Toxoplasmosi negli animali: valutazione dei metodi diagnostici convenzionali ed innovativi e prospettive future Comparison of detection methods ...

Toxoplasmosi negli animali: valutazione dei
   metodi diagnostici convenzionali ed
      innovativi e prospettive future

   Comparison of detection methods for
  Toxoplasma gondii in naturally infected
                animals

    Prof. ssa Daniela Piergili Fioretti

   Dipartimento di Scienze Biopatologiche ed Igiene delle
              Produzioni Animali e Alimentari
         Facoltà di Medicina Veterinaria di Perugia

La Toxoplasmosi è una delle zoonosi più
  diffuse tra gli animali domestici e selvatici.

Si differenzia dalle altre zoonosi perchè
  cosmopolita, grazie al particolare ed unico
  ciclo biologico, e perchè non dimostra
  specificità per alcuna specie animale
  potendo colpire tutti i mammiferi, uomo
  compreso, e molti uccelli.

La toxoplasmosi è un tipico esempio di patologia
      sulla quale convergono gli interessi delle
     diverse specialità della medicina umana e
                     veterinaria.

  Modello di sinergia tra medicina umana e
                  veterinaria

    “ONE MEDICINE- ONE HEALTH”

La toxoplasmosi
è considerata tra
   le maggiori
   “Foodborne
    diseases”

   Negli USA la
toxoplasmosi è la
3a causa di morte
  tra le malattie
    alimentari

Episodi epidemici di toxoplasmosi nella
popolazione umana (Dubey, 2010) associati
  al consumo di acqua di conduttura non
  adeguatamente trattata o ingestione di
     acqua ricreazionale ha portato alla
   definizione di “Waterborne Zoonosis”

WHO raccomanda la raccolta di dati epidemiologici per:

 capire l’importanza delle varie
 sorgenti di infezione per l’uomo;

 controllare la malattia nell’uomo;

  controllare la malattia negli animali.

La direttiva CE 2003/99 (recepita in Italia dal D.L. 4
Aprile 2006, n. 191) ha inserito la toxoplasmosi tra le
zoonosi da sottoporre a sorveglianza in funzione della
situazione epidemiologica nazionale.

               Nonostante questo

 Non esistono dati epidemiologici significativi nè
 per l’infezione nell’uomo e negli animali nè per
    la presenza del parassita negli alimenti.

La CE (2007) ha incaricato l’EFSA (European Food
Safety Authority) di fornire indicazioni circa:

 Metodi ottimali di sorveglianza e di monitoraggio
nella popolazione, negli animali e negli alimenti per la
tutela della salute pubblica;

 Metodi diagnostici da utilizzare per l’evidenziazione
del parassita negli animali (caratterizzati in termini di
sensibilità, specificità, affidabilità, ripetibilità) e negli
alimenti (tipi di campioni da prelevare, fase
produttiva).

DIAGNOSI DI TOXOPLASMOSI ANIMALE

                      FINALITÀ

Tutela della salute              Tutela della salute
        pubblica                       animale
                                         
   Il consumo di                 Forme cliniche sia
   carni crude o                     in animali
      poco cotte                      immuno-
 rappresenta per                 compromessi che
 l’uomo il rischio                  animali sani
    maggiore di
       contrarre
      l’infezione

DIAGNOSI DI TOXOPLASMOSI ANIMALE

                Panel Biological Hazards EFSA
                 Raccomanda di sottoporre ad
                 indagine gli allevamenti ovini,
                   caprini, suini e selvaggina

               Non essendo possibile svelare
               l’infezione al mattatoio, la tutela
                  deve essere fatta a livello di
                      produzione primaria
                  (programma di biosicurezza
                        2007-2013 CE)

DIAGNOSI DI TOXOPLASMOSI ANIMALE

                      FINALITÀ

Tutela della salute              Tutela della salute
        pubblica                       animale
                                         
   Il consumo di                 Forme cliniche sia
   carni crude o                     in animali
      poco cotte                      immuno-
 rappresenta per                 compromessi che
 l’uomo il rischio                  animali sani
    maggiore di
       contrarre
      l’infezione

Manifestazioni cliniche nei pets (gatti, cani) ed
equini

       Fattori legati all’ospite
         -Età dei soggetti
        -Stato immunitario

        Fattori legati al parassita
         -Patogenicità dei ceppi
  (la genotipizzazione degli isolati ha
  portato all’identificazione di diversi
          genotipi Dubey, 2009)
            -Dose infettante

Manifestazioni cliniche nei pets (gatti, cani) ed
equini

          Sintomi clinici legati alla compromissione d’organo
                     Polmonite (rilevante nel cane)

                       Epatite, Miosite, Miocardite
                       Uveite (rilevante nel gatto)

                               Dermatite

                Meningoencefalite (rilevante negli equini)

   sintomi nervosi (depressione del sensorio, incoordinazione motoria,
           alterazioni del comportamento, crisi epilettiformi….)

