Scienze Omiche per una medicina di precisione nel trattamento dei deficit accrescitivi in età pediatrica - Dr.ssa Apollonia Tullo ...
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Scienze Omiche per una medicina di
precisione nel trattamento dei deficit
accrescitivi in età pediatrica
Dr.ssa Apollonia Tullo
a.tullo@ibiom.cnr.it
28-09-2021
Dalla Genetica alla Genomica
Mendel 1866: Eredità dei caratteri
Watson & Crick 1953
Struttura a doppia elica del DNA
Nobel 1962
Mullis - 1990
PCR
Nobel 1993
Sanger
Maxam & Gilbert 1977
Sequenziamento del DNA
Nobel 1980
2
Progetto Genoma Umano
L’obiettivo del Progetto Genoma Umano (Human Genome Project):
era quello di determinare la sequenza completa del genoma umano
Ha avuto inizio nel 1990 presso il National Institutes of Health degli Stati Uniti
La prima bozza del genoma è stata rilasciata nel 2000
La sequenza completa si è avuta nel 2003.
Un progetto parallelo e indipendente dal governo è stato condotto dalla
Celera Corporation.
Il Progetto Genoma Umano ha aperto nuovi scenari e molte possibilità di
ricerca, alcune delle quali intraviste fin dall’inizio, altre manifestatesi
compiutamente nel decennio successivo
3
Contenuto genico
Lievito Verme
Saccharomyces cerevisiae Caenorhabditis elegans
~6500 geni ~19.000 geni
~13x106 basi Uomo ~97x106 basi
32 cromosomi Homo Sapiens 12 cromosomi
~25.000 geni
~3000x106 basi
46 cromosomi
Moscerino della frutta Topo
Drosophila melanogaster Mus Musculus
~15.000 geni ~22.500 geni
~180x106 basi ~3400x106 basi
8 cromosomi 40 cromosomi 4
Contenuto genico
Verme
Caenorhabditis elegans
≅
~19.000 geni
~97x106 basi
12 cromosomi
Uomo
Homo sapiens Topo
~25.000 geni Mus musculus
~3000x106 basi ~22.500 geni
46 cromosomi ~3400x106 basi
40 cromosomi
5
Cadono alcuni dei paradigmi
fondamentali della Biologia Molecolare
ENCODE Project (Encyclopedia of DNA Elements)
La maggior parte del genoma umano è trascritto e ha una
funzione biochimica
• Cade il dogma: UN GENE = UNA PROTEINA
• Cade il dogma: DNA NON CODIFICANTE = DNA INUTILE
6
PRINCIPALE SFIDA DELL’ERA POST-GENOMICA
Capire il significato biologico delle sequenze
LA GENOMICA FUNZIONALE
Regioni di controllo dell’espressione di un gene
regioni del genoma che specificano in quali circostanze, in quale quantità, in quale tessuto una
specifica proteina deve essere prodotta
Uno stesso gene può codificare per più di una proteina con funzioni diverse
uso di promotori alternativi, splicing alternativo, che interessano il 98% delle proteine
Modificazioni chimiche reversibili del DNA (Codice Epigenetico)
La maggior parte delle nostre caratteristiche biologiche dipendono dall’azione
combinata di molti geni e della loro interazione con l’ambiente
≠
Uomo Verme
Homo sapiens Caenorhabditis elegans
~25.000 geni ~19.000 geni
~3000x106 basi ~97x106 basi
46 cromosomi 12 cromosomi
7
RICADUTE TECNOLOGICHE
DEL PROGETTO GENOMA UMANO
Sviluppo di nuove sofisticate tecnologie “high-throughput”
Multidisciplinarietà
8
PRINCIPALE SFIDA DELL’ERA POST-GENOMICA
Capire il significato biologico delle sequenze
LA GENOMICA FUNZIONALE TRASCRITTOMICA
l 'i n s i eme d egl i RNA
EPIGENOMICA prodotti, cioè trascritti
studio dei cambiamenti della dai geni, da una
funzione genica che sono determinata cellula in
mitoticamente o una specifica fase del suo
meioticamente ereditabili e ciclo vitale.
