HPV: METODI DI RIVELAZIONE E UTILITA' DIAGNOSTICA - Roberta Cerutti, U.O. Anatomia Patologica Varese 8 novembre 2014
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HPV: METODI DI RIVELAZIONE E
UTILITA’ DIAGNOSTICA
Roberta Cerutti,
U.O. Anatomia Patologica Varese
8 novembre 2014
Papilloma Virus Umano (HPV)
Virus a DNA circolare a doppio filamento, di
7800 bp
Capside a simmetria icosaedrica di 72
capsomeri, senza envelope
Specie specifici, più di 130 tipi noti nell’uomo
Si replicano nel nucleo delle cellule epiteliali
squamose (tropismo per epiteli cutaneo e
mucoso)
Agenti eziologici di lesioni cutanee e delle
mucose
L’INFEZIONE DA HPV
4. RILASCIO DELLE
PARTICELLE VIRALI INTERE
3. REPLICAZIONE
DEL VIRUS ED
ESPRESSIONE DI
GENI VIRALI
TARDIVI
(LATE GENES):
FORMAZIONE
DEL CAPSIDE
2. ESPRESSIONE DEI GENI VIRALI PRECOCI
(EARLY GENES – E5, E6, E7)
1. INFEZIONE DELLE CELLULE PROLIFERANTI (STAMINALI)
DELLO STRATO BASALE
Patogenesi delle lesioni da HPV
Effetti delle oncoproteine virali: E6
Interagisce e degrada p53 e la
proteina pro-apoptotica BAK
• RESISTENZA ALL’APOPTOSI
• AUMENTO DELL’INSTABILITA’
CROMOSOMICA
Attiva le telomerasi e inibisce la
degradazione delle kinasi della
famiglia SRC
•STIMOLAZIONE DELLA
PROLIFERAZIONE
Effetti delle oncoproteine virali: E7
• Si lega alla forma
ipofosforilata di RB
promuovendone la
proteolisi
• stimola i geni ciclina A ed
E e blocca la funzione di
p21 e p27
SREGOLAZIONE DEL CICLO CELLULARE
HPV: Ruolo causale ma non sufficiente per spiegare il carcinoma della cervice
Caratteristiche dell’infezione da HPV 6-12 MESI 4-5 ANNI 9-15 ANNI
Fattori di rischio di persistenza virale
Anomalie citologiche di basso grado
carica virale
fumo
Risposta
immunitaria NK TLR CD4
anticorpale CD8
Immunodepressione
Uso prolungato di contraccettivi orali
Fumo
Coinfezioni (C. Trachomatis…)
Elevata parità
Carica e tipo virale
I VIROTIPI – classificazione filogenetica
Oltre 100 virotipi sequenziati, di cui 40
infettano il tratto genitaleClassificazione epidemiologica
IARC 2009: rischio oncogeno dei tipi di HPV
Virotipi HPV nei carcinomi cervicali 70%
IARC 2009: HPV 16
HPVHPV-correlati
Tumori e tumori
% Tumori HPV
SEDE
correlati
Carcinomi della cervice uterina 100%
Carcinomi anali 85-95%
Sedi Anogenitali Carcinomi vaginali 55-75%
Carcinomi del
della
pene
vulva 40-50%
Carcinomi della
del pene
vulva 20-30%
Carcinomi dell’orofaringe 25-60%
Testa-collo
Carcinomi del cavo orale 10-30%Tumori HPV-correlati in USA (anno 2009)
Identificazione di HPV in diagnostica: applicazioni cliniche
1. RICERCA DI HR-HPV IN CAMPIONI CITOLOGICI
CERVICALI
a. Test di triage o di secondo livello per identificare donne con ascus/lsil da
inviare alla colposcopia per diagnosi ed eventuale trattamento
b. Test di follow-up per prevedere le possibili recidive di lesioni trattate con
procedure locali ablative/escissionali (lesioni ad alto grado)
c. Test primario di screening per identificare soggetti a rischio di lesioni pre-
cancerose della cervice uterinaFollow-up post conizzazione
HR-HPV positivo a 6 mesi dal trattamento è predittivo di una
successiva recidiva con una sensibilità del 90% (62% per citologia)
La specificità è paragonabile a quella della citologia
Il valore predittivo negativo di un HR-HPV negativo con pap test
normale è del 99%
Nobbenhuis, Br J Cancer 2001La strategia di lavoro in anatomia patologica