 IN SOGGETTI IMMUNODEFICIENTI  TOXOPLASMOSI SISTEMICA

Nel gatto Toxoplasma ha importanza sia dal
                   punto di vista epidemiologico sia clinico;

                       La sieroprevalenza varia con l’età
                       (trasmissione orizzontale prevalente
                       sulla verticale), e con lo stile di vita
                       (attività predatoria).

    I gatti randagi mostrano tassi di
sieropositività maggiori rispetto a quelli
                padronali

La maggior parte dei gatti infetti non mostra alcun sintomo

        E’ possibile osservare in prima infezione una
            linfoadenomegalia retromandibolare

 La forma clinica nel gatto è per lo
                       più   rappresentata     da     forme
                       neurologiche (iperestesia,alterazioni
                       comportamentali);

 I segni più frequentemente descritti sono ascrivibili a
  soggetti FIV/FELV+ (in analogia con la specie umana si
  osserva una predisposizione alla toxoplasmosi sistemica);

                     Altre conseguenze dell’infezione sono
                      epatiti, necrosi del pancreas, miositi,
                      miocarditi, uveite/corioretinite.

In presenza di forme oculari o di sintomi
 nervosi è sempre opportuno inserire tra la
 diagnostica di laboratorio la ricerca di
 Toxoplasma

Negli USA sono stati condotti studi sulle
  cause di uveite nel gatto e gli agenti più
  comunemente riscontrati in ordine di
  frequenza sono stati:
  Toxoplasma
  FELV
  FIV
  FIP

MANIFESTAZIONI CLINICHE NEGLI ANIMALI DA
                REDDITO

                     Aborto per passaggio
                     transplacentare favorito da:
                      placente sindesmocoriali,
                     lunghezza gravidanza,
                     virulenza dei ceppi,
                     sistema immune materno.
   OVICAPRINI

MANIFESTAZIONI CLINICHE
              NEGLI ANIMALI DA REDDITO

   CONTAGIO MATERNO IN GESTAZIONE
1-40 GIORNI    70-90 GIORNI   > 110 GIORNI

    ↓              ↓              ↓
  ABORTO   ABORTO FETALE O    SANI MA
EMBRIONALE  NATIMORTALITA’ CONGENITAMETE
                 PER          INFETTI
            TERATOGENESI

Suini (Dubey, 2009)
                     Rare segnalazioni di aborti e
                      nascite premature
                     Rare segnalazioni di polmoniti,
                      miocarditi, encefaliti

 Generalmente infezioni subcliniche o con segni non
  patognomonici quali ipertermia, anoressia, tachipnea

                           Bovini-avicoli non esistono
                           casi conformati di malattia
                           (Dubey, 2008)

DIAGNOSI DI TOXOPLASMOSI ANIMALE

 Iter diagnostico necessita delle risultanze di
  esami in grado di evidenziare il parassita o
  la risposta immune da esso evocata.

 Il reperto clinico ed ematobiochimico non
  sono patognomonici dell’infezione.

Test diretti per evidenziazione del parassita

    Esami coprologici                              Esami biologici
                            Esami istologici

  Esclusivi per felidi                             Emulsioni
                               Campioni
                                                  antibiotate di
  Ricerca di oocisti       bioptici di organi
                                                campioni bioptici
   non sporulate           target (linfonodi,
                             milza, fegato,
                            polmone, SNC).      Inoculazione per via
                                                peritoneale in topini
                                                   cortisonizzati
 Tecnica di flottazione     Sezioni colorate
con soluzione satura di           con
   NaCl, ZnSo4 al 33%        ematossilina-       Prove in vitro su
 (p.s. 1200), Tecnica di        eosina           colture cellulari
        Telemann                                     (VERO,
  (sedimentazione con                           Fibroblasti umani)
acido acetico ed etere)    Immunoistochimica

scarso significato per il
ESAMI COPROLOGICI
                                              breve periodo di patenza
  Limiti e vantaggi
                                              (15 giorni)
                                                                  Oocisti sporulate di
                                                               Isospora felis : 45x35 m
Diagnosi differenziale con oocisti di
Isospora (I. felis, I. rivolta), Sarcocystis
(S. bovifelis, S. ovifelis), Hammondia (H.
hammondi)