che non implicano un
cambiamento della sequenza la conoscenza del
del DNA trascrittoma di una
cellula o di un tessuto è
i più ampiamente studiati ancora più importante di
sono metilazione del DNA, quella del loro genoma,
l’acetilazione, fosforilazione, Ricerca della funzione dei geni perché è in grado di
metilazione degli istoni catturare un livello di
complessità maggiore
rispetto al genoma
META
BOLO
MICA PROTEOMICA
9
Evoluzione dei sistemi di sequenziamento
dal sequenziamento manuale……
al sequenziamento automatico
Generazione 0 – Sequenziamento chimico
Generazione 1 – Dye-terminator
Generazione 2 – NGS con pre-amplificazione
Generazione 3 – NGS su singola molecola
10High-quality and high-throughput Single- cell molecular analysis
massively sequencing platforms platforms Complementary
platforms for NGS
technologies
BD FACSMelody™ 10X Genomics
PacBio GridION cell sorter Chromium Controller
NovaSeq Nanopore Bionano Genomics®
Automated liquid Saphyr™
handling systems Genomic and transcriptomic
data validation platforms
OMNIA
CNR.BiOmics
NGS STAR Potenziamento nodo
italiano ELIXIR
Metabolomics and Genetic Analyzer QuantStudio™
Proteomics Platforms 3500DX 12K Flex
Orbitrap Fusion™
ICT Facility
Hardware
Storage big data
Database
nLC-MS LTQ XL 11Single- cell molecular analysis platforms
10X Genomics Chromium Controller
12Campi applicativi delle piattaforme NGS
Sequenziamento
mirato di un
subset di geni
DNA antico Sequenziamento
Genomi e
Biodiversità
Trascrittomica
• Interaz. DNA-protein (ChIp-seq)
• Accessibilità cromatina (ATAC-seq)
• Organizzazione spaziale cromatina Metagenomica-
Microbioma
• Epigenetica
approccio basato sull'utilizzo di tecniche
Alterazioni genomiche moderne per lo studio di comunità
genomiche microbiche direttamente nel loro ambiente
naturale, evitando così il problema del
prelevamento e coltivazione in laboratorio. 13Applications
Total RNA and mRNA Sequencing
Targeted RNA Sequencing
Small RNA and Noncoding RNA Sequencing
Ribosome profiling
14RICADUTE DEL PROGETTO GENOMA UMANO
NELLA MEDICINA
Parallelamente lo studio delle malattie genetiche cambia
MALATTIE MONOFATTORIALI MALATTIE MULTIFATTORIALI
determinate dalla disfunzione di un solo gene determinate dalla disfunzione di
molti geni diversi
MEDICINA BASATA SU APPROCCI MEDICINA PERSONALIZZATA
“TRIAL AND FAILURE”
E’ IL PATRIMONIO GENETICO DEL SINGOLO INDIVIDUO CHE DETERMINA COME LO
STESSO RISPONDE A STIMOLI AMBIENTALI O A FARMACI
L’interazione tra geni e ambiente è l’essenza della Medicina Personalizzata
15MEDICINA PERSONALIZATA
“è più importante conoscere che tipo di persona ha una malattia,
piuttosto che conoscere il tipo di malattia che una persona ha”
Ippocrate
16Applicazioni sequenziamento NGS: dalla
ricerca di base alla diagnostica
17Majewski osteodysplastic primordial dwarfism type II
(MOPD)…. il fenotipo….
Majewski Osteodysplastic Primordial Dwarfism, Type II (MOPD II), è stata descritta
per la prima volta nel 1971, è una malattia recessiva rara autosomica.
Caratteristiche di questa sindrome includono grave ritardo di crescita intrauterino
proporzionale (IUGR), scarsa crescita postnatale con statura adulta di circa 100
cm.
Øfronte prominente,
Øorecchie a basso impianto e malformati,
Ømicrognazia,
Ølabio / palatoschisi, e un naso corto e piatto;
Øtorace estremamente corto e stretto, con un addome prominente
Øipoplasia o aplasia delle unghie
Øpelle secca,
Øcisti renali,
Øanomalie genitali,
Øfibrosi pancreatica,
Øle anomalie cerebrali (arinencefalia, ipoplasia del verme, cisti aracnoidea,
disgenesia cerebrale),
Øipoplasia epiglottide,
Øanomalie cardiovascolari (difetti del setto atriale).
La morte avviene nel periodo perinatale.
18Majewski osteodysplastic primordial dwarfism
type II (MOPD II)… il genotipo….
MOPD II è causata da mutazioni loss-of-function nel gene
PCNT codificante per la pericentrina una proteina
centrosomica: (chromosome 21q22)
Recluta proteine come la gamma tubulina per
l’organizzazione del fuso mitotico
Gioca un ruolo nella regolazione del ciclo cellulare mediante
la sua interazione con ATR pathway
19Obiettivo dello studio
Sindrome di Majewski: monogenica o
poligenica?
Approccio multi-omico - studio dell’esoma e
del trascrittoma
20Case report
Male infant 6 years and 7 months old
Height: 63 cm (-10.3 SDS)
Weight: 4.860 gr (-22.1 SDS)
head circumference: 41 cm (-8 SDS)
Mutation: c.3608-2 A G introne 18
splice site
2122
Risultati exome sequencing
605 Varianti in hom nel
paziente 1 e in almeno uno
degli altri pazienti
347 quelle presenti in
regioni codificanti
187 sinonime 149 non 2 Perdita stop 1 stop codon
8 frameshift
sinonime codon
41 non sinonime
comuni nei 3 bambini
23Risultati RNA sequencing
IGF1R, IGF2R, CREBBP e RAF1 appaiono downregolati nei soggetti
analizzati. Tali risultati sono stati validati con esperimenti di RT-qPCR
24Conclusioni
• riduzione di espressione IGF1R, IGF2R, RAF1
• analisi dell’esoma ci hanno permesso di identificare
varianti in omozigosi non sinonime in diversi geni le cui
mutazioni sono riportate per causare manifestazioni
cliniche caratteristiche della MOPDII
I nostri risultati dimostrano un quadro genotipico più
complesso per la sindrome di Makewski.
25Acknowledgments
CNR Università di Bari Ospedale Di Venere
IBIOM Dip. Scienze Biomediche e Unità di terapia intensiva
Flaviana Marzano Oncologia Umana neonatale
Apollonia Tullo sezione Pediatria Gabriele D’amato
Maria Felicia Faienza
ITB Unità di Genetica Medica
Arianna Consiglio Dip. Di Bioscienze, Mattia Gentile
Domenica D’Elia Biotecnologie e Biofarmaceutiche
Elisabetta Sbisà Graziano Pesole
Università di Milano San Pio”, Hosp. “G.Rummo
Dip. Di Bioscienze Unità di Genetica Medica
Matteo Chiara Gioacchino ScaranoGRAZIE PER L’ATTENZIONE
Dr.ssa Apollonia Tullo
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