DIAGNOSI di 2° LIVELLO
In pazienti con HSIL e LSIL pregresse e/o
persistenti
Ricerca e tipizzazione virale
In pazienti con lesioni citologiche di
significato indeterminato (ASCUS)
In pazienti con HSIL trattate
Monitoraggio nel tempo della
chirurgicamente (conizzazione)
persistenza virale nel follow-upHPV come test di screening primario
STUDIO ITALIANO NTCC (Nuove Tecnologie per lo screening del Carcinoma
Cervicale) : trial multicentrico randomizzato su 95000 donne in 9 centri di
screening in Italia (Ronco Lancet Oncol 2010; 11(3): 249-57)
Sensibilità Specificità
Studio NTCC HPV 97.3 93.2
Cytology 74.0 94.8
Valle Camonica
Trento
Padova
Torino
Ferrara
Reggio Emilia
Firenze
Abruzzo
Roma
2009-2010: studi pilota in ItaliaHPV come test di screening primario Il rapporto di Health Tecnology Assessment italiano del 2012 “Ricerca del DNA di Papilloma Virus Umano (HPV) come test primario per lo screening dei precursori del cancro del collo uterino” (Epidemiol Prev 2012; 36(3-4) suppl1) considera raccomandabile il test HPV per lo screening primario: 1. A partire dai 30-35 anni; al di sotto di tale fascia è raccomandato lo screening citologico perché è elevato il rischio di diagnosticare/trattare lesioni che regrediscono spontaneamente 2. Le donne positive al test HPV NON vanno indirizzate direttamente alla colposcopia, ma ad un test di triage CITOLOGICO (pap test)
Algoritmo: HPV come test di screening primario con triage citologico
L’elevato valore predittivo
negativo rende possibile
allungare l’intervallo di
screening
5 anni
Necessaria centralizzazione dei percorsi
diagnostici e validazione dei protocolli di
ricerca HPV-DNA (Linee Guida Europee)Identificazione di HPV in diagnostica: applicazioni cliniche
2. RICERCA DI HPV IN CAMPIONI TUMORALI
FRESCHI o FISSATI IN FORMALINA ED INCLUSI IN
PARAFFINA (FFPE)
Ruolo diagnostico
• Origine cervicale o orofaringea di lesioni metastatiche
• Diagnosi di displasie anogenitali a dubbia morfologia
• Identificazione di micrometastasi linfonodali da CxCa in
stadio I-II
Indicazione prognostica
Carcinomi squamosi dell’orofaringe
Futuro: Scopo predittivo - di orientamento per la terapiaHPV nei carcinomi squamosi testa-collo
Studi caso-controllo
D’Souza 2007HPV nei carcinomi squamosi testa-collo Evidenze sperimentali 1. HR-HPV DNA (prevalentemente tipo 16) presente in modo specifico nei nuclei delle cellule tumorali 2. Dimostrata l’espressione degli oncogeni virali E6-E7 3. Presenza di alterazioni genetiche indicative di funzionalità delle oncoproteine E6-E7 4. Esiste integrazione virale nelle cellule tumorali 5. Silenziando l’espressione di E6-E7 nelle cellule tumorali HPV+ in coltura si reverte il fenotipo maligno
HPV nei carcinomi squamosi testa-collo
Kreimer A, 2005HPV come fattore prognostico
Carcinomi squamosi dell’orofaringe
Motivi ancora non del tutto noti:
Maggiore radiosensibilità e chemiosensibilità della neoplasia
Risposta immunitaria efficace
No effetto di cancerizzazione di campo
Cancer Prev Res 2009Classi di rischio per i carcinomi orofaringei
HPV
Numero di sigarette fumate
Stadio di malattia/metastasi linfonodali
Ang NEJM 2010La diagnosi di infezione da HPV
No possibilità di coltura in vitro
No saggi sierologici affidabili per infezioni in atto o pregresse da HPV
METODI MOLECOLARIQuante metodiche molecolari? Identificati 125 test HPV!