 Oocisti parzialmente        Oocisti sporulate di       Oocisti parzialmente sporulate di
 sporulate di T.gondii :   Sarcocystis ovi-felis : m   Hammondia hammondi : 15x10m
       12x10m                    14X9m

IF su sezioni istologiche
ESAMI ISTOLOGICI

Falsa negatività nei casi
      di infezioni
   pauciparassitarie
                             Pseudociste e tachizoiti nel
                             polmone di un cane (IF)

Utile per l’evidenziazione   Preparato istologico colorato
                             con ematossilina-eosina
parassitaria la tecnica di
 immunofluorescenza
          diretta

                             Cisti nel cuore di un ovino

TECNICA DI IMMUNOISTOCHIMICA
     (con anticorpi policlonali) utile per l’evidenziazione parassitaria di
                   forme pseudocistiche e tachizoitiche.

(A) Numerous tachyzoites are present, but are not visible
    (H and E);
(B) Immunohistochemical staining with anti-T. gondiiI
    antibodies; all black spots (arrowheads) are
    tachyzoites (Dubey, 2002).

ESAMI BIOLOGICI
Permettono la riproducibilità del parassita, utili nelle infezioni
pauciparassitarie

                      La circolazione di ceppi
                       cistogeni permette la
                       diagnosi dopo trenta
                     giorni con il reperimento
                          di cisti cerebrali

 Colture cellulari

  Richiedono laboratori specializzati per
      la produzione di linee cellulari.
      Si ha positività dopo 48-72 ore
  dall’inoculo con aree di lisi cellulare e
            clusters di tachizoiti
                                                 Fibroblasti umani invasi da
                                                 tachizoiti di Toxoplasma gondii

ESAMI BIOLOGICI
“CAT FEEDING TEST”

                            POCO ECONOMICHE
                              PIU’ SENSIBILI
                              RISPETTO ALLE
                            PROVE BIOLOGICHE
                                 SU TOPINI

 IL GATTO MANGIA ANCHE 500 GR. DI CARNE E
    PUO’ INFETTARSI CON POCHI BRADIZOITI

TEST BIOMOLECOLARI
Di recente acquisizione e non comprovati su un numero significativo di animali
Lappin, 1996)

  Su sangue, siero,                                  Negatività sull’UA in
        liquor,                                     caso di paucinfezione
  umor acqueo, con                                  o infezione ristretta al
   sensibilità pari a               PCR              segmento posteriore
     quantità di                (amplificazione         (corpo vitreo) o
 DNA equivalenti a 10             del gene B1)            trattamento
  tachizoiti (100 nel                                  farmacologico (la
       sangue)                                        sierologia sull’UA è
                                                        invece positiva)
                Positività sul liquor dirimente per la diagnosi
             (sierologia positiva non discrimina tra produzione
                locale di IgG o passaggio emato-encefalico)

                                       La PCR deve essere associata al
 Diagnosi ante-mortem                  rilievo anticorpale (IFAT, ELISA)

TEST DIRETTI SIEROLOGICI
 ELISA e WESTERN
  BLOT si dimostrano
  validi per la ricerca di
  antigeni circolanti
  (Dubey, 2009)

 Utili nei casi di soggetti immunodepressi

METODI INDIRETTI SIEROLOGICI
 (Per evidenziare la risposta immune specifica e duratura nel
 tempo)
    Primo movimento anticorpale                    Test più precoci e specifici
       IgM e IgG verso antigeni                       quelli che utilizzano il
       cuticolari (Proteina P30)                     parassita intero in fase
                                                           tachizoitica
                                                   Test di riferimento secondo
                                                      OMS: IFAT e Dye Test

MAT (Modified agglutination test)- molto utilizzato per studi epidemiologici
negli animali domestici e selvatici per facilità di utilizzo e non richiesta di
reagenti specie-specifici (Montoya, 2002)

