Abstract per il Premio Bernardo Nobile - Edizione 2012

Abstract per il Premio Bernardo Nobile - Edizione 2012
Computational and crystallographic studies of zinc-containing
                    enzyme inhibition

                               Antonella Di Pizio

  Le metalloproteinasi giocano un ruolo importante in svariati processi fisio-
logici e patologici, rappresentando, così, interessanti target terapeutici. In modo
particolare, il lavoro di tesi presentato è stato focalizzato sulle Metalloproteinasi
di Matrice (MMP) e sull’Anidrasi Carbonica II (CA II).

MMP

Le MMP sono zinco-proteasi implicate nella degradazione della matrice ex-
tracellulare. Vengono overespresse in patologie quali cancro, infiammazioni
croniche, aterosclerosi, etc.1 Proprio per l’accertato coinvolgimento delle MMP
in numerosi processi patologici molti gruppi di ricerca si sono concentrati
nella ricerca di inibitori per questi enzimi. La maggior parte degli inibitori
noti contiene un gruppo legante lo zinco (GLZ)2 , responsabile dell’attività
ma anche della scarsa selettività di questi composti e, di conseguenza, degli
effetti collaterali riscontrati durante le prove cliniche. Recentemente sono stati
brevettati per l’MMP-3, MMP-8, -12 and -13 nuovi inibitori che, pur non
contenendo il GLZ, hanno mostrato una migliore selettività, un migliore profilo
farmacocinetico e una migliore biodisponibilità. Questi promettenti risultati
hanno aperto una nuova strada per lo sviluppo di inibitori delle MMP da
utilizzare in terapia. L’oggetto di studio del mio dottorato si è concentrato su
questa classe di inibitori, andando ad analizzare il processo di legame di questi
composti con le MMP target e cercando nuove classi strutturali.
   Il lavoro sperimentale è stato preceduto da un’ampia ricerca bibliografica
per coprire tutto lo stato dell’arte a disposizione sulle MMP. Il frutto di questa
ricerca è riportato nel secondo capitolo della tesi, dal titolo Matrix Metallo-
proteinases (MMPs). Questo capitolo è diviso in due sezioni, MMP en-
zyme system e Matrix Metalloproteinase Inhibitors (MMPIs): nella
prima parte sono riportate le principali informazioni sugli enzimi oggetto di
studio a partire dalle loro funzioni, alla loro stuttura e meccanismo d’azione;
mentre nella seconda sezione è stata focalizzata l’attenzione sugli inibitori
sviluppati, partendo dai primi composti peptidici (inibitori di prima gene-
razione) fino ad arrivare ai più recenti (composti contenenti nuovi gruppi
leganti lo zinco e inibitori di terza generazione). Su queste ultime classi di

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composti è stata dedicata un’attenzione particolare: sono stati riportate le
strutture e l’attività di tutti i nuovi composti pubblicati, sia in articoli che in
brevetti, in modo da sottolineare ed evidenziare le proprietà strutturali che ne
determinano la potenza e la selettività.
   I principali progetti di ricerca, qui di seguito sintetizzati, sono riportati nel
terzo, quarto e quinto capitolo della tesi.
   • Il capitolo terzo, dal titolo Virtual screening aimed at the identi-
fication of non-zinc-binding MMP-2 inhibitors, riporta uno screening
virtuale finalizzato all’identificazione di inibitori di terza generazione per l’MMP-
2. Questo progetto è partito dall’osservazione che molte interazioni istaurate
da inibitori non leganti lo zinco con l’MMP-8 potrebbero mantenersi anche
nell’MMP-2. Queste possibili interazioni sono state utilizzate per costruire
un modello farmacoforico, che combinato al docking, è stato usato per lo
screening virtuale. In particolare, il farmacoforo è stato costruito basandoci
sulla struttura di un composto recentemente brevettato come inibitore delle
MMP5 e poi co-cristallizzato con la MMP-86 . Un database di circa 300000
composti è stato preparato generando tautomeri, protomeri e stereoisomeri
e filtrato per proprietà: la nota Regola del cinque di Lipinski3 è stata usata
per predire la biodisponibilità orale, ma anche altre importanti proprietà sono
state usate per questo filtro, come la “polar surface area” (PSA) e il numero di
legami rotabili4 . Le strutture risultanti sono state poi sottoposte allo screening
viruale. 24 composti sono stati selezionati e testati con saggi di inibizione
enzimatica. Da questo screening 3 hits, con peso molecolare da 284 a 385
g/mol, hanno mostrato un’attività micromolare nei confronti dell’MMP-2 e
dell’MMP-13 e una certa selettività verso l’MMP-8. Le tre hits, avendo una
differente struttura e un basso peso molecolare, sono canditati idonei per un
futuro lavoro di ottimizzazione fornendo l’opportunità di sviluppare attivi e
selettivi inibitori anche per l’MMP-2, un target implicato nella cancerogenesi e
quindi di rilevante importanza per la terapia antitumorale.
   • Il capitolo quarto, dal titolo An integrated computational approach
for interpreting activity of known third generation MMP inhibitors,
descrive l’utilizzo di approcci computazionali per interpretare l’attività di ini-
bitori non leganti lo zinco per l’MMP-2. In questo lavoro abbiamo cercato di
analizzare il processo di inibizione dell’MMP-2 da parte di alcuni inibitori non
leganti lo zinco7 , utilizzando tecniche computazionali quali docking, dinamica
molecolare, integrazione termodinamica e calcoli quanto-meccanici. Le simu-
lazioni di dinamica molecolare ci hanno rivelato l’effetto meccanico-dinamico
prodotto dai ligandi nell’enzima, non analizzabile con il semplice docking. Lo
scopo finale delle simulazioni è stato quello di stimare l’energia di legame per i