Quali metodi per l’utilizzo nello screening?
i. Validati da studi clinici ampi e attendibili
ii. Approvati dalla FDA ed utilizzati in accordo alle specifiche
indicazioni fornite dall’ente
iii. Rispettano i criteri di performance e di adeguatezza clinica
(Meijer 2009)
SENSIBILITA’ CLINICA: proporzione di donne con lesioni CIN2+
correttamente identificate da un test HPV positivo (NO FALSI NEGATIVI)
SPECIFICITA’ CLINICA: proporzione di donne senza lesioni CIN2+
correttamente identificate da un test HPV negativo (NO FALSI POSITIVI)Test validati per utilizzo clinico
Amplificazione del segnale: Hybrid Capture 2®
Procedura standardizzata con sensibilità clinica ottimale
Ibridazione in fase liquida e cattura dell’ibrido su supporto solido
Sonde per 13 tipi virali HR (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68)
e 5 tipi virali LR (6,11,42,43,44)
Cattura degli ibridi DNA/RNA
Denaturazione su micropiastra con anticorpi
degli acidi nucleici universali
Rivelazione degli ibridi catturati con
anticorpi multipli coniugati con fosfatasi
alcalina (AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE)
Ibridazione del DNA
con sonde a RNA in
fase liquida Misurazione del segnale
chemiluminescente prodotto dalla
scissione del substrato con luminometroHybrid Capture 2®
Utilizzabile per campioni citologici cervicali raccolti in fase
liquida o per biopsie cervicali congelate in STM
Il test ha una sensibilità clinica del 96% e valore
predittivo negativo (VPN) del 99%
E’ il test commerciale più utilizzato, per la semplicità, la
possibilità di automazione ed i costi relativamente limitati
Estesa validazione clinica; tutti i metodi da implementare
devono essere posti a confronto con questo (Meijer J Clin Virol 2009)
LIMITI:
non permette di definire lo specifico genotipo
Sensibilità inferiore rispetto alla PCR
Cross reattività fra i pool di sonde (scarsa specificità,
presenza di falsi positivi)Test basati sulla PCR (amplificazione del target) Alcuni sono validati per utilizzo clinico (Abbott HR HPV test e COBAS ® 4800 HPV test) Primers utilizzati per amplificare regioni altamente conservate del genoma virale nelle regioni L1, E6, E7 Tecnica altamente sensibile, richiede quantità minime di campione e può essere automatizzata per campioni citologici in fase liquida o tessuti freschi e paraffinati
Finalità dei test basati sulla PCR
1. Identificare la presenza di DNA di HPV
(es. AMPLICOR® Roche….)
Test con utilità
2. Identificare quale genotipo di HPV è clinica attuale
presente (TIPIZZAZIONE VIRALE)(es.
Clinical Array ®, InnoLipa ®, Linear Array®,
sequenziamento diretto)
3. Identificare l’espressione delle
oncoproteine virali E6-E7 mediante Utilizzo clinico
limitato
analisi dei trascritti (es. PreTect HPV-proofer, Biomarker di
Aptima) predittività?
4. Determinare la carica virale
dell’infezione da HPV (Real time PCR Biomarker di
quantitativa) predittività?1. Test di identificazione di HR-HPV
Esempio: AMPLICOR ® HPV TEST
Test qualitativo in vitro per l’amplificazione del DNA di HPV
Campioni citologici in fase liquida
Identifico 13 tipi di HR-HPV
(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68)
Controllo interno: gene b-globina umano
Sensibilità clinica 96%
Specificità clinica 95,6%Metodiche di Real time PCR per identificazione di HR-HPV
e tipizzazione 16-18
Mix di primers GP5+/6+ che amplificano 150 bp di
Abbott ® HR HPV test una regione consenso di HPV L1. Identifico HPV 16
e 18 in modo specifico, e una miscela dei 12 tipi ad
alto rischio. Altissima processività
COBAS ® 4800 HPV test Identifico HPV 16 e 18 in modo specifico, e una
miscela dei 12 tipi ad alto rischio. Altissima
processività
GeneXpert ® HPV assay Identifico HPV 16 e 18/45 in modo specifico, e
una miscela dei 12 tipi ad alto rischio.