 Popolazione felina buona sensibilità
 Popolazione canina non affidabile

METODI INDIRETTI SIEROLOGICI
(Per evidenziare la risposta immune specifica e duratura nel
tempo)

  Anticorpi IgG verso antigeni
   citoplasmatici più tardivi

         IHA, Elisa
  (Test più accreditato per
      via della migliore
   standardizzazione della
          metodica)

                                 Sensibilità 94,5, specificità 93,6

IFAT ed ELISA sono test di riferimento per la diagnosi in quanto possono
saggiare tutte le classi anticorpali.
Diagnosi di infezione acuta  IgM specifiche e sieroconversione delle IgG

        Difficile stabilire un titolo significativo di malattia.
          Forme asintomatiche con titoli elevati e forme
                 cliniche con titoli molto bassi

          1/16 in IFAT                    1/32 in ELISA
             Validi come cut-off per una diagnosi di
                  infezione nel cane e nel gatto
                    (Dubey, 2004; Silva, 2002)

Test sierologici di recente introduzione
 P30 IgG AVIDITY (con test ELISA) per le IgG
  (validata sul modello in medicina umana)

 P30 IgG AVIDITY (con test ELISA) per le IgG (validata sul
   modello in medicina umana)
Principio di reazione le IgG prodotte nella fase acuta
   presentano una bassa forza di legame con l’antigene
   (bassa avidità), mentre presentano un’elevata avidità nella
   fase cronica

IgG AVIDITY CON TECNICA ELISA

 Pozzetti sensibilizzati con antigene
 Siero diluito
 Lavaggio tampone
 Lavaggio con urea (agente dissociante)
 Anticorpi anti-IgG animali marcati con fosfatasi alcalina
  (coniugato)
 Lavaggio
 Substrato (4-metilumbelliferil fosfato)
La fosfatasi alcalina catalizza l’idrolisi del substrato in un
  prodotto fluorescente
Lettura a 450 nm

Solo gli anticorpi ad alta avidità
  non vengono staccati dall’urea
 Indice di avidità   quantità IgG legate dopo
  trattamento con urea/quantità di IgG legate prima
  del trattamento con urea

            Interpretazione dei risultati
 < 15% bassa avidità  infezione recente (ultimi 3
  mesi)
 15-25% media avidità  ultimi 6 mesi
 >25% alta avidità  infezione cronica

ANIMALI DA REDDITO

          Importante la diagnosi di aborto da Toxoplasma
                          negli ovicaprini
    METODI DIRETTI (per l’evidenziazione del parassita su campioni di
                    cotiledoni placentari,cervello fetale, polmone)

•     Prova biologica  Inoculazione per via peritoneale in
                                 topini cortisonizzati

    • Prove in vitro su colture cellulari
                                             Fissazione, disidratazione,inclusione
          •       Esami istologici
                                             e colorazione delle sezioni con
      •   Esami immunoistochimici            Ematossilina –Eosina
              •    IF diretta

          • Esami biomolecolari                 B1PCR (sensibilità su campioni
                                                 placentari pari a 10 tachizoiti)

•PCR -, prova biologica +

infezioni pauciparassitarie   LIMITI E VANTAGGI

•PCR +, prova biologica –

 parassiti non vitali per
autolisi tissutale (DNA più
resistente)

METODI INDIRETTI SIEROLOGICI

1) IFAT con IgM positive, IgG ad alto titolo (640-1280).

 2)   P30 IgG Avidity ELISA
      (discrimina fra infezione acuta e cronica negli ovini

 →→ alti valori di avidità si rilevano nel 90% delle pecore
   naturalmente infette al mattatoio

 →→ alti valori di avidità (infezione cronica) in pecore con
   problemi abortigeni indicano che probabilmente
   Toxoplasma gondii non è l’agente causale

Salute pubblica
rischio per il consumatore dal
   consumo di carni infette

Diagnosi post-mortem
utile per le indagini sulle carni macellate

                  Per il veterinario ispettore è
                   importante sapere se alla
                      presenza anticorpale
                 corrisponde una presenza del
                      parassita nelle carni!

