Indagine sulla trasferibilità alla filiera suinicola di marcatori genetici per la validazione della loro associazione con caratteristiche ...
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Indagine sulla trasferibilità alla filiera suinicola
di marcatori genetici per la validazione della loro
associazione con caratteristiche qualitative della
coscia di suini ibridi commerciali per la
produzione di prosciutto DOP
Roberta Davoli,
Paolo Zambonelli, Martina Zappaterra
Alma Mater Studiorum – Università di Bologna
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agro-
Alimentari (DISTAL)
Evento conclusivo progetto AGER-ProSuIT Parma, 14 febbraio 2020
AGER-HEPIGET: Advanced research in genomics and processing
technologies for the italian heavy pig production chain
• Nell’ambito del progetto AGER-HEPIGET erano state realizzate ricerche innovative riguardanti:
Controllo genetico della deposizione e composizione del tessuto adiposo UniBo+UniUd
Studio di associazione tra geni di suino e caratteristiche della qualità della carcassa e della coscia
Studio di processo del prosciutto stagionato DOP con tecniche on-line di controllo dei prosciutti freschi e
dopo salagione
Valorizzazione nutrizionale del prosciutto stagionato DOP e studio dei peptidi bioattivi
Studio di marcatori genetici di resistenza alle patologie
Prof.ssa Roberta Davoli
(Coordinatore Nazionale)
Partnership
ALMA MATER STUDIORUM
Dott.sa Sara Prof. Arnaldo Dott.ssa Prof. Piero Susmel
Botti Dossena Roberta Virgili Prof. Bruno Stefanon
Obiettivi del progetto ProSuIT – UNIBO
Realizzare attività preliminari al trasferimento di alcuni risultati ottenuti
dalla Unità di ricerca durante il progetto AGER-Hepiget alla filiera di
produzione del suino pesante e in particolare all’industria di
trasformazione.
Mediante:
• La definizione di un set di marcatori SNP studiati in AGER-Hepiget nella
razza Large White italiana o segnalati in letteratura per la loro
associazione con la qualità della carne e della carcassa da analizzare
per valutare se sono associabili anche alla qualità del prosciutto per la
stagionatura in campioni ibridi commerciali.
• La verifica della trasferibilità alla filiera suinicola di metodologie
genomiche applicate in AGER-Hepiget.
Campionamento UNIBO per il precedente progetto AGER-HEPIGET
• 949 suini di razza pura LARGE WHITE ITALIANA del SibTest
• Suini allevati presso il Centro Genetico dell’ANAS
• campioni biologici di lardo dorsale e tessuto muscolare (M. Semimembranoso della coscia) e sangue raccolti .La
ricerca si è basata sul prelievo dei campioni al macello, identificazione soggetti e loro genealogia, rilievo di
fenotipi al macello e disponibilità di indici genetici dell’ANAS
Spessore del lardo
SSC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14 15 17 X
Utilizzo dell’SNPChip di
suino 60K (Illumina) +
Trascrittomica
Campionamento ProSuIT
Prosciuttificio Numero di campioni raccolti I 230 suini pesanti erano ibridi
Tanara 60 commerciali (non razza pura
come in AGER-HEPIGET) e i
Citterio* 120 fenotipi utilizzati riguardavano
caratteri qualitativi della coscia
Martelli 50 dei campioni della prova rilevati
Totale 230 dal Partner 1 durante il
progetto.
Dei campioni di ogni prosciuttificio era noto:
Allevamento, Macello, giornata di macellazione (4 giornate di macellazione poiché i campioni di Cittero sono stati
raccolti in due giornate di macellazione)
Il Tipo genetico non era noto con certezza, la genealogia ( nidiate, verri..) non era nota e le uniche
informazioni disponibili erano:
• Figli di verro ILW o meticcio Duroc oppure
• Verro BM71 x Scrofetta ZP oppure
• figli di verro ibrido Gorzagri Goland meticcio
• Inizialmente le informazioni sul sesso erano solo dei campioni prelevati da 1 prosciuttificio
Fenotipi misurati al prosciuttificio (con sigle)
• phu – pH ultimo misurato nel muscolo
Semimembranosus
• mgf - % carne magra nella coscia fresca
• kgf – peso della coscia fresca
• kgps – peso della coscia dopo il primo sale
• kgss – peso della coscia dopo il secondo sale
• cpps – calo peso della coscia dopo il primo sale
• cpss – calo peso della coscia dopo il secondo sale
Progetto ProSuIT – UNIBO
Genotipizzazione dei 230 campioni con
• Pannello di 96 SNP identificati in geni noti
• Pannello Illumina Porcine GeneSeek® Genomic Profiler 70K contenente circa 70000 marcatori
del DNA:
L’ analisi GWAS (Genome Wide Association Study) si è resa necessaria per:
individuare ulteriori SNP e regioni del genoma da associare ai caratteri analizzati ma
soprattutto
ottenere la Matrice genomica delle somiglianze genomiche tra i soggetti analizzati e
recuperare almeno a livello molecolare informazioni non disponibili dalla filiera sulla
genealogia dei cp utilizzati.
