non tutti i radicali sono ugualmente natura non necessariamente radicalica, tutte
reattivi. In genere, quanto più è elevato il rapporto accomunate dalla tendenza più o meno spiccata ad
fra carica e volume, tanto più un radicale libero è ossidare vari substrati organici (carboidrati, lipidi,
reattivo e, pertanto, tenderà a raggiungere la amminoacidi, proteine, nucleotidi, ecc.).
propria stabilità strappando elettroni a qualsiasi Classici esempi di ROS di natura radicalica
specie chimica con la quale viene a contatto, sono l’ossigeno singoletto e il radicale idrossile.
ossidandola (compatibilmente con il suo potenziale L’ozono ed il perossido di idrogeno, invece, sono
di ossido-riduzione) (figura 1. 2). specie reattive non radicaliche dell’ossigeno.
I radicali liberi, comunque centrati, possono
essere generati attraverso diversi meccanismi e,
una volta formati, danno luogo generalmente ad
ossidazione Elettrone spaiato una serie di reazioni a catena, nel corso delle quali
il sito radicalico può essere trasferito o,
A + C C A + C C eventualmente, inattivato.
Radicale libero Molecola bersaglio Nuova molecola Nuovo radicale
Si distinguono, pertanto, tre step nelle reazioni
(ossidante) (es. doppio legame C -C) (ridotta, stabile) (ossidato, instabile)
radicaliche a catena: inizio, propagazione e termine
(figura 1. 3).
Figura 1. 2 I radicali liberi agiscono come ossidanti
In tal senso, il radicale ossidrile (HO*) è uno
dei radicali liberi più instabili e, quindi, reattivi ed
5Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno
Fotolisi/
pirolisi
Interazione con
metalli di transizione
Scissione
di perossidi
Scissione di
azocomposti
particolari molecole con alcuni metalli di transizione
A:B : OBFe : OR RN : : NR
Inizio +hν
AO 2+
RO
+hν – N2
(figura 1. 5).
Fe 3+
A • + •B AO • + OB - RO• + •OR R • + •R
Trasferimento Addizione Frammentazione Ri-arrangiamento
A• R• R:C – C*= R:C – C*= Men+1 Men
-
R:H
Propagazione CH2 =CH–
=C = C =
A B A + B
A:H
R• R–CH 2 –CH* – R• =C* – C:R Molecola Radicale libero Anione
Combinazione Disproporzione
A• + • B
Men Men+1
–C• – –C•– +
+
Termine –C– –C– A B A + B
– C= –C–
+ Molecola Radicale libero Catione
A:B – C= –C–
Figura 1. 3 Schema delle reazioni radicaliche a catena
Figura 1. 5 Interazione con metalli di transizione
I principali meccanismi attraverso cui si
generano i radicali liberi – step 1, reazione di inizio Nell’interazione con i metalli di transizione,
– sono la scissione omolitica e l’interazione con i l’elettone generato dall’ossidazione di un metallo di
metalli di transizione. transizione in forma ionica (es. da Fe2+ a Fe 3+ o da
Con il termine di scissione omolitica si intende Cu+ to Cu 2+) spezza un legame covalente di una
la divisione di una molecola a livello di uno dei suoi molecola bersaglio, generando così un radicale
legami covalenti per effetto della somministrazione libero e un anione.
di energia (termica, pirolisi, o radiante, radiolisi) Alternativamente, l’elettrone richiesto per
con generazione di due nuove specie ridurre un metallo di transizione in forma ionica (es.
chimiche, ciascuna con un elettrone spaiato, da Fe3+ a Fe 2+ o da Cu2+ to Cu +) viene estratto dal
elemento distintivo dei radicali liberi (figura 1. 4, legame covalente di una molecola bersaglio, che si
A). decompone in un radicale libero ed un catione.
Attraverso questo meccanismo, per esempio,
il ferro (Fe2+/Fe3+) o il rame (Cu +/Cu2+) agiscono da
A catalizzatori in una sequenza di reazioni di ossido-
A B Energia A + B
riduzione generando radicali alcossilici (RO*) e
Molecola Radicale libero 1 Radicale libero 2 perossilici (R–O–O*) a partire dai perossidi
(R–O–O–R).
B + - Nel caso più semplice – descritto per la prima
H Cl Acqua H + Cl volta da Fenton – uno ione ferroso (Fe2+),
Molecola Catione Anione
ossidandosi a ione ferrico (Fe3+), cede il suo
elettrone ad una molecola di perossido di idrogeno
(H2O2) e ne scinde uno dei legami covalenti,
Figura 1. 4 Scissione omolitica (A) e ionizzazione (B) generando un radicale libero (il radicale idrossile,
HO*) ed un anione (ione ossidrile).
E’ bene sottolineare che la scissione omolitica A sua volta, lo ione ferrico (Fe3+) si riduce –
è ben diversa dalla ionizzazione che si osserva, rigenerandosi come qualsiasi catalizzatore – a
per esempio, dopo aver disciolto in acqua molecole 2+
ione ferroso (Fe ), strappando un elettrone da una
aventi almeno un legame covalente polarizzato (es. seconda molecola di perossido di idrogeno, che è
HCl). In questo caso, le molecole d’acqua, a causa scissa in un radicale libero (un radicale peridrossile
della loro polarità e, dunque, senza alcuna (HOO*), e un catione (uno ione idrogeno, H+)
somministrazione di energia, riescono a spezzare (figura 1. 6).
uno dei legami covalenti polarizzati della molecola
di soluto generando due specie chimiche caricate
di segno opposto, un catione ed un anione (H+ e OH-
-
Cl , rispettivamente, nell’esempio considerato)
H-O-O-H H-O*
(figura 1. 4, B). Perossido di Radicale
E’ evidente che nella ionizzazione, al contrario idrogeno
Fe2+ Fe3+ idrossile
della scissione omolitica, il doppietto elettronico di
legame della molecola originaria non viene H-O-O* H-O-O-H
separato ma resta come tale in una delle “neonate” Radicale Perossido di
peridrossile idrogeno
specie ioniche (l’anione). H+
Un classico esempio di scissione omolitica è la
radiolisi o fotolisi dell’acqua che genera un atomo Figura 1. 6 Decomposizione del perossido di idrogeno
di idrogeno ed un radicale idrossile (vedi più
avanti). Allo stesso modo, anche gli idroperossidi sono
Oltre che per scissione omolitica, i radicali liberi scissi, per azione catalitica del ferro, in radicali
possono essere prodotti in seguito all’interazione di alcossilici (RO*) e perossilici (ROO*) (figura 1. 7).
6Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno
radicali liberi reagiscono tra loro dando luogo ad
OH- una molecola non più reattiva (figura 1. 9).
R-O-O-H R-O*
Idroperossido Radicale
alcossile
Fe2+ Fe3+
R-O-O* H-O-O-H R + R1 R R1
Radicale Idroperossido
(idro)perossile Radicale libero 1 Radicale libero 2 Nuova
H+ (ossidante) (antiossidante ) molecola
Figura 1. 7 Decomposizione degli idroperossidi
In assenza di catalizzatori, la scissione dei Figura 1. 9 Reazione di combinazione
perossidi – che dà luogo ad un’unica specie
radicalica, quella alcossilica – può avvenire solo in Il primo radicale agisce come ossidante,
seguito a somministrazione di energia (figura 1. 3). mentre il secondo si comporta come un generico
Un’ultima modalità di formazione di radicali antiossidante (vedi appresso).
liberi, tra quelle di maggiore rilevanza biologica, è Questo meccanismo viene sfruttato per
la decomposizione degli azocomposti, dalla quale bloccare una reazione radicalica e in generale, un
originano, per sottrazione di azoto molecolare (N2) qualsiasi processo radicalico a catena può essere
radicali alchilici (figura 1. 3). interrotto grazie all’intervento di agenti denominati,
Una volta innescata, una reazione radicalica a genericamente antiossidanti.
catena tende a propagarsi (step 2).
Si distinguono 4 meccanismi fondamentali di 1. 2 Meccanismi di produzione
propagazione delle reazioni radicaliche: delle specie reattive nei viventi
trasferimento, addizione, frammentazione e
riarrangiamento. Negli organismi viventi i ROS sono generati nel
Tra questi, il più comune nell’ambito delle corso della normale attività metabolica cellulare;
reazioni radicaliche è il trasferimento. In questa alcuni agenti esogeni, tuttavia, possono
modalità, il radicale libero – generato da una delle incrementarne la produzione, anche con
precedenti reazioni di inizio – attacca una molecola meccanismo diretto (figura 1. 10).
sottraendo ad essa uno dei suoi atomi
(generalmente un atomo di idrogeno). Il risultato
finale è la formazione di una nuova specie reattiva
e, in pratica, il trasferimento del sito radicalico Agenti Metabolismo
(figura 1. 8A). esterni cellulare
Produzione
A
di ROS
A + R H A H + R
Radicale libero Molecola Nuova Nuovo radicale
(ossidante) bersaglio molecola (ossidante)
B
Figura 1. 10 Meccanismo generale di produzione dei ROS
O H + R H R + H O H
E’ possibile individuare almeno 5 fonti
Radicale Substrato Radicale
ossidrile organico alchile
Acqua
metaboliche primarie di radicali liberi, in rapporto al
sito cellulare prevalentemente interessato nella
Figura 1. 8 Reazione di trasferimento
produzione dei ROS stessi: la plasmamembrana, i
mitocondri, i perossisomi, il reticolo endoplasmatico
Con questo meccanismo, per esempio, il liscio (microsomi) e il citosol. E’ bene precisare che
radicale ossidrile (HO*) attaccando una molecola in ciascuna di queste sedi i ROS vengono prodotti
organica (R-H), strappa a questa un atomo di o spontaneamente o per effetto di reazioni
idrogeno, generando, accanto ad una molecola catalizzate da enzimi o da metalli di transizione (es.
d’acqua (H 2O), un radicale alchilico (R*) (figura 1. ferro o rame) (figura 1. 11).
8, B). Con questo meccanismo, il sito radicalico si
trasferisce dal radicale ossidrile al radicale alchile.
Infine, una reazione radicalica a catena può
arrestarsi (termine, step 3) o per combinazione o
per disproporzione.
In particolare, nella combinazione, che è la
reazione inversa della scissione omolitica, due
7Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno
dovrebbe concludersi, una volta sintetizzato l’ATP,
con la produzione di H2O (riduzione tetravalente
NADPH ossidasi
Lipoossigenasi
NADH deidrogenasi
Citocromo ossidasi dell’ossigeno molecolare). Tuttavia, già in
condizioni normali, questo processo non è perfetto,
per cui in maniera non facilmente controllabile una
certa quota di elettroni (1-2%) sfugge al sistema di
trasporto dei vari coenzimi (es. ubichinone,
Xantina ossidasi
Aldeide ossidasi
Citocromo P 450
Citocromo b 5
flavoproteine, citocromi, ecc.) e reagisce
direttamente con l’ossigeno molecolare,
generando, così, anione superossido e /o
perossido di idrogeno (riduzione uni- e bivalente
Figura 1. 11 Fonti cellulari primarie di produzione di ROS dell’ossigeno molecolare).
Per avere un’idea di questo processo, si
La plasmamembrana rappresenta una delle consideri che è stato calcolato che durante un
fonti più importanti di ROS, particolarmente (ma esercizio fisico intenso nei muscoli scheletrici, a
non esclusivamente) nei leucociti polimorfonucleati causa dell’intensa stimolazione metabolica
(PMN). Infatti, nella plasmamembrana di queste cellulare la quota di questo shunt elettronico può
cellule sonolocalizzati diversi enzimi, quali la raggiungere il 15% dell’ossigeno utilizzato dai
NADPH ossidasi e le lipoossigenasi, la cui mitocondri.
attivazione si accompagna alla produzione, Il fenomeno della riduzione uni o bivalente
rispettivamente di anione superossido e di dell’ossigeno molecolare avviene, nei mitocondri,
intermedi metabolici con caratteristiche chimiche di senza l’intervento di enzimi, al contrario di quanto
perossidi. osservato in altre sedi cellulari (figura 1. 13).
