ACGT del Sequenziamento del DNA - Workshop nazionale di aggiornamento per gli insegnanti della scuola secondaria - 29-30 Novembre 2005
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Workshop nazionale di aggiornamento per gli insegnanti
della scuola secondaria – 29-30 Novembre 2005
ACGT del Sequenziamento
del DNA
Loris Bernard
DNA Sequencing Unit
Sommario Cosa è il DNA Il sequenziamento del DNA Il genoma umano Applicazioni del sequenziamento del DNA: mutazioni, analisi frammenti Cosa ci riserva il futuro?
1859
1865
1909
1953
1966
1975
2001
oggi
futuro
Friedrich Miescher, isola la “nucleina”
1869
Il botanico Danese Wilhelm 1909
Johannsen conia il termine
“GENE” per descrivere l’unità 1953 Marshall Niremberg, Har
ereditaria di Mendel. Khorana, Severo Ochoa
Dal greco genos “nascita” decifrano il codice genetico.
1966
“We wish to suggest a structure for the salt of
deoxyribose nucleic acid (DNA). This structure has
novel features which are considerable biological
interest.”
Watson and Crick, Nature 1953
Vorremmo suggerire una struttura per l’acido
deossiribonucleico (DNA). Questa struttura ha
delle nuove caratteristiche che hanno un notevole
interesse biologico.
Essere al momento giusto nel posto giusto
Fisico 35 anni
Biologo 25 anni
Cavendish Laboratory di Cambridge
1953
Ma com’è fatta la molecola di DNA?
1950 Con l’aiuto del collega
Maurice Wilkins, ricercatori
del King’s College di Londra
ottengono delle figure di
diffrazione ai raggi x per
una molecola intatta di DNA.
Premi Nobel 1962 insieme a Wilkins. Rosalind Franklin morì a 37 anni di cancro precedentemente. Linus Pauling: studio sulle molecole elicoidali Erwin Chargaff: Composizione del DNA, ugual numero di A-T, C-G
Struttura del DNA: 1
Doppia elica antiparallela
Unità ripetuta: Nucleotide Base + Zucchero
= Nucleoside + fosfato = Nucleoside
Convenzione: sequenza 5’-3’ di un solo filamento
(replicazione-trascrizione) Da T.Strachan et al.
“Genetica umana molecolare”
Struttura del DNA: 2
dNTP (deossinucleotide trifosfato)
1 molecola di zucchero
3 molecole di fosfato
1 molecola per le 4 basi azotate
dATP dGTP dCTP dTTP
Da T.Strachan et al.
“Genetica umana molecolare”.
Struttura del DNA: 3 Polarità del filamento di DNA
Legame
fosfodiesterico Complementarietà dei
covalente due filamenti di DNA
Legami idrogeno Da T.Strachan et al.
“Genetica umana molecolare”Il periodo post atomico
1955 A Kornberg
Isola DNA polimerasi
1958 M Meselsen, F. Stahl
Replicazione semiconservativa DNAReplicazione del DNA
Definizione di “replicazione”
Duplicazione del materiale genetico prima della
divisione di una cellula.
Replicazione patrimonio genetico
cellula madre=2
Cellula madre
Patrimonio genetico =1
Cellule figlie
Patrimonio genetico = 1Replicazione del DNA
DNA elicasi
DNA
Polimerasi
dNTPs liberi
Origini di
Replicazione
(Primers)
Da T.Strachan et al.
“Genetica umana molecolare”I padri del sequenziamento del DNA:
Premi Nobel per la chimica 1980
Gruppo americano:Walter Gilbert
Metodo chimico
Gruppo inglese: Frederik Sanger
Metodo enzimaticoIl Metodo di Sanger 1963
Definizione di sequenziamento
Scoprire l’ordine, la SEQUENZA, con cui i
dNTP sono inseriti lungo la catena
polinucleotidica.
Per convenzione si ordina la sequenza del
DNA da 5’ al 3’ da sinistra a destra.
Spesso si descrive un solo filamento di
DNA, ma si sequenziano entrambi i
filamenti che compongono la doppia elica.Metodo di Sanger
Si basa sulla possibilità di mimare la replicazione
del DNA in vitro utilizzando tre “trucchi”
1. Interruzione della sintesi del DNA dopo
l’aggiunta di ogni dNTP, creando cosi’ dei
frammenti di lunghezza differente (per un solo
nucleotide).
2. Separazione dei frammenti
3. Riconoscimento l’ultimo dNTP inseritoMetodo di Sanger
1. Interrompere la sintesi del DNA
x
DIDEOXYNUCLEOTIDE
(ddNTP) DEOXYNUCLEOTIDE
terminator (dNTP)Metodo di Sanger 2. Separazione dei frammenti: Elettroforesi
Metodo di Sanger
3. Riconoscimento dell’ultimo dNTP inserito
Radioattivo
FluorocromiIl metodo di Sanger è una forma di sintesi
del DNA
Il DNA di cui scoprire la sequenza diventa
un templato per la sintesi enzimatica di un
nuovo DNA “strand” partendo da un attacco
specifico (Primer).
L’ enzima utilizzato è la Polimerasi I
ingegnerizzata.