Sistema in cartuccia chiuso, automatizzato2. Test di tipizzazione virale Sono importanti per la gestione delle donne HR-HPV positive: Per la definizione di infezione persistente (ELEVATO RISCHIO DI PROGRESSIONE NEOPLASTICA) Forniscono una stratificazione del rischio per CIN3+ delle infezioni persistenti in base al tipo presente Utili nel follow-up delle lesioni trattate chirurgicamente Sono fondamentali per gli studi epidemiologici sulla distribuzione dei tipi e per gli studi di monitoraggio dell’efficacia dei vaccini
Metodiche basate su ibridazione inversa e rilevazione colorimetrica
INNOLiPA® Genotyping extra assay
Utilizzo sonde tipo-specifiche adese a strisce di nitrocellulosa
Amplificazione con primers SPF10, identifica 28 genotipi di HPV (HR e LR)
Controllo interno: gene HLA-DPBL
Adattabile a campioni citologici o a istologici freschi-paraffinatiMetodiche
Metodiche basatebasate su ibridazione inversa
su ibridazione inversa e rilevazione colorimetrica
e rilevazione colorimetrica
Linear Array ® Assay
Amplificazione con primers PGMY , che identifica 37 genotipi di
HPV (HR e LR)
Adattabile a campioni citologici o a istologici freschi-paraffinati
Sensibilità clinica 96%
Specificità clinica 99%Metodiche
Metodiche basatebasate su ibridazione inversa
su ibridazione inversa e rilevazione colorimetrica
e rilevazione colorimetrica
Clinical Array® HPV TEST (in uso in AP Varese)
Test qualitativo in vitro per l’amplificazione del DNA di HPV
Campioni citologici in fase liquida
Identifico 35 tipi di HR-HPV e LR-HPV (primers PGMY)
Controllo interno: gene CFTR
Utilizzo di un array con sonde oligonucleotidiche tipo-specifiche
Sensibilità clinica 98,2%
Specificità clinica 100%3. Test per identificazione dell’HPV-RNA
Per identificare le lesioni a basso/alto grado HPV DNA + con maggior rischio di
progressione (valutazione del rischio di sviluppo di un CxCA)
Identificazione dei RNA virali (la persistenza dell’espressione di E6-E7 è il principale
fattore di rischio)
APTIMA HPV assay
Identifica HPV E6-E7 RNA di 14 tipi virali ad alto rischio con elevata sensibilità e
specificità per le lesioni più avanzate. No cross-reattività con LR-HPV.
Completamente automatizzabile, approvato FDA. No tipo specifico
PreTect HPV-Proofer (Real time multiplex NASBA)
Set di primers/probes specifiche per identificare 5
genotipi virali HR (16,18,31,33,45) identificando il
mRNA di E6/E7 (molecular beacon DNA probes)
No tipo specifico4. Real time PCR quantitativa
Tecnica di amplificazione del DNA con monitoraggio
continuo dei prodotti di amplificazione nel tempo
Elevata sensibilità, riproducibilità
E’ un approccio di elezione per la quantificazione degli
acidi nucleici, utile per la determinazione della carica
virale di HPV
Alta carica virale = maggior rischio di sviluppare CxCA?
(Dato controverso)
Broccolo Journal of Med Virol 81:278–287 (2009)Ibridazione in situ
Utilizzo cocktail di sonde di HPV DNA ad alto rischio (18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,
56, 58, 66) marcate con DNP. Metodica automatizzata, rivelazione colorimetrica
NBT-BCIP
Vantaggi: identifico il virus nel nucleo delle cellule tumorali (morfologia
conservata), valutando intensità di segnale e percentuale di cellule marcate
(ottima tecnica per identificazione HPV nei tessuti, elevata specificità)
Identifico il pattern di marcatura diffuso (episomale) e puntiforme (integrato)
Svantaggi: sensibilità inferiore rispetto alla PCRRuolo di p16 come marker di infezione da HPV
La positività Immunoistochimica per la proteina p16 è un
importante marcatore di presenza di HPV trascrizionalmente
attivo nel tumore (es. tumori dell’orofaringe)
Fornisce inoltre un’indicazione di rischio di progressione
nelle lesioni pre-neoplastiche cervicaliconclusioni
HPV correlato non solo a neoplasie cervicali ma anche a tumori di
diverse sedi
Impatto diagnostico rilevante della ricerca di HPV
• Identificazione precoce di lesioni preneoplastiche della cervice
• Gestione degli iter diagostici-terapeutici-di follow up nelle donne
con lesioni cervicali
• Analisi di campioni pre-tumorali o tumorali a scopo diagnostico-
prognostico
Moltissime metodiche molecolari a disposizione, la scelta è da
effettuare in base allo specifico obiettivo
• HC2 diffuso per lo screening primario (semplice, costi bassi)
• Tecniche basate sulla PCR diffuse ed automatizzabili, si stanno
diffondendo sempre più in ambito clinico
• Allo studio tecniche nuove e biomarcatori per stratificare il rischio
(p16, tipizzazione, carica virale, RNA delle oncoproteine virali ecc.)Grazie dell’attenzione!
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