La NADPH ossidasi è un enzima che catalizza
la formazione di anione superossido da
NADPH(H+) ed ossigeno molecolare, in seguito a Riduzione tetravalente
stimolazione specifica dei PMN, per esempio da 1e - 1e - 1e - 1e -
parte di endotossine, batteri, o anticorpi). O2 O2. H2O2 HO. H2O
La reazione, che avviene verosimilmente in 2 H+ 1H +
due tappe, è resa possibile dall’aumentata
Riduzione Riduzione Riduzione bivalente
disponibilità di NADPH(H+), per l’aumentata univalente univalente
ossidazione del glucosio attraverso lo shunt Riduzione bivalente
degli esosi, e di ossigeno molecolare, nell’ambito
del cosiddetto “respiratory burst” (figura 1. 12).
Figura 1. 13 Modalità di riduzione dell’ossigeno molecolare
1) NADPH + O 2 → NADP* + H + O 2
+ *
In altre parole, da un punto di vista
2) NADP* + O 2 → NADP + O 2
+ *
squisitamente chimico la produzione di radicali
Figura 1. 12 Meccanismo d’azione della NADPH ossidasi liberi nel corso della fosforilazione ossidativa è
esattamente una modalità non enzimatica di
Il sistema della lipoossigenasi, localizzato produzione di specie reattive.
anch’esso a livello della plasmamembrana, In realtà, come si è appenna accennato, la
comprende tre enzimi, la 5-, la 12-, e la 15- generazione di radicali liberi negli organismi viventi
lipoossigenasi, che catalizzano la formazione, a è strettamente legata ai fenomeni vitali e, pertanto,
partire dall’acido arachidonico, del 5-, del 12- e del costituisce un fenomeno “fisiologico” che avviene
15-HPETE, rispettivamente. Queste sostanze sono continuamente nel corso di reazioni di
chimicamente degli idroperossidi acidi, un gruppo ossidoriduzione attraverso meccanismi sia
particolare di ROS spesso indicati con la sigla di enzimatici che non enzimatici.
ROM (reactive oxygen metabolites, cioè metaboliti A questo punto è opportuno sottolineare che,
o derivati reattivi dell’ossigeno). oltre ai mitocondri, esistono anche altre fonti non
La produzione di ROS a livello della enzimatiche di radicali liberi nelle cellule. Per
plasmamembrana dei PMN, per attivazione della esempio, i perossinitriti generano spontaneamente
NADPH ossidasi e/o delle lipossigenasi, avviene, radicale idrossile e radicale nitrossido.
tipicamente, nel corso di processi reattivi (es. Tuttavia, le reazioni non enzimatiche più
infezioni, immunoreazioni patogene, importanti sotto il profilo biologico per la produzione
infiammazioni). di radicali liberi sono quelle catalizzate da metalli di
I mitocondri rappresentano la fonte metabolica transizione. In queste reazioni, che richiedono
primaria di ROS perché sulle loro creste sono generalmente ferro o rame allo stato ridotto
localizzati i complessi enzimatici della catena (rispettivamente Fe2+ e Cu +) il perossido di
respiratoria deputati alla fosforilazione ossidativa. idrogeno (generato attraverso varie metaboliche,
Idealmente, il trasferimento di elettroni dal NAD come si preciserà più avanti) è scisso in radicale
ridotto al citocromo C e da questo all’ossigeno idrossile e ione ossidrile per inglobamento
8Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno
dell’elettrone strappato al metallo di transizione, citocromo P450. Quest’ultimo gioca un ruolo di
che viene rilasciato in forma ossidata primo piano nei processi di detossificazione.
(rispettivamente Fe3+ e Cu 2+), secondo il Il citocromo P450 agisce come donatore
meccanismo sopra discusso dell’interazione con immediato di elettroni in molte reazioni di
metalli di transizione: idrossilazione, in particolare quelle che avvengono
all’interno degli epatociti e che sono finalizzate
all’inattivazione di ormoni (es. steroidei) e composti
→ HO* + OH + Fe
2+ - 3+
HOOH + Fe non fisiologici (xenobiotici, quali tossici e farmaci
oppure
HOOH + Cu → HO* + OH +Cu
+ - 2+ idrofobici che vengono in tal modo resi più solubili
e meno tossici).
Il citocromo P 450 è una proteina a ferro eminico
Analoga reazione subiscono gli idroperossidi, presente non solo nel reticolo endoplasmatico del
che generano il radicale alcossile: fegato ma anche nei mitocondri della corticale del
surrene che, in un processo molto complesso e
non ancora perfettamente chiarito, fa da trait-
→ RO* + OH + Fe
2+ - 3+ +
ROOH + Fe d’union fra l’NADPH(H ) (donatore di elettroni) e
oppure
ROOH + Cu → RO* + OH + Cu
+ - 2+ substrato da idrossilare. In tale complessa reazione
un substrato idrossilabile (SH) reagisce con
NADPH(H+) ed ossigeno molecolare (O 2) per
Gli enzimi che rigenerano metalli di transizione formare il corrispondente derivato idrossilato
allo stato ridotto costituiscono un complesso (S-OH), insieme a NADP+ ed acqua.
indicato con la sigla MCO (sistemi di ossidazione Una produzione di radicali liberi avviene nella
metallo-catalizzata). Essi comprendono la xantina cellula anche nel corso di numerose altre reazioni
ossidasi, la NADPH e la NADH ossidasi, l’acido biochimiche, come ad esempio durante
nicotinico idrossilasi, il sistema del citocromo P450, l’ossidazione dell’ipoxantina a xantina e della
la NADH reduttasi (coenzima chinonico), la xantina ad acido urico, che contrassegnano la fase
succinico-reduttasi (coenzima chinonico) e varie finale del catabolismo dei nucleotidi purinici
proteine a ferro-zolfo non eminico. I chinoni e i (AMP•IMP•inosina•ipoxantina•xantina•acido
gruppi prostetici flavinici ridotti generati da questi urico).
enzimi riducono a loro volta i metalli di transizione, Ambedue le suddette reazioni sono catalizzate
provocando la riduzione diretta dell’ossigeno dalla xantina deidrogenasi, un enzima a molibdeno.
molecolare a radicale idrossile e/o a perossido di In particolari condizioni, come nel corso del
idrogeno (attraverso la mediazione o meno cosiddetto danno da ischemia-riperfusione, la
dell’anione superossido) (figura 1. 14). xantina deidrogenasi è convertita in xantina
ossidasi (probabilmente per clivaggio proteolitico
FH 2 calcio-dipendente). Quest’ultima, utilizzando come
QH2
O2 accettore finale di elettroni direttamente l’ossigeno,
QH*, H- QH*, H- genera perossido di idrogeno e anione
O2* superossido, a partire, rispettivamente,
2H+
x2
Fe(III) dall’ipoxantina e dalla xantina (figura 1. 15).