completare le informazioni sul sesso mancanti poichè 14 SNP del pannello 70 K erano sul
Cromosoma Y. Inizialmente le informazioni sul sesso erano solo dei campioni prelevati da 1
prosciuttificio
- Lo studio di associazione sia per gli SNP del panello di 96 che per il DNAChip70k è stato effettuato
utilizzando il software GenABEL;
- Il modello statistico utilizzato includeva come fonti di variazione il genotipo ai loci studiati, il sesso e
il giorno di macellazione (fattore quest’ultimo che includeva l’allevamento e il tipo genetico che non
era sempre conosciuto).
Pannello di SNP scelti per la genotipizzazione dei 230 campioni
del progetto ProSuIT Distribuzione 96 SNP per cromosomi:
Sono stati scelti: N di SNP
CROMOSOMA tra i 96
96 SNP trovati da AGER-HEPIGET e da precedenti studi come marcatori SSC1 8
associati con caratteristiche qualitative della coscia e della carcassa SSC2 26
suina. Questi 96 SNP erano compresi nella sequenza di 65 geni, localizzati SSC3 2
sul genoma suino: SSC4 6
•SSC1: AMBP, MC4R, PLIN2, SSC5 0
PLN SSC6 11
•SSC8: ELOVL6, FGF2, KIT1, MTTP,
•SSC2: BEST2, CALR, CAST, SSC7 3
MYOZ2, PPARGC1A, PPP3CA, TBC1D1
CNN1, CTSD, DHPS, FARSA, SSC8 17
•SSC9: DGAT2
HPS5, IGF2, KDM4B, LDHA, SSC9 1
•SSC10: CTSL
MAN2B1, MISP3, MYOD1, SSC10 1
•SSC12: ACACA, ACLY, FASN, SCPEP1,
NCLN, PLEKHA7, PLIN5, SSC11 0
SERPINF1
S1PR2, SAAL1, SOX6, UBL5 SSC12 8
•SSC13: ADIPOQ
•SSC3: KDM3A, PHKG1 SSC13 1
•SSC14: MYPN, SCD
•SSC4: ATP1A2, CA3, CTSS, SSC14 3
•SSC15: ADRB3, PRKAG3, TTN SSC15 5
DECR1, DGAT1
•SSC17: MC3R
•SSC6: CAPNS1, FABP3, FTO, SSC16 0
•SSC18: LEP SSC17 1
GYS1, LEPR, LIPE, MC1R
•SSCX: SAT1 SSC18 1
•SSC7: PLIN1, VRTN
SSCX 2
Totale 96
Principali vie metaboliche associate ai geni inclusi nel pannello di
SNP custom per il progetto ProSuIT
Le principali vie metaboliche associate al set di geni del pannello di SNP per le analisi riguardanti la qualità
delle cosce nel progetto ProSuIT sono:
Vie metaboliche Geni
Metabolismo lipidico PRKAG3, DGAT2, PLIN1, SCD, ACACA, FASN,
ACLY, ELOVL6, DECR1, LIPE
Sintesi degli acidi grassi PRKAG3, SCD, ACACA, FASN, ELOVL6
Deposizione di grasso LEP, ADRB3, LEPR, FTO, MC4R, ADIPOQ, LIPE
Omeostasi del glucosio LEP, LEPR, DHPS, ADIPOQ
Metabolismo energetico insulino dipendente PRKAG3, PHKG1, ACACA, FASN, GYS1,
PPARGC1A, LIPE
Stimolazione della proliferazione cellulare LEP, S1PR2, DHPS, IGF2, CALR, FGF2
Proteolisi CTSL, CTSD, CTSS
Risultati ottenuti con il pannello di 96 SNP
• Pannello 96 SNP custom: 72 SNP segregavano nella popolazione analizzata su 96 totali considerati ma solo 60 SNP e 155
campioni dei 230 totali (229) sono stati utilizzati per le analisi dal software GenAbel utilizzato;
Tale perdita di SNP e di campioni utili per le analisi dipende dal filtraggio dei dati che i software applicano sempre negli studi di
associazione per evitare falsi positivi e risultati poco affidabili. In particolare vengono eliminati:
gli SNP che non sono genotipizzati in almeno il 90-95% dei campioni (nessuno eliminato)
gli SNP che presentano varianti con frequenze alleliche inferiori al 5% (-9)
gli SNP di loci che non sono in equilibrio di Hardy Weinberg per un determinato livello di significatività (-3))
I campioni che presentavano una somiglianza genomica per il 90% dei geni considerati (-74!)
