METODICHE ARRAY-BASED IN DIAGNOSI PRENATALE - DR. ORAZIO PALUMBO, PHD DIRIGENTE BIOLOGO SPECIALISTA IN GENETICA MEDICA U.O.C. GENETICA MEDICA ...

Metodiche Array-based in Diagnosi Prenatale

Dr. Orazio Palumbo, PhD
Dirigente Biologo Specialista in Genetica Medica
U.O.C. Genetica Medica Fondazione IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza
San Giovanni Rotondo, FG
GdS Genetica Umana ONB Puglia e Basilicata

DIAGNOSI PRENATALE
 Insieme di tecniche strumentali e di laboratorio finalizzate alla
identificazione di patologie prima della nascita

 richiede l’intervento di varie discipline: ostetricia, ultrasonografia,
genetica clinica, diagnostica di laboratorio.

DIAGNOSI PRENATALE
Un po’ di storia:
- 1966 (Steele, Breg): determinato l’assetto cromosomico di un feto su
   cellule amniotiche;
- 1968 (Nadler et al; Valenti et al.): prima diagnosi prenatale di
   trisomia 21 (Sindrome di Down) su liquido amniotico;

-   1984 (Ward et al.): diagnosi prenatale su villi coriali nel primo
    trimestre

DIAGNOSI PRENATALE

SCOPI:
 Identificare anomalie durante la vita fetale…….
 fornire scelte informate alle coppie a rischio;
 rassicurare e ridurre l’ansia;
 permettere a coppie ad alto rischio di confermare o smentire
    l’anomalia nel feto mediante il test, piuttosto che rinunciare
    ad avere figli;
 permettere a coppie con un bambino affetto di avere una
    preparazione psicologica prima e dopo la nascita;
 per un piccolo ma crescente numero di patologie, permettere
    il trattamento prenatale del feto affetto

INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE
 Età materna avanzata (>35 anni): rischio di cromosomopatia
  varia tra lo 0.5 ed il 5% in relazione all’età

        (l'aumento del rischio di aneuploidie cromosomiche correla con l'età materna)

INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE

   Aborti spontanei multipli (≥3);
   precedente bambino con un anomalia cromosomica “de novo”: rischio ricorrenza
    circa 1%;
   la presenza di anomalie cromosomiche strutturali bilanciate nei genitori: aumento
    del rischio di concepimenti sbilanciati;
   storia familiare per una malattia genetica che può essere diagnosticata o esclusa
    mediante analisi biochimiche o del DNA;
   Precedente figlio con difetto di chiusura del tubo neurale: rischio ricorrenza del 3%
   anomalie fetali e/o ritardo di crescita intrauterino rilevati ecograficamente: rischio
    di anomalia cromosomica del 4%

GOLD STANDARD IN DIAGNOSI PRENATALE
 Procedure invasive + Citogenetica classica/molecolare(FISH)

ANOMALIE CROMOSOMICHE
 Presenti in circa 1% dei NATI VIVI: tutte possono essere diagnosticate prima della nascita, ma
  i rischi dei test possono superare i benefici

                                             Negli aborti spontanei precoci, il feto ha delle
                                              anomalie cromosomiche in circa il 50% dei casi

Alterazioni di numero di interi cromosomi
Sindrome di Down (Trisomia 21, OMIM 190685): anomalia cromosomica più
frequente (1/800) nell’uomo, incide per il 6-8% dei casi di NDDs

       FENOTIPO CLINICO:
          -Bassa statura
   -Naso piccolo e schiacciato
        -Mani e piedi tozzi
           -Denti piccoli
             -Epicanto
          -macroglossia
       -Capelli radi e sottili
              -Obesità
     - ID moderato (IQ=50)

Estese delezioni/duplicazioni (5-10 Mb)
Monosomia 5p (Sindrome del cri-du-chat, OMIM 123450): 1/15.000-1/50.000, è una
delle sindromi da microdelezione più frequentemente riscontrata (1/350) nei
pazienti affetti da NDDs [Cerruti Mainardi, 2006]