O2 O2
H2 O 2 Fe(II)
F FH+
Ipoxantina Xantina Xantina Acido urico
*OH + OH- + Fe (III)
Figura 1. 14 Sistemi MCO e ciclo del ferro ← Xantina ossidasi →
H2O + O 2 H2 O2 O2 O2 -
Oltre alla plasmamembrana ed ai mitocondri,
anche i perossisomi rappresentano una fonte
importante di ROS. In questi organuli cellulari,
infatti, avviene un particolare processo di
ossidazione degli acidi grassi, che è diverso da Figura 1. 15 Produzione di ROS dal catabolismo purinico
quello convenzionale (β−ossidazione). Nella prima
tappa di tale sequenza di reazioni, una Altre reazioni che generano radicali liberi sono
flavoproteina estrae una coppia di atomi di descritte nella sintesi delle catecolammine.
idrogeno da una molecola di acido grasso Da quanto esposto finora, si evince che i ROS
attivato(acil-CoA) trasferendola direttamente rappresentano intermedi quasi obbligati del
all’ossigeno molecolare, con formazione di metabolismo cellulare. E poiché la loro produzione
perossido di idrogeno (successivamente inattivato è strettamente legata ai fenomeni vitali, a ragione
dalla catalasi). essi sono stati definiti “insostituibili compagni di
Nel reticolo endoplasmatico (microsomi) la viaggio” della nostra esistenza.
produzione di specie reattive passa attraverso il
9Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno
Appare evidente che in ciascun sito cellulare, maniera sostanziale sulla produzione di radicali
la produzione di specie reattive ha una sua liberi.
specifica funzione. Infatti, è stato riconosciuto che i Fra gli agenti chimici in grado di stimolare la
ROS giocano un ruolo importante “al servizio della produzione di radicali liberi è da citare l’ozono (un
vita” perché sono coinvolti non solo nel ROS) che genera direttamente radicali perossilici
metabolismo cellulare ma anche nei “processi per interazione con composti fenolici.
reattivi”, quali infezioni e infiammazioni. In verità, I due casi finora considerati (radiazioni e
l’anione superossido e gli altri ROS vengono ozono) costituiscono esempi di produzione diretta
generati sulla superficie esterna della di specie reattive.
plasmamembrana dei leucociti attivati. Queste Altri agenti chimici, invece, quali gli idrocarburi
specie reattive attaccheranno componenti estranei aromatici policiclici o taluni farmaci, inducono un
quali batteri indebolendone la parete e rendendoli aumento della produzione dei radicali liberi
più facilmente accessibili alla fagocitosi e, in attraverso un meccanismo indiretto, attivando il
definitiva, alla loro distruzione. Queste attività sistema del citocromo P450 a livello microsomiale.
“immunologiche” si estrinsecano non solo nei Agenti biologici che tipicamente inducono un
confronti di componenti estranei ma anche contro aumento della produzione di ROS per attivazione
componenti “self” quali tessuti o organi trapiantati metabolica specifica sono i batteri, nell’ambito del
(reazione di rigetto). Questa strategia viene anche fisiologico processo di difesa dalle infezioni, e
utilizzata nel corso della guarigione di organi o taluni anticorpi, nell’ambito di alcune reazioni
tessuti soggetti a traumi. Infatti, i leuociti migrano immunopatogene. In questi casi, come accennato
nell’area lesa, si attivano e iniziano a bombardare a proposito della plasmamembrana, sono chiamati
le cellule danneggiate con i radicali liberi che direttamente in causa i PMN. Questi ultimi, infatti,
accelerano la loro distruzione, allontanamento dei possiedono oltre alla citata NADPH ossidasi, una
sottoprodotti di lisi, e il corrispondente recupero serie di enzimi direttamente coinvolti nella
(rigenerazione). produzione e, in parte, inattivazione di specie
La produzione di radicali liberi da parte delle chimiche reattive, quali la superossidodismutasi
cellule può, talvolta, subire un incremento notevole (SOD), la mieloperossidasi (MPx), la catalasi (CAT)
per effetto di stimolazioni esterne. Infatti, agenti e la glutatione perossidasi (GPx) (figura 1. 17).
fisici, chimici e biologici, da soli o in combinazione
tra loro, possono indurre direttamente la Batteri, endotossine , anticorpi NADPH ossidasi
NADPH + O 2 → NADP . + H + + O2.
generazione di ROS o aumentarne la “fisiologica” Ossidazione diretta ↑ Captazione di NADP . + O → NADP + + O .
2 2
produzione attraverso una specifica stimolazione del glucosio ossigeno
metabolica. Superossido dismutasi (SOD)
Generazione di ↑ Disponibilit à di
Tra gli agenti fisici, sono da segnalare le NADPH + H + ossigeno 2 O 2. + 2 H + → H 2 O 2 + O 2
radiazioni ionizzanti e i raggi UV. Ambedue queste
Attivazione NADPH ossidasi
fonti energetiche possono indurre il fenomeno della Mieloperossidasi (MPx)
. HCl + H2O2 → H2O + HClO
scissione omolitica dell’acqua, detto anche radiolisi O2
o fotolisi a seconda del tipo di radiazione coinvolto SOD Catalasi (CAT)
(figura 1. 16). H2O2 2 H2O 2 → 2H 2O + O 2
MPx CAT GPx
Glutatione perossidasi (GPx)
HClO H2O 2 GSH + H2O2 → 2H 2O + GSSG
Figura 1. 17 Produzione reattiva di ROS da parte dei PMN
H R H UV H R + H
La SOD catalizza la trasformazione dell’anione
Acqua Radicale Radicale
superossido in perossido di idrogeno che, a sua
idrossile idrogeno volta, può essere inattivato ad acqua per azione
della CAT o della GPx. Tuttavia, la disponibilità di
cloruri – anche a concentrazioni fisiologiche –
rende il perossido di idrogeno substrato della MPx.