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complessi formati dai ligandi analizzati con l’MMP-2. L’integrazione termodi-
namica, insieme a studi quanto-meccanici, ci ha fornito un quadro completo
sul processo di legame tra i ligandi studiati e l’MMP-2 e una interpretazione
per la loro attività.
   • Il capitolo quinto, dal titolo Combined FLAP Model to identify
structurally diverse hits using published non-zinc-binding MMP-13
inhibitors, è un lavoro computazionale che ha combinato l’approccio “ligand-
based” e quello “structure-based” per identificare inibitori non leganti lo zinco per
l’MMP-13. Il modello computazionale usato in questo lavoro è stato generato
con FLAP (Fingerprint for Ligands And Proteins)8 , un software basato sui
campi di interazione molecolare9 , e utilizzando una collezione di circa 200
inibitori non leganti lo zinco noti per l’MMP-13, pubblicati sia su articoli
che su brevetti10 . Il modello ottenuto è altamente predittivo, assicurando
anche un arricchimento in diversità nella selezione. Inoltre ci ha permesso di
utilizzare una grossa libreria di molecole per lo screening virtuale. Un database
di circa 1000000 composti è stato filtrato per proprietà farmacocinetiche a
circa 700000 molecole che sono state poi sottoposte al nostro modello. I 16
composti selezionati sono stati testati con saggi di inibizione enzimatica, che
sono ancora in corso.

CA II

Le Anidrasi Carboniche sono zinco-enzimi presenti in tutti gli eucarioti e in
molti batteri. Catalizzano l’idratazione del diossido di carbonio in bicarbonato
e con tale funzione sono implicati in importanti ruoli fisiologici e in svariate
patologie.11 Inibitori di tali enzimi sono perciò di grande interesse. Nel lavoro
di tesi, nuovi composti sulfamidici sono stati analizzati tramite cristallografia
per determinare il modo in cui essi si legano alla CA II. La cristallografia
macromolecolare è fondamentale per lo sviluppo di potenti inibitori, costituendo
un supporto essenziale per la progettazione di farmaci basata sulla struttura
del target. Il progetto di ricerca è stato svolto nell’Università di Marburg
(Germania) nel laboratorio del Prof. G. Klebe ed è riportato nel sesto capitolo
della tesi.
  • Nel sesto capitolo, dal titolo High resolution crystal structures of
Carbonic Anhydrase II complexed with novel sulfamide binders, è
esposto il lavoro che ha portato all’ottenimento dei complessi tra l’Anidrasi
Carbonica II e nuovi leganti sulfamidici. Le strutture X-ray della CA II
in complesso con cinque nuovi composti sulfamidici sono state determinate
a un’alta risoluzione (da 0.98 a 1.05 Å). Le pose di legame osservate per

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questi ligandi dentro l’enzima sono molto simili: questi composti si legano allo
Zn2+ con l’azoto sulfamidico, inserendo la porzione idrofobica in una tasca
idrofonica e stabilendo legami idrogeno con la Thr199 e la Thr200. Oltre a
indicare le interazioni chiave per l’attività nei confronti della CA II, le strutture
cristallografiche ci hanno fornito una importante informazione riguardo al ruolo
essenziale delle molecole d’acqua nel sito di legame. Comunque, le strutture
cristallografiche devono essere ancora rifinite e solo al termine di questo lavoro
sarà possibile fare un’analisi più dettagliata.

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