                                                      FENOTIPO CLINICO:
                                                       -pianto monotono
                                        - ritardo di crescita ad insorgenza prenatale
                                                            -ipotonia
                                  - Facies caratteristica (viso rotondeggiante “a forma di
                                      luna”, microcefalia, ipertelorismo, micrognatia,
                                    epicanto, sella nasale ampia, orecchie ad impianto
                                              basso con anomalie pre-auricolari)
                                - ID grave + deficit di attenzione, iperattività e forme di
                                                             autismo

Sindromi da microdelezione/microduplicazione (FISH)
                   Sindromi da microdelezione/microduplicazione:
                   - Williams-Beuren (del7q11.23; OMIM 194050)
                     - Prader-Willi (del15q11q13; OMIM 176270)
                        - DiGeorge (22q11.2; OMIM 188400)
           -   Smith-Magenis (del17p11.2; OMIM 182290): 1/15.000-25.000

                       FENOTIPO CLINICO:
- Facies caratteristica (fronte bombata, ipertelorismo, sinofria,
 rime palpebrali oblique verso l'alto, ipoplasia medio facciale,
     faccia quadrata larga con sella nasale depressa, labbro
     superiore rovesciato a "tenda", micrognatia neonatale)
 - ID di grado variabile, disturbi del comportamento e ritardo
                           del linguaggio

ANALISI DEL CARIOTIPO/FISH: CARATTERISTICHE

           Consente di identificare:
            Alterazioni di numero di interi cromosomi;
            Estese delezioni/duplicazioni (5-10 Mb)
            FISH (microdelezioni/microduplicazioni)
            Alterazioni bilanciate: traslocazioni/inversioni
            Mosaicismi

           SVANTAGGI:
            Bassa risoluzione (cariotipo)
            Metodica locus specifica/richiede sospetto
              diagnostico (FISH)
            DP: Richiede la messa in coltura di cellule fetali
              (lunghi tempi di attesa: 15-20 g).

Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH)

 Metodica quantitativa che consente di identificare piccole alterazioni
                 strutturali cromosomiche sbilanciate

PIATTAFORME DISPONIBILI
                                               RISOLUZIONE
               PROBES

                                            • BAC-arrays: 150 kb-1 Mb;
                                            • Oligo-arrays: 50-150 Kb

                                            TIPOLOGIA DI ARRAYS

• Inserti di cloni BAC o PAC (75-200 kb);
         • Cosmidi (30-40 kb),
         • Fosmidi (40-50 kb);
    • Oligonucleotidi (25-85 basi).

Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Arrays
                                    PROBES

             RISOLUZIONE ≥ 1-5 Kb

Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Arrays

                                                                    AA

                                                                    AB

                                                                    BB

In aggiunta a delezioni e duplicazioni, consente di identificare:
 estese regioni di omozigosità (ROH);
 disomie uniparentali (UPD)

Output di un saggio aCGH
KARYOVIEW                                      CHROMOSOME VIEW

 SEGMENTS REPORT: 15-20 CNVs per esperimento

                      SNPs
                      LIST

CARIOTIPO/FISH vs aCGH/SNP Arrays
              CARIOTIPO/FISH
                                                                aCGH/SNP ARRAYS

Consente di identificare:
 Alterazioni di numero di interi cromosomi;
 Estese delezioni/duplicazioni (5-10 Mb)
 FISH (microdelezioni/microduplicazioni)              Consente di identificare:
 Alterazioni bilanciate: traslocazioni/inversioni      Alterazioni di numero di interi cromosomi;
 Mosaicismi                                            delezioni/duplicazioni (> 0.05-0.1 Mb)
                                                        Mosaicismi (> 15-20%)
SVANTAGGI:                                              SNP arrays: LOH, UPD.
 Bassa risoluzione (cariotipo)
 Metodica locus specifica/richiede sospetto           SVANTAGGI:
   diagnostico (FISH)                                   Non identifica alterazioni bilanciate
 DP: Richiede la messa in coltura di cellule fetali
   (lunghi tempi di attesa: 15-20 g).

Copy Number Variations (CNVs)
CNV: segmento di DNA, di dimensioni tipicamente maggiori di 1 kb ed
inferiori di 5-3 Mb, alterato nel numero di copie rispetto ad un genoma
di riferimento;

• variante strutturale submicroscopiche quantitativa.