Figura 1. 16 La fotolisi dell’acqua Il risultato finale è la produzione di un agente
altamente ossidante, l’acido ipocloroso (HClO).
In questa reazione la molecola d’acqua Come verrà precisato in seguito, l’HClO può
assorbe energia e la utilizza per scindere uno dei attaccare numerosi substrati organici e, in
suoi due legami covalenti con l’idrogeno: i prodotti particolare, amminoacidi e proteine, per produrre
saranno due radicali liberi, il radicale idrossile e cloroammine, una potenziale fonte di radicali
l’atomo di idrogeno. Considerato che un organismo alcossilici e perossilici.
vivente è costituito prevalentemente da acqua e Infine, giova ricordare che un aumento della
che trascorre gran parte della sua vita sotto l’effetto produzione di radicali liberi può osservarsi in
di radiazioni (UV o ionizzanti che siano) appare situazioni “fisiologiche”, come ad esempio dopo un
evidente quanto questo fenomeno incida in intenso sforzo muscolare o nel corso di numerose
malattie. In quest’ultimo caso, spesso, non è chiaro
10Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno
fino a che punto i ROS siano la causa o l’effetto discussa fotolisi dell’acqua e la decomposizione del
della patologia considerata (vedi più avanti). perossido di idrogeno (figura 1. 20).
Respirazione
1. 3 Metabolismo delle più importanti polmonare O2* H2O H2O2
specie reattive di interesse biologico Reazione di Haber-Weiss
Radiolisi
Reazione di Fenton
Le più comuni specie reattive di interesse O2
Catena
HO* Scissione spontanea HONOO
respiratoria
biologico sono quelle centrate sull’ossigeno, Riduzione univalente
sull’azoto, sul carbonio e sul cloro (tabella 1. 1). Reazione con ozono
RH
Tabella 1. 1 Specie reattive di maggiore interesse biologico Fenoli
Specie chimica Formula Natura Specie chimica Formula Natura H2O
Ozono O3 N-R Ossido nitrico NO* R
*
Anione superossido O2 R Diossido nitrico NO2* R
1
Ossigeno singoletto O2* R (?) Acido nitroso HNO2 N-R
Perossido di idrogeno H2O2 N-R Tetrossido di azoto N2O4 N-R R*
Radicale idrossile HO* R Triossido nitrico N2O3 N-R
-
Radicale alcossile RO* R Perossinitrito ONOO N-R Figura 1. 20 Metabolismo del radicale idrossile
Radicale idroperossile ROO* R Acido perossinitroso ONOOH N-R
2+
Idroperossido ROOH N-R Catione nitronio NO N-R
Semichinone ( CoQ) Q* R Alchil-perossinitrito ROONO N-R Infine, il perossido di idrogeno viene generato
Fenossile (vit E) E-O* R Acido ipocloroso HClO N-R
N-R: specie non radicalica. prevalentemente attraverso meccanismi di tipo
R: specie radicalica. enzimatico e per via enzimatica è generalmente
inattivato o dà luogo alla formazione di specie
Tra le specie reattive primarie dell’ossigeno chimiche più ossidanti (figura 1. 21).
citate nel paragrafo precedente, l’ossigeno
singoletto rappresenta una varietà radicalica che
può originarsi per eccitazione dell’ossigeno Respirazione Superossido Amminoacido
polmonare dismutasi ossidasi
molecolare o per combinazione di radicali
perossilici (figura 1. 18).
Catena Xantina
O2 respiratoria H2O2 Ossidazione mista ossidasi
Riduzione bivalente ipoxantina
Reaz. di Haber-Weiss Catalasi Perossidasi Mieloperossidasi
O2 ROO*
Superossido dismutasi
HO* H2O ClO-
Eccitazione Combinazione
1O
2 Figura 1. 21 Metabolismo del perossido di idrogeno
Le specie reattive primarie dell’ossigeno
possono attaccare qualsiasi substrato organico,
generando specie reattive secondarie, note anche
Figura 1. 18 Modalità di generazione dell’ossigeno singoletto come metaboliti o derivati reattivi dell’ossigeno,
quali gli idroperossidi. Questi ultimi, a loro volta, in
Molto più complessa è, invece, la formazione particolari condizioni, possono dare origine a
dell’anione superossido (figura 1. 19). specie chimiche particolarmente reattive quali i
radicali perossile e alcossile.
Respirazione NADPH Citocromi
polmonare ossidasi P450 e 5 b
Le specie reattive centrate sull’azoto di
maggiore rilevanza biomedica comprendono
Ossidazione mista NADPH Autoossidazione
varietà sia radicaliche che non radicaliche. Fra le
Catena Xantina
prime sono da citare l’ossido nitrico (NO*) e il
O2 respiratoria e Ossidazione mista ossidasi biossido nitrico (NO 2*); fra le seconde, piuttosto
ipoxantina
Riduzione univalente
numerose, ricordiamo, invece, l’acido nitroso e il
perossinitrito.
L’ossido nitrico, un gas considerato per
Reazione di Haber-Weiss O2 Superossido dismutasi
decenni un inquinante ambientale, viene prodotto,
insieme alla L-citrullina, a partire dall’amminoacido
HO* H2O2
L-arginina, in una reazione catalizzata dall’enzima
ossido nitrico sintetasi (nitric oxide synthase, NOS).
Figura 1. 19 Metabolismo dell’anione superossido
Quest’ultimo possiede la singolare proprietà di
ospitare sulla stessa catena polipeptidica due
Il radicale idrossile, noto per la sua enorme domini ad azione catalitica, uno reduttasico ed uno
potenzialità istolesiva, può derivare da un’ampia ossigenasico, e richiede come cofattori NADPH e
serie di reazioni, tra le quali spiccano la già
pteridina ridotta. La NOS esiste in numerose
11Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno
isoforme, alcune costitutive (cellule endoteliali, potenziale tossicità di questa specie reattiva. Infatti,
piastrine, SN) ed altre inducibili (macrofagi, PMN, sebbene il perossinitrito svolga un’importante
cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, epatociti) azione microbicida e tumoricida, la generazione di
-
(figura 1. 22). un eccesso di ONOO si accompagna a lesioni
tissutali di tipo ossidativo. Specificamente, il
perossinitrito è responsabile della nitrazione dei
H2N H2N
+
residui fenolici delle tiroxine, che conduce alla
NH2 O
formazione di nitrotirosina, un marker della tossicità
HN HN
tissutale dell’NO. A pH neutro, il perossinitrito,
genera, a sua volta, l’acido perossinitroso
NOS
NADPH, O 2 , BH4
+ NO (ONOOH). Quest’ultimo può attaccare diverse
H2N H2N
molecole con produzione secondaria di radicale
O O
idrossile ed altri intermedi reattivi. Tuttavia, in
quanto radicale libero, l’NO può anche svolgere
HO HO
L-arginina L-citrullina Ossido nitrico
un’attività antiossidante, come scavenger dei
radicali alcossilici e perossilici. La prevalenza
dell’una o dell’altra azione dipende dalle
Figura 1. 22 Biosintesi del l’ossido nitrico concentrazioni relative delle singole specie reattive
implicate.