• In totale 60 (100%) marcatori hanno superato tutti i criteri
• In totale, 155 (100%) campioni hanno superto tutti I criteri
Per alcuni fenotipi il numero di cp scendeva a 138 per dati mancanti
• I risultati hanno evidenziato complesivamnete 27 associazioni SNP/carattere usando il pannello
custom (Pc1df ≤0,05)Risultati – SNP di geni scelti del pannello custom associati significativamente
a caratteri (Pc1df ≤ 0,05), ordinati per cromosoma
Simbolo del
gene dove si Nome completo del gene SSC Caratteri associati
trova l’SNP
PLIN2 Perilipin 2 (3’UTR) 1 % magro nel fresco
peso fresco, peso primo sale, peso secondo sale, %
PLIN2 Perilipin 2 (Introne 5) 1
NaCl secondo sale
% magro nel fresco, calo peso primo sale, % NaCl
CAST Calpastatin 2
primo sale
CALR Calreticulin 2 pHu
Pleckstrin homology domain containing,
PLEKHA7 2 pHu
family A member 7
calo peso primo sale, calo peso secondo sale, %
CNN1 Calponin 1 2
NaCl primo sale
Phenylalanyl-TRNA Synthetase Subunit
FARSA 2 calo peso secondo sale, % NaCl secondo sale
Alpha
CTSS Cathepsin S 4 calo peso secondo saleRisultati – SNP di geni associati significativamente a
caratteri (Pc1df ≤ 0,05), ordinati per cromosoma
Simbolo del
gene dove si Nome completo del gene SSC Caratteri associati
trova l’SNP
ELOVL6 ELOVL elongase 6 8 % NaCl secondo sale
Protein Phosphatase 3 Catalytic Subunit
PPP3CA 8 % NaCl primo sale
Alpha (c.90)
Protein Phosphatase 3 Catalytic Subunit
PPP3CA 8 peso fresco, peso primo sale, peso secondo sale
Alpha (c.1500)
MYOZ2 Myozenin 2 8 % NaCl secondo sale
MYPN Myopalladin 14 % NaCl secondo sale
ADRB3 Adrenoceptor Beta 3 15 % magro nel frescoNumerosità dei genotipi per alcuni SNP più significativi presenti nel pannello
custom. Alcune classi genotipiche mancano e le numerosità per genotipo sono
molto limitate. In presenza di pochi campioni/genotipo o due sole classi
genotipiche l’analisi statistica dei dati perde significatività
N° di campioni per GENOTIPO
Genotipo Genotipo Genotipo
Gene Carattere N totale cp Genotipo 11 Genotipo 12 Genotipo 22
CALR gln26 phu 155 7 53 95
PLIN2 3’UTR kgf 148 0 20 128
PLIN2 intr7 kgps 144 0 19 125
CAST c2346 cpps 146 73 64 9
Il numero di soggetti utile per le analisi varia tra fenotipi (N variabile)CAST c2346 : Calpastatina ( Cast) è un inibitore
dell’enzima proteolitico Calpaina che degrada le
proteine muscolari e ha effetti sulla tenerezza della CALR gln26: Calreticulina è una importante
carne nel muscolo post mortem. La variante CAST proteina del reticolo endoplasmatico della cellula
c2346 p.Ser638Arg nel suino è una mutazione che muscolare coinvolta nella regolazione del
cambia l’aminoacido nella proteina ed è stata metabolismo del Ca++, nella risposta
associata nel suino con peso carcassa, deposizione di immunitaria e nel ripiegamento delle proteine.