Diagnosi post-mortem
  utile per le indagini sulle carni macellate
Animali da macello con importanza sanitaria:

 SUINI: alta sieroprevalenza ed alta presenza cistica
nelle carni;

 OVINI-CAPRINI: come sopra (nei caprini
importante il latte e prodotti lattiero caseari);

 BOVINI-BUFALINI: alta sieroprevalenza ma nulla o
scarsissima presenza cistica;

 EQUINI: alta sieroprevalenza e presenza cistica;

Diagnosi post-mortem
 utile per le indagini sulle carni macellate

 POLLI: alta sieroprevalenza (fino all’80%)/alta
presenza cistica nelle carni e rarissima possibilità di
tachizoiti nelle uova;

 SELVAGGINA
Rischio emergente verso carne di capriolo, cinghiale
(circa 15% in Umbria), daino

EFSA 2007- PIU’ DEL 50% DELLA SELVAGGINA
CONSUMATA E’ SIEROPOSITIVA.

L’utilizzo delle tecniche sierologiche (IFAT, ELISA,MAT le più
utilizzate) per la messa in evidenza di IgG (infezione cronica)
ante-mortem, dà risultati non dirimenti per:
1) caduta del tasso anticorpale vicino ai livelli di background
dopo 6-10 mesi dall’infezione;

2) Stesso limite anche con antigeni sempre più purificati
fino ad antigeni ricombinanti (frammenti genici H4 e H11)
usati nella tecnica ELISA (Aubert, 2000);

3) Sierologia positiva non quantizza la carica
parassitaria e quindi non ha valore per l’immissione al
consumo delle carni!

• Tecniche per la ricerca di antigene circolante o DNA del
parassita sono allo studio;
• Sono necessarie tecniche poco costose e ad alto grado di
automazione per l’utilizzo nei mattatoi;
• E’ stata sviluppata una Real-Time PCR con primer la regione
ITS1 della sequenza genica 18SrRNA ed un probe fluorogenico
(Toxo Taq Man assay) in grado di evidenziare 0,1 pg DNA
equivalenti ad 1 bradizoite. Possibilità di automatizzazione,
diagnosi in 24 ore, applicabilità alle carcasse suine (Jauregni,
2001) e prodotti suini commerciabili. Limiti della prova →
campioni troppi piccoli < 1gr. data la distribuzione random delle
cisti e il basso numero delle cisti nei tessuti;
• Attualmente gli unici mezzi diagnostici applicabili nei mattatoi
sono le prove digestive triptiche su campioni di 50 gr di carne
(il carico parassitario è stimato < 1 ciste/50 gr).

Prospettive future
IFAT ed ELISA su succo carneo          TEST         SENSIBILITA’
 Studi preliminari nella
   popolazione suina (Hill et al.,     CAT          100%
   2006, Ranucci et al., 2010).        BIOASSAY
Confronto tra i diversi metodi (Hill   SERUM ELISA 100%
  et al., 2006) su siero di sangue
  e succo carneo                       SERUM MAT    80,64%
Ranucci et al.,hanno evidenziato       TISSUE FLUID 76,9%
  una buona concordanza fra            ELISA
  IFAT su siero e succo carneo
  (K=1) a partire da positività        REAL-TIME    20,51%
  sieriche di 1/32                     PCR
                                       PCR          0

Prospettive future
 Nel suino consentirebbe un monitoraggio della
  presenza del parassita non solo a livello di
  produzione primaria ma anche di industria di
  trasformazione.

 Importante per commerciare prodotti Toxoplasma-
  free dato che la capacità del parassita di
  sopravvivere alle tecnologie di preparazione è
  ancora oggetto di studio.

 La diagnosi di toxoplasmosi sulle carcasse al
  mattatoio per l’immissione al consumo di carni
  Toxoplasma-free rimane ancora un capitolo
  aperto.

CONCLUSIONI

• La complessità biologica del parassita;

• la mosaicità antigenica tipica di ogni stadio biologico;

•la variabilità della risposta immune in rapporto alla
diversità degli ospiti intermedi;

CONCLUSIONI

• le diverse finalità diagnostiche in campo veterinario;

• la variabilità in specificità e sensibilità delle varie
tecniche disponibili e la variabilità interlaboratori
nell’applicazione di una stessa tecnica;

• rendono la diagnosi di toxoplasmosi in campo
animale difficile e legata all’esecuzione contemporanea
di un pannello di metodiche tradizionali ed innovative o
molecolari.

Grazie per la cortese attenzione !!

      Stages of Toxoplasma gondii