Nei sistemi biologici, l’NO agisce come un Oltre alle specie reattive dell’ossigeno e
importante messaggero intra- ed inter-cellulare dell’azoto, assumono rilevante importanza, infine, i
regolando molte funzioni quali la pressione radicali centrati sul carbonio (importanti intermedi
arteriosa, la respirazione, la coagulazione del della per ossidazione lipdica) e le specie reattive
sangue, e alcune attività cerebrali. Esso, inoltre, del cloro (in particolare l’acido ipocloroso,
gioca un ruolo determinante nella difesa dalle responsabile della formazione delle cloroammine).
infezioni batteriche e nella prevenzione dei tumori.
Tuttavia, se generato in quantità abnormi esso è
anche un potente killer cellulare.
1. 4 Il sistema di difesa antiossidante
Nell’NO gli elettroni spaiati del livello
energetico più esterno (cinque appartenenti I ROS sono specie chimiche potenzialmente
all’azoto e sei all’ossigeno) generano una specie lesive. Per questo motivo, gli organismi viventi
chimica non carica, dotata di proprietà hanno sviluppato nel corso di millenni di evoluzione
paramagnetiche e, dunque, un radicale. un complesso sistema di difesa antiossidante,
In quanto radicale libero, l’NO reagisce costituito da un insieme di enzimi, di vitamine, di
rapidamente con altre specie aventi elettroni oligoelementi ed altre sostanze simil-vitaminiche.
spaiati; l’effetto può essere un’ossidazione, una Tali antiossidanti possono essere classificati
riduzione oppure il legame con altre molecole, in secondo diversi criteri: sulla base dell’origine, in
funzione del microambiente (figura 1. 22). endogeni ed esogeni, sulla base della natura
chimica, in enzimatici e non enzimatici, e sulla
base della solubilità, in liposolubili e idrosolubili.
L-arginina Sulla base, invece, del meccanismo d’azione
prevalente, gli antiossidanti fisiologici possono
NO3- NOS essere agevolmente riuniti in 4 gruppi principali:
Redox
L-citrullina antiossidanti preventivi, scavenger, agenti di riparo
pHCapitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno
Gli scavenger, che agiscono attraverso vari antiossidante fisiologico di un organismo. Per
meccanismi, possono essere di natura idrofila esempio, un corretto esercizio fisico o l’adozione di
(albumina, urato, ascorbato, urato) oppure lipofila un regime alimentare corretto ed equilibrato sono
(carotenoidi, vitamina E, ubichinolo). misure di per sé in grado di controllare il
Secondo alcuni ricercatori, gli scavenger metabolismo ossidativo attraverso la riduzione
dovrebbero essere distinti dagli antiossidanti della produzione di specie reattive e l’induzione di
propriamente detti. Infatti, mentre gli scavenger enzimi ad attività antiossidante .
(es. α−tocoferolo) sono agenti che riducono la Il sistema di difesa antiossidante è
concentrazione di radicali liberi rimuovendoli dal regolarmente distribuito nell’organismo, sia a livello
mezzo in cui si trovano, gli antiossidanti (es. extracellulare che a livello intracellulare.
difenilammina), invece, sono agenti che inibiscono A livello dei liquidi extracellulari e, in
il processo dell’autoossidazione, di cui costituisce particolare, nel plasma, l’insieme delle sostanze
un importante esempio l’irrancidimento dei grassi. potenzialmente in grado di cedere equivalenti
Questo fenomeno, ben noto in scienza riducenti (atomi di idrogeno o singoli elettroni) sì da
dell’alimentazione, viene definito autoossidazione soddisfare “l’avidità di elettroni” che rende i radicali
perché avviene attraverso una sequenza liberi instabili costituisce la cosiddetta barriera
autocatalitica di reazioni radicaliche in presenza di antiossidante. Ne fanno parte, nel plasma, tutte le
ossigeno. Alternativamente si può usare il termine proteine e, in particolar modo, l’albumina, la
di perossidazione, in quanto lo stesso processo bilirubina, l’acido urico, il colesterolo, e i vari
genera intermedi con caratteristiche di perossidi antiossidanti esogeni introdotti con l’alimentazione
(R–O–OR) (figura 1. 23). o sotto forma di integratori dietetici (ascorbato,
tocoferolo, polifenoli ecc.). Un ruolo di particolare
RH
*OH importanza è svolto, nel contesto di questa
H2O
RH H2 O
R*
barriera, dai gruppi tiolici (-SH).
R*
O2 All’interno delle cellule il sistema di difesa
ROO* antiossidante ha una sua ben precisa
ROO*
R* compartimentalizzazione (figura 1. 24).