carne magra, tenerezza. Ha un ruolo anche nel nucleo cellulare nella
regolazione della trascrizione. L’espressione del
Skeletal muscle: gene è controllata da Leptina e in presenza di
PLIN2, PLIN3, PLIN4, PLIN5 obesità è sovraespressa
PLIN2 Le perilipine (PLIN) sono proteine espresse
in vari tessuti. PLIN2 è espressa nel tessuto
muscolare Tra i suoi ruoli anche attivazione della
degradazione dei lipidi localizzati entro la fibra
muscolare. Presenta varianti associate
all’accrescimento e alla deposizione di carne
magra.
Goccia lipidica interna alla
fibra muscolareRisultati analisi dello studio di associazione GWAS con il pannello di SNP Illumina Pig
DNACHIP 70K
68516 SNP in totale sul DNAChip e 230 campioni utilizzati
Dopo I filtraggi (QC Control) che il software GenAbel applica per evitare falsi positivi e risultati poco
affidabili vengono eliminati:
gli SNP che non sono genotipizzati nel 90-95% dei campioni
gli SNP che presentano varianti con frequenze alleliche inferiori al 5%
gli SNP di loci che non sono in equilibrio di Hardy Weinberg per un determinato livello di significatività
I campioni che presentavano una somiglianza genomica in almeno il 90% dei geni considerati
Rimangono utili: 52149 markers e solo 169 campioniNumerosità dei campioni per genotipo dei marcatori più significativi presenti nel
pannello Illumina Pig DNAChip 70k . Si riportano gli SNP con significatività Pc1df < 1E-4.
N° di campioni per GENOTIPO
Genotipo Genotipo Genotipo
SNP Gene Carattere N 11 12 22
WU_10.2_18_17949287 intergenico phu 169 11 58 100
CASI0010463 NXPH2 kgf 169 128 39 2
ASGA0104816 TOX2 kgf 169 0 22 147
CASI0010463 NXPH2 kgps 169 128 39 2
ASGA0104816 TOX2 kgps 169 0 22 147
CASI0010463 NXPH2 kgss 169 128 39 2
WU_10.2_14_144250775 intergenico kgss 169 55 89 25
ASGA0104816 TOX2 kgss 169 0 22 147
WU_10.2_17_49887620 PTPRT cpps 169 12 68 89
ASGA0031014 NEDD9 NEDD9 cpps 169 41 92 36
Tutti i campioni sono stati genotipizzati
(N = 169 )La numerosità dei genotipi per gli SNP significativi presenti nel pannello 70k per alcuni
caratteri non coincide con la numerosità dei campioni per genotipo a causa di alcuni dati
fenotipici mancanti.
SNP Gene Carattere N 11 12 22
.
WU_10.2_18_17949287 intergenico phu 169 11 58 100
CASI0010463 NXPH2 kgf 165 126 37 2
ASGA0104816 TOX2 kgf 165 0 22 143
CASI0010463 NXPH2 kgps 161 124 35 2
ASGA0104816 TOX2 kgps 161 0 21 140
CASI0010463 NXPH2 kgss 154 118 34 2
WU_10.2_14_144250775 intergenico kgss 154 49 81 24
ASGA0104816 TOX2 kgss 154 0 21 133
WU_10.2_17_49887620 PTPRT cpps 161 11 65 85
ASGA0031014 NEDD9 cpps 161 38 88 35
Il numero di campioni totale varia tra fenotipi (N variabile Per alcuni caratteri la numerosità per alcune classi
a seconda del fenotipo genotipiche è troppo bassa o manca un genotipoManhattan plot ottenuto dall’analisi degli SNP contenuti nel
pannello 70k (carattere pHu muscolo Semimembranosus)
pHu
SNP intergenico
SSC 17Manhattan plot ottenuto dall’analisi degli SNP contenuti
nel pannello 70k (carattere calo peso primo sale)
Calo peso I sale
PTPRT ssc17
NEDD9
ssc7Risultati analisi con software SAS e utilizzando un modello con i soli fattori di variazione sesso e giorno
di macellazione senza poter utilizzare le parentele che non erano disponibili. In tabella si riportano le
medie stimate per classe di genotipo per gli SNP significativi presenti nel pannello 70k.