L’ incorporarazione di dideoxinucleotidi
blocca la sintesi del nuovo DNA strand.Preparazione templato
Campione Frammento di DNA inserito in un vettore
biologico:
Sangue Coltura in vitro
Tessuto
Cellule
Estrazione Dna
Purificazioni
Cycle Sequencing
PCR Elettroforesi
Detection
Analisi ElettroferogrammaSequenziamento del DNA - Metodo di Sanger
TEMPERATURA agttggtttaaagc
DNA tcaaccaaatttcg
DNA polimerasi
dNTPs
ddATP
ddNTPs ddGTP
“Marcati” in fluorescenza
No elicasi
ddCTP
ddTTP
Primer agttgcttcgcSequenziamento Automatico del DNA
Elettroforesi su vetri
Elettroforesi capillare
Capillary
Laser
CCD
Camera
BufferUn Sequenziatore
Automated DNA Sequence Readouts
1859
1865
1909
1953
1966
1975
2001
oggi
futuroGenoma Umano 3.200.000.000 coppie di basi
170 m
gaps
108.5 mDatabase Genomici
Genomica
Anni ‘90
Post-Genomica
2001
Proteomica
oggi
futuro
Studio delle DNA
diversità “Spazzatura”
Personal
Banche dati on line Farmaco
Genome
genomica
ProjectIl DNA ripetuto: microsatelliti
microsatellite
(ca)n
gacctaatc ca ca taccgttaa Allele 1
gacctaatc ca ca ca taccgttaa Allele 2
gacctaatc ca ca ca ca taccgttaa Allele 3
gacctaatc ca ca ca ca ca taccgttaa Allele 4
gacctaatc ca ca ca ca ca ca taccgttaa Allele 5Il DNA ripetuto: microsatelliti
Sample + Allelic
in-lane std. Ladder
200 bp
8
7
6
5
4
3
2
1
160 bpScena del delitto
Esame del Dna
Sangue
ritrovato
sul sospetto
Epitelio
Victim ref.
Suspect ref.Test di paternita’
Test di paternita’
Mother ? Father
ChildUna famiglia normale (o il test
con il giardiniere)
* Father
* Mother
* *
* * Child * *Mutazioni geniche
Il sole splende in cielo wt (normale)
Il sale splende in cielo sostituzione
Il sole spende in cielo delezione
Il sole splende in chielo inserzione
Sostituzione di una base in eterozigosi
ATTTACCAAACATTGGA
ATTTACCGAACATTGGA
GMutazioni del genoma
Il gatto dorme sul divano wt (normale)
Il ratto dorme sul divano sostituzione
Il gatto dorme sul -ivano delezione
Il gratto dorme sul divano inserzione
Sostituzione di una base
ATTTACCAAACATTGGA
ATTTACCGAACATTGGA
GASPETTI GENETICI DELLA SINDROME DELL’X-FRAGILE
La Sindrome di Martin Bell (SMB) o
dell’X-fragile (FRAXA) è la piu’
frequente causa ereditaria di ritardo
mentale.
La trasmissione ereditaria e’ legata al cromosoma X.
La sindrome e’ causata da una "mutazione dinamica"
cosi’ detta in quanto caratterizzata dall’instabilità di
un tratto di DNA nel gene FMR1. Nel primo esone e’
presente una sequenza ripetuta, costituita da triplette
CGGSINDROME DELL’X-FRAGILE “LE PROTEINE NON VENGONO PRODOTTE"
4 basi (DNA).................7 note (Musica)
“lettura”
“espressione”Quando il gene è mutato
Quanti geni possono suonano insieme ?
GeneChip – tutti i geni su un vetrino
Gene ID hCG17881.3 hCG22621.3 hCG37215.3
RefSeqs NM_021021 NM_003380 NM_012307
GenBank Accession L31529 AK025100 AK02 AK091813 BC030573 A BC008377 AF069072 A
hCT hCT1955626 hCT1964478|hCT13718 hCT28447|hCT2273982
hCP hCP1763372 hCP1779155|hCP41357hCP47862|hCP189263
hCG hCG17881.3 hCG22621.3 hCG37215.3
RefSeq_NM NM_021021 NM_003380 NM_012307
RefSeq_NP NP_066301 NP_003371 NP_036439
LocusLink_ID 6641 7431 23136
GB_Accession AK025100|AJ333934|BCX16478|Z19554|AF3287AK094952|BC008377|A
Gene_Symbol SNTB1 VIM EPB41L3
Gene_Name syntrophin, beta 1 (dystr vimentin erythrocyte membrane
Gene_Product basic beta 1 syntrophin vimentin erythrocyte membrane
MedLine 94164965|94240154|961 91067467|22635279|22496026280|22219941|99
PubMed 8119949|8183929|85762 11172097|2472876|12469892180|8401585|1211
OMIM 600026 193060 605331
SwissProt Q13884 P08670 Q9Y2J2
UniGene Hs.95011 Hs.297753 Hs.103839
COILED-COIL
INTERMEDIATE MERLIN/MOESIN/E
FILAMENT FAMILY ZRIN/RADIXIN-
Panther_Family_Name SYNTROPHIN MEMBER RELATED
PROTEIN 4.1-
Panther_Subfamily_Name BETA 1 SYNTROPHIN INTERMEDIATE FILAM RELATED
Cytoskeletal protein - Cytoskeletal protein -
Cytoskeletal protein -
> Other cytoskeletal > Intermediate > Other cytoskeletal
Panther_Function proteins filament proteins
GO:0005198:structu
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ion activity|GO:0003779
binding|GO:0005516: :actin
calmodulin GO:0005200:structur binding|GO:000555
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GO_Molecular_Function actin binding cytoskeleton n unknown
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ular signaling cal_process
GO_Biological_Process cascade unknown
GO:0005856:cytosk
eleton|GO:0005886:
GO_Cellular_Component GO:0005856:cytoskeletoGO:0005871:kinesin co plasma membrane
Cytoband 8q23-q24 10p13 18p11.32
Chromosome_Number 8 10 18Grazie. Domande?
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