ROOH ROH ROOR
Vitamina E Selenio
RH Acidi grassi poliinsaturi Vitamina E
RH: molecola organica
RO* RO* O2 β-carotene Ubichinone
ROOH : idroperossido
ROO*: radicale idroperossilico
RO*: radicale alcossilico
Figura 1. 23 Il processo di autoossidazione o perossidazione
Glutatione
Vitamina E
Ascorbato
β-carotene
Selenio
Vitamina E,
Attraverso questo processo alcuni grassi alimentari Ascorbato Catalasi
β-carotene
irrancidiscono e le biomembrane degli organismi Figura 1. 24 Compartimentalizzazione dei sistemi antiossidanti
viventi vengono ossidate. Il sistema antiossidante comprende alcuni
enzimi (superossidodismutasi, catalasi e
Gli agenti di riparo comprendono perossidasi) ed una serie di sostanze assunte
esclusivamente enzimi che intervengono dopo che dall’esterno (vitamine e sostanze analoghe ad
il danno da specie reattive si è instaurato. La loro attività antiossidante, quali i polifenoli,
azione – spesso sequenziale – prevede dapprima oligoelementi ecc). Alcuni di questi agenti sono
l’identificazione del segmento molecolare ossidato, liposolubili (es. tocoferoli) e, entrando nella
poi la separazione del frammento ormai compagine delle biomembrane, costituiscono la
inutilizzabile e, infine, la sistensi e l’inserimento di prima linea di difesa contro l’attacco dei radicali
un nuovo segmento in sostituzione di quello liberi. Altri, invece, sono idrosolubili (es. ascorbato)
danneggiato. Appartengono agli agenti di riparo le ed intervengono soprattutto nel contesto della
idrolasi (glicosidasi, lipasi, proteasi), le trasferasi e matrice solubile del citoplasma e degli organuli
le polimerasi, tutte indispensabili per la riparazione cellulari.
del danno da radicali liberi di importanti molecole o
strutture cellulari (es. DNA, membrane, ecc).
Infine, gli agenti di adattamento comprendono
tutte quelle sostanze o tecniche o procedure
attraverso le quali è possibile potenziare il sistema
13Capitolo 2. Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.
Capitolo 2
Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.
2. 1 Generalità e definizioni stress ossidativo e le relative implicazioni sul piano
diagnostico e terapeutico.
Lo stress ossidativo è una particolare Comunque determinatasi, infatti, l’eccessiva
condizione indotta da un’accentuazione in senso produzione di specie reattive, non più
pro-ossidante dell’equilibrio dinamico fra processi adeguatamente controllata dai sistemi di difesa
ossidativi e riduttivi che hanno luogo antiossidanti, provoca una serie di alterazioni
continuamente in ogni cellula, quale espressione funzionali e strutturali della cellula, che possono
fisiologica delle complesse trasformazioni condurre all’apoptosi o addirittura alla necrosi
biochimiche del metabolismo terminale. (tabella 2. 1).
Sulla base di questo tentativo di inquadrare un
aspetto della biochimica dinamica che è tuttora Tabella 2. 1 Alterazioni biochimiche cellulari nello s. ossidativo
• Perossidazione biomolecole (glicidi, lipidi, amminoacidi, nucleotidi…)
oggetto di ampio dibattito fra i ricercatori, lo stress • Ossidazione e deplezione di GSH
ossidativo si configura come un fenomeno che • Ossidazione dei tioli proteici
• Ossidazione dei nucleotidi piridinici
riguarda, almeno in prima battuta, la singola cellula • Lesioni del DNA ed attivazione della poli(ADP-ribosio)polimerasi
che, per effetto della propria attività metabolica, • Alterazioni dei meccanismi di trasduzione del segnale
non di rado sotto lo stimolo di agenti ad essa • Alterazioni dell’omeostasi ionica
• Alterazioni del citoscheletro
esterni, è costretta a subire gli effetti • Inibizione della glicolisi
potenzialmente lesivi di una serie di reazioni • Deplezione di NAD +
indesiderate che accompagnano quei processi • Caduta del potenziale di membrana mitocondriale
• Deplezione di ATP
ossidativi da cui dipende la sua stessa esistenza. • Aumento della permeabilità della membrana plasmatica
2. 2 Basi biochimiche Sul piano generale, queste lesioni – dapprima
cellulari e poi tissutali – saranno responsabili,
I ROS rappresentano una minaccia mortale infine, di patologie d’organo, quali ad esempio il
per la vita della cellula che ne tiene sotto controllo morbo di Crohn o la pancreatite, oppure di
la produzione grazie ad un efficiente sistema di condizioni sistemiche, quali l’invecchiamento
difesa. Tuttavia, in particolari condizioni, quando la precoce, l’aterosclerosi e così via.
produzione di ROS è eccessiva e/o la capacità di Comunque, va sottolineato ancora una volta
smaltire questi ultimi si riduce, la cellula è costretta che non sempre è possibile stabilire se i radicali
a subire il danno da radicali liberi. liberi sono la causa oppure l’effetto delle lesioni
Trasferendo il discorso all’intero organismo, osservate.
possiamo definire lo stress ossidativo come una Le principali cause di aumentata produzione di
particolare forma di stress chimico indotto dalla ROS sono da individuarsi in fattori ambientali,
presenza di una quantità eccessiva di specie situazioni fisiologiche, stile di vita, fattori
reattive per un’aumentata produzione delle stesse psicologici, malattie e fattori iatrogeni, ecc. (tabella
e/o per una ridotta capacità di smaltirne le quantità 2. 2).
comunque prodotte ( figura 2. 1).
Tabella 2. 2 Cause di aumentata produzione di specie reattive
Radiazioni,farmaci, metalli pesanti Ridotta assunzione Eziologia Examples
Fumo di sigaretta, alcool, inquinamento e/o diminuita sintesi
Esercizio fisico inadeguato, sedentarietà e/o ridotta capacità di utilizzazione Fattori ambientali Radiazioni, inquinamento
Infezioni ed altre malattie e/o aumentato consumo di antiossidanti Stati fisiologici Gravidanza (?)
Stile di vita Alimentazione, alcool, fumo, esercizio fisico incongruo
Fattori psicologici Stress psico-emotivo (?)
Malattie Traumi, infiammazioni, infezioni, vasculopatie, neoplasie
Specie reattive ↑ Difese antiossidanti ↓ Fattori iatrogeni Farmacoterapia, radioterapia, raggi X
Danno cellulare
Bisogna sottolineare che il fumo di sigaretta,
l’abuso di alcool ed altri fattori correlati con lo stile
Malattie Demenza, Invecchiamento Infiammazioni, Altre di vita sono responsabili dell’aumento della
cardiovascolari M. di Parkinson precoce tumori malattie
produzione di ROS. Lo stesso effetto è indotto da
Figura 2. 1 Eziopatogenesi schematica dello stress ossidativo
un’attività fisica incongrua (eccessiva o
insufficiente). Infine, è riconosciuto il ruolo dei
numerose malattie, su base disreattiva o infettiva
E’ ovvio che il discorso è ben più complesso, (es. artrite reumatoide e infezioni batteriche) nel
ma il concetto appena esposto è sufficiente per favorire l’incremento dei ROS.
comprendere i principali aspetti fisiopatologici dello Una riduzione delle difese antiossidanti è da
imputarsi sostanzialmente ad un deficit assoluto o
14Capitolo 2. Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.
relativo di antiossidanti, comunque determinatosi.