CNVs e Fenotipo
   Copy Numbers Polymorphisms: benigne, ≥ 1% nella popolazione generale.

CNVs e Fenotipo
   Copy Number Aberrations: responsabili di fenotipi patologici o di sindromi costituzionali,
    spesso con ritardo mentale ed anomalie multiple, note come disordini genomici o sindromi
    da geni contigui (Lupski et al. 1998)

                                  http://decipher.sanger.ac.uk/

i.     identificare le cause genetiche di alcune sindromi già note;
ii.    identificare nuove sindromi genomiche (reverse dysmorphology)
iii.   identificare geni candidati ed effettuare diagnosi su casi sporadici.

Gene discovery: CHARGE syndrome
                                    Coloboma
                                    Heart malformation
                                    Atresia, choanal
                                    Retardation of growth and/or development
                                    Genital anomalies
                                    Ear anomalies

- Autosomica dominante;
- 1/10.000

                          aCGH: del8q12 (2.3 Mb)

Gene discovery: CHARGE syndrome

  CHD7(10/17): chromodomain helicase DNA binding protein 7

CASI SPORADICI

CASI SPORADICI

METODI DIAGNOSTICI: DETECTION RATE
 Karyotyping/FISH
                               aCGH/SNP Arrays

                               Detection Rate: 20-25%
   Detection Rate: 7-10%
 (J.A. Veltman et al., 2012)

LINEE GUIDA

CNVs ed a-CGH nella pratica clinica

                                                               CNPs?

N.B. Nonostante l’elevato potere diagnostico delle metodiche basate su
arrays, la maggiore difficoltà resta il dover assegnare un significato
clinico alle alterazioni identificate.                                   CNAs?

Criteri generali di classificazione

Copy Number Polymorphism (benigne)            Copy Number Aberration (patologiche)

•   piccole dimensioni (40-150 kb);           • dimensioni tipicamente ≥ 0,5-1 Mb;
•   duplicazioni piuttosto che delezioni;     • Delezioni piuttosto che duplicazioni;
•   interessano regioni povere di geni;       • Contenuto genico consistente col
•   sono riportate come polimorfiche in         fenotipo del paziente;
    almeno tre soggetti in DGV;               • Interessano loci associati a sindromi
•   sono ereditate da un genitore               specifiche o sono riportate in pazienti
    apparentemente        asintomatico    o     con fenotipo clinico conclamato
    presenti in uno o più soggetti sani         (DECIPHER; Ecaruca);
    della stessa famiglia                     • Insorgenza de novo.

            La linea di demarcazione tra alterazione benigna e variante patologica non è
            affatto netta! Infatti……

CNV patologica?
… la presenza di una CNV RARA ad occorrenza de novo in un solo paziente non è
sufficiente prova di patogenicità. Solo la identificazione di una CNV identica o
parzialmente sovrapponibile in un paziente con un fenotipo simile può chiarirne
l’eventuale contributo nella eziologia della patologia ed eventualmente portare alla
definizione di una nuova sindrome.

                                       del2p25.1p24.1

CNV benigna?
…ogni CNV, pur se ereditata da un genitore apparentemente asintomatico o presente
in controlli sani è potenzialmente patologica per:
• difetto di penetranza;
• espressività variabile;
• imprinting genomico (una CNVs può essere o meno patologica a seconda che sia
   trasmessa dal padre o dalla madre o che interessi un cromosoma di origine paterna
   o materna)
• secondo evento (two-hits hypothesis)

Importanza dei Databases e della letteratura

E’ richiesta SEMPRE un’interpretazione critica dei risultati….

                       …che includa l’analisi del fenotipo clinico!