Medie stimate
SNP Gene Carattere N P-value SAS
11 (N) 12 (N) 22 (N)
WU_10.2_18_17949287 phu 169 5.70 (11) 5.72 (58) 5.70 (100) NS
CASI0010463 NXPH2
kgf 165 13.65 (126) 14.04 (37) 13.58 (2) NS (.079)
ASGA0104816 TOX2 kgf 165 - (0) 14.22 (22) 13.67 (143) 0.012
CASI0010463 NXPH2
kgps 161 13.48 (124) 13.84 (35) 13.42 (2) NS (.121)
ASGA0104816 TOX2 kgps 161 - (0) 14.03 (21) 13.49 (140) 0.016
CASI0010463 kgss 154 13.23 (118) 13.63 (34) 13.13 (2) NS (.089)
WU_10.2_14_144250775 kgss 154 13.46 (49) 13.44 (81) 13.05 (24) NS (.051)
ASGA0104816 TOX2 kgss 154 - (0) 13.79 (21) 13.25 (133) 0.015
WU_10.2_17_49887620 cpps 161 1.39 (11) 1.25 (65) 1.29 (85) NS
ASGA0031014 NEDD9 cpps 161 1.22 (38) 1.27 (88) 1.37 (35) NS (.063)
In parentesi sono indicati i P-value ottenuti dall’analisi SAS compresi tra 0.200 e 0.050 (Non Significativo) che si possono
considerare solo «suggestive» . Per nessuno dei marcatori il SAS ha individuato effetti additivi o dominanti significativi,
nonostante ASGA0031014 abbia un andamento «suggestive» per un effetto additivo e numerosità in equilibrio di HWConclusioni Il progetto AGER- ProSuIT ha consentito di verificare trasferibilità alla filiera suinicola di un metodo di analisi avviato con AGER-Hepiget I risultati ottenuti con il pannello custom confermano risultati già osservati in bibliografia o durante il progetto AGER-HEPIGET che già aveva segnalato per alcuni geni associazioni significative con caratteristiche qualitative della carne suina. I risultati ottenuti con il pannello Illumina70K hanno evidenziato nuovi polimorfismi del DNA, nuovi SNP del cromosoma 17 attualmente oggetto di ulteriori analisi e hanno fornito informazioni relative a nuove associazioni tra regioni del genoma suino e i fenotipi studiati..
Per le analisi genetiche/genomiche oltre ad informazioni sul processo produttivo diventa molto importante e necessario avere maggiore disponibilità di informazioni sui suini utilizzati e poter conoscere la razza o il tipo di incrocio, i verri utilizzati e le nidiate oltre alle genealogie. La principale criticità emersa nella ricerca è stata l’assenza di informazioni genealogiche riguardanti i suini utilizzati e la mancanza di dati utili per le correzioni statistiche dei modelli di analisi con importanti penalizzazioni nella possibilità di elaborare in modo più esaustivo i dati sui caratteri considerati per individuare gli effetti dei geni.
Considerazioni conclusive In tutti gli studi di associazione gene/carattere per validare l’effetto di un marcatore è indispensabile utilizzare un modello statistico che consideri i fattori di variazione sul fenotipo e le informazioni sulla genealogia dei suini utilizzati, per fare emergere in modo adeguato e mettere in evidenza in modo più certo solo il contributo dei geni sulla variabilità fenotipica dei caratteri; le informazioni riguardanti le genealogie dei suini sono molto importanti e se disponibili dalla filiera vanno inserite nelle analisi statistiche oltre ai parametri utili per le analisi dei dati genomici. Una più ampia applicabilità di tecnologie genomiche nella filiera è auspicabile in quanto strumento innovativo ed efficace ma richiede di reperire dalla filiera informazioni genealogiche e altri parametri utili per le analisi statistiche dei dati genomici.
Produzione scientifica e divulgazione
• Articoli di divulgazione scientifica:
Suinicoltura, n.9, Ottobre 2018 Suinicoltura, n.7, Luglio-Agosto 2019
Inoltre:
• 1 Pubblicazione in
preparazione sulla
rivista «Animals» :Produzione scientifica e divulgazione
• Abstract e poster a convegni internazionali:
23° Convegno ASPA, Sorrento, Italia, 11-14 Giugno
2019
37° Congresso ISAG (International Society for Animal Genetics), Lleida, Spagna, 7-12 Luglio 2019Grazie per l’attenzione
Enti finanziatori Progetto
Capofila
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