In tale contesto, alcune malattie, quali la celiachia, R–H + HO* → R* + H 2O
possono provocare uno stress ossidativo riducendo R* + O2 → ROO*
la disponibilità di antiossidanti assunti con
l’alimentazione (tabella 2. 3). ROO* → ROOH + R 1*
Tabella 2. 3 Cause di ridotte difese antioossidanti R1* + R 1* → R 1*–R1*
Eziologia Esempi
Ridotta assunzione di AO Ipovitaminosi, diete monotone Figura 2. 3 Reazioni radicaliche e produzione di perossidi
Ridotto assorbimento di AO Sindromi da malassorbimento, celiachia
Ridotta capacità di utilizzazione di AO Deficit dei mec. di captazione e/o trasporto
Insufficienza dei sistemi enzimatici AO Fattori genetici e/o iatrogeni Il radicale *OH, avendo un elettrone spaiato, è
Eccessivo consumo di AO Eccessiva produzione di specie reattive
Assunzione di farmaci Sovraccarico del sistema microsomiale molto reattivo e, giunto a contatto con il substrato
Malattie Vari R-H, strappa a quest’ultimo un atomo di idrogeno
AO: antiossidanti
per raggiungere la sua stabilità.
A proposito delle malattie, va precisato che In questo modo, però, il sito radicalico è ora
esse alcune di esse si accompagnano ad trasferito al substrato che si trasforma in radicale
un’aumentata produzione di specie reattive, altre R*. Quest’ultimo, in presenza di ossigeno
ad una riduzione delle difese antiossidanti, altre molecolare, è convertito in radicale (idro)perossile
ancora, infine, alla combinazione di ambedue i ROO*, un nuovo radicale che, a sua volta, può
meccanismi. attaccare un altro substrato organico R1H
Spesso, tuttavia, non è chiaro se i radicali liberi trasformandosi in idroperossido ROOH.
La reazione a catena ormai innescata
ne siano la causa oppure l’effetto o addirittura un
continuerà a partire dall’ultimo radicale generato
semplice epifenomeno.
(R1*), fino a quando non interverrà un meccanismo
Dal punto di vista biochimico, considerando il
di terminazione (es. reazione di combinazione, R1*
fenomeno all’interno della cellula, è indubbio che
+ R 1*, per produrre R1-R1) oppure un antiossidante.
all’origine delle alterazioni funzionali e strutturali vi
è un aumento della produzione di specie reattive Il fenomeno della perossidazione – è bene
per stimolazione parziale o generalizzata del ribadirlo – non è esclusivo dei lipidi, ma può
metabolismo, spesso sotto la spinta di fattori interessare qualsiasi substrato organico, dagli
esogeni. I ROS, resisi disponibili in grandi quantità, amminoacidi alle proteine, dai carboidrati ai
sono in grado di attaccare qualsiasi substrato con il nucleotidi.
quale giungono a contatto, strappando ad essi Non v’è dubbio, tuttavia, che i lipidi,
l’elettrone o gli elettroni necessari per raggiungere specialmente se insaturi, e, quindi, con doppietti di
la propria stabilità. Ciò, a sua volta, innesca legame “disponibili” a soddisfare l’avidità di
processi radicalici a catena che, se non bloccati elettroni dei radicali liberi, costituiscano target
importanti dell’attacco ossidativo, in particolar
tempestivamente, possono provocare gravi
modo se inseriti nel contesto di biomembrane e,
conseguenze sul piano, dapprima funzionale, poi
anche strutturale (figura 2. 2). come tali, maggiormente esposti all’azione
radicalica.
Agenti esterni, attività metabolica La perossidazione lipidica segue lo schema
Anione superossido O 2.
Ossigeno singoletto 1O2 generale delle reazioni radicaliche appena
Radicale idrossile HO*
Radicale peridrossile HO 2*
Perossido di idrogeno H2O 2 discusso, con la variante che, se ad essere colpito
è un acido grasso poliinsaturo, quale l’acido
Substrati organici RH (glicidi, lipidi,
amminoacidi, nucleotidi , etc.) arachidonico, ad essere attaccato dal radicale
Metallidi transizione/ Metallidi transizione/ istolesivo HO* è uno dei doppi legami C-C.
Sistemi enzimatici Sistemi enzimatici
Idroperossido R-OOH In questo caso specifico, la sottrazione di un
Radicale alcossile R-O*
Radicale idroperossile R-OO* atomo di iidrogeno da parte del radicale idrossile
Superamento difese
antiossidanti genera un radicale centrato sul carbonio, che
Alterazioni funzionali e/o strutturali della cellula rapidamente va incontro ad una redistribuzione dei
Figura 2. 2 Patogenesi dello stress ossidativo: aspetti biochimici doppi legami trasformandosi in diene coniugato.
Quest’ultimo, in presenza di ossigeno si trasforma
Fra i vari meccanismi cito- ed isto-lesivi in radicale perossilico.
assume rilevante importanza quello correlato con Il radicale perossilico corrispondente
la formazione degli idroperossidi (ROOH), una rappresenta un composto chiave in questa
classe di derivati o metaboliti reattivi dell’ossigeno sequenza di reazioni, perché può essere non solo
(reactive oxygen metabolites, ROM). trasformato in idroperossido, ma andare incontro,
Questo meccanismo, tipico delle reazioni per la sua peculiare struttura chimica, ad ulteriore
radicaliche a catena, viene innescato dall’attacco, degradazione fino a malonildialdeide e, infine, a
da parte di un ROS (per esempio, il radicale pentano, se sono disponibili ulteriori donatori di
istolesivo *OH), di un generico substrato organico idrogeno (e, in ultima analisi, fino a completa
R-H (es. un glicide, un lipide, un amminoacido, un utilizzazione del sistema antiossidante) (figura 2.
nucleotide ecc.) (figura 2. 3). 4).
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