1. CASISTICA SELEZIONATA

2. LIMITI INTERPRETATIVI
 VOUS
3. LIMITI LEGATI ALLA METODICA:
 Le metodiche array-based non sono in grado di identificare riarrangiamenti
    bilanciati

1. ARRAYS IN DP: CASISTICA SELEZIONATA
1. Senza specifica indicazione: età materna avanzata, feti a cariotipo normale, in assenza di
reperti ecografici evocativi di patologia:

 +1% CNV submicroscopiche clinicamente significative, non statisticamente diverso
  da quello rilevato nei casi con altre indicazioni a basso rischio [OR 1.13 (95% CI
  0.81-1.57)]

1. Non sembrano esserci evidenze che ne suggeriscano l’utilità come
   prima opzione in DP

1. Indicazione: età maternal avanzata, feti a cariotipo normale, in assenza di reperti ecografici
evocativi di patologia:

                                                                      Novelli et al., 2011

 32/1520 (2.3%): VOUS (0-4% targeted arrays; 8-12% whole genome)
1. Non sembrano esserci evidenze che ne suggeriscano l’utilità come
   prima opzione in DP

1. ARRAYS IN DP: CASISTICA SELEZIONATA
2. Indicazione: anomalie ecografiche fetali (malformazioni isolate o multiple, associazioni
evocative di un quadro sindromico, difetti significativi di crescita fetale)
a. Non è possibile formulare una specifica diagnosi clinica……

- Detection rate (DR) incrementata del 7% rispetto al cariotipo;
- Incremento maggiore (9,1%) nel caso di malformazioni multiple

1. ARRAYS IN DP: CASISTICA SELEZIONATA
1. Anomalie ecografiche fetali (malformazioni isolate o multiple, associazioni evocative di un
quadro sindromico, difetti significativi di crescita fetale)

b. Labiopalatoschisi……5% CNVs patogenetiche

1. ARRAYS IN DP: CASISTICA SELEZIONATA
1. Anomalie ecografiche fetali (malformazioni isolate o multiple, associazioni evocative di un
quadro sindromico, difetti significativi di crescita fetale)
c. Ritardi di crescita intrauterine (IUGR)……6.8% CNVs patogenetiche

 Casistica totale (12362): 292(2.4%) CNVs patologiche

 US abnormalities (3090): 201 (6.5%), CNVs patologiche

N.B.
 Età maternal avanzata (5108): 50 (1%) CNVs patologiche;

 Altro (4164): 44 (1.1%) CNVs patologiche

 US abnormalities (3730): 262 (7%), CNVs patologiche
2. aCGH solo in gravidanze con specifiche indicazioni, no come
metodica di screening in tutte le gestanti

2. ARRAYS IN DP: CRITICITA’

                       CNPs?

                               CNAs?

2. ARRAYS IN DP: CRITICITA’

1. INDICAZIONI

 MAI in sostituzione del cariotipo convenzionale;
 NON per lo screening generale in tutte le gravidanze;
 non è giustificata nei casi di feti con un aumento isolato di NT; è giustificata
  nei casi di NT≥3,5mm con cariotipo normale;

 solo in casi con indicazioni specifiche, come ad esempio:
1. riscontro ecografico di anomalie fetali isolate (apparentemente isolate) o
multiple;
2. riarrangiamenti cromosomici de novo, anche se apparentemente bilanciati,
rilevati al cariotipo standard per indagare sulla possibile presenza di
sbilanciamenti criptici;
3. marcatori sovrannumerari, al fine di caratterizzarne l’origine ed
eventualmente il contenuto genetico.

2. INTERPRETAZIONE/TRASMISSIONE DEL RISULTATO
 per minimizzare l’identificazione delle VOUS, sono preferibili piattaforme
  targeted con una risoluzione nel backbone non superiore alle 500 kb

 Non riportare nel referto, in accordo con raccomandazioni di società
  scientifiche internazionali, CNVs per le quali sono noti e documentati
  fenomeni di espressività variabile e penetranza incompleta

N.B:
 La diagnosi prenatale NON PUO’ essere utilizzata per escludere TUTTE
  LE ANOMALIE FETALI;
 Si limita a determinare se il feto presenta una particolare condizione
  suggerita dall’età avanzata della madre, dalla storia familiare o da
  altri fattori ben definiti….

 …in condizioni standard, la METODICA D’ELEZIONE è l’AMNIOCENTESI
                              seguita da:
 ANALISI BIOCHIMICHE: Livelli di         ANALISI GENETICHE:
  AFAPP (difetti del tubo neurale)             Cariotipo

GRAZIE PERL’ATTENZIONE