MICOSI OPPORTUNISTICHE - CANDIDA ALBICANS ASPERGILLUS SPP GIOVANNI DI BONAVENTURA, BSC, PHD

MICOSI OPPORTUNISTICHE
Candida albicans
Aspergillus spp

               Giovanni Di Bonaventura, BSc, PhD

               CI “Microbiologia e Microbiologia Clinica”
               CL Medicina e Chirurgia
               Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara
               AA 2019-2020

MICOSI OPPORTUNISTICHE
Caratteristiche generali
I funghi opportunisti sono generalmente:
     apatogeni nell’ospite sano
        saprofiti in natura
        componenti della normale flora commensale umana

La infezione si instaura soltanto in presenza di CONDIZIONI PREDISPONENTI:
     fisiologiche (gravidanza, età avanzata)
     eventi traumatici (lesioni, occlusioni)
     difetti immunità cellulo-mediata (linfociti T, macrofagi)
     dismicrobismo (antibioticoterapia prolungata e/o ad ampio spettro)
     immunosoppressione
        iatrogena (contraccettivi orali, antibiotici, steroidi, chemioterapia, cateteri)
        intrinseca (situazioni organiche preesistenti): AIDS, ematopatie, diabete mellito,
         endocrinopatie, ustioni

MICOSI OPPORTUNISTICHE

   Candidiasi (Candida spp)
   Aspergillosi (Aspergillus spp)
   Criptococcosi (Cryptococcus neoformans)
   Zigomicosi (Zygomices spp)
   altre: tricosporonosi (Trichosporon spp), fusariosi (Fusarium spp), penicillosi
    (Penicillium spp)

QUALSIASI fungo presente in natura potrebbe, in teoria, causare micosi opportunistiche

CANDIDIASI - patogenesi

 Candida colonizza 80% della popolazione sana a livello cutaneo e mucosale (vaginale, orale,
  gastrointestinale, rettale) dove viene “controllata” dagli altri componenti la flora
  commensale e, in misura minore, dalla risposta immune
 Immunità vs Candida:
     cellulare: deficit immunitari associati a candidiasi mucocutanee; neutrofili vs candidiasi
      invasive
     umorale: bassi titoli anticorpali vs Ag glicoproteici parietali (scarsa colonizzazione
      gastrointestinale nei primi anni di vita); scarso (incerto) significato protettivo
 Alterazioni di questo equilibrio (dismicrobismo) favoriscono il sopravvento di Candida sulle
  altre popolazioni microbiche (es. lattobacilli) con insorgenza di candidiasi (o candidosi)
 Micosi opportunistica a più alta prevalenza nel mondo
 Infezioni “endogene” ad ampio spettro: da infezioni superficiali (cutanee) a gravi infezioni
  sistemiche
 Candida predilige cute o mucose (umide e/o danneggiate) perché aerobio obbligato
 Eziologia: Candida albicans ed altre specie non-albicans

Candidiasi
 CANDIDA SPP COMUNEMENTE ISOLATE

Le candidiasi vengono causate principalmente, ma non soltanto, da C. albicans

Candida auris – un fungo “attuale”

 Isolato per la prima volta in Giappone nel
  2009, dal canale uditivo di una donna
  ospedalizzata.
 Causa infezioni cutanee e profonde (sangue,
  cuore, cervello) soprattutto in pazienti critici.
 Mortalità rapida (90 giorni) e frequente (40-
  70%) a causa di una diagnosi differenziale
  difficoltosa e di farmaco-resistenza multipla.
 Causa outbreaks nosocomiali, mediante
  trasmissione per contatto (mani e superfici).
 Comparso simultaneamente in differenti
  continenti (Asia, Sudafrica, America del sud)
  con relative cladi.

Candida auris – un fungo “attuale”

 L’emergenza simultanea di differenti cladi
  in differenti continenti potrebbe indicare
  una correlazione con il “climate change”.
 La gran parte dei funghi cresce soltanto a
  temperature ambientali.
 C. auris è in grado di crescere a
  temperature maggiori (40°C).
 La termotolleranza di C. auris può essere
  correlata al riscaldamento globale ed ha
  reso il fungo capace di resistere alla
  restrizione termica dei mammiferi,
  disseminando ai volatili e, quindi, all’uomo.

Candida albicans
MORFOLOGIA
 Fungi Imperfecti (non è nota la riproduzione sessuata)
 Caratteri microscopici:
       cellule lievitiformi gemmanti (blastospore)
       pseudoife (abbondante pseudomicelio)
       clamidospore
       tubulo germinativo: 37°C in presenza di siero
       dimorfico: produce ife “vere” settate (37°C, pH neutro)
       cresce a 42°C

 Caratteri macroscopici:                                         tubulo germinativo

     colonie cremose, bianche (37°C, Sabouraud Dextrose Agar)
     evidenziazione di pseudomicelio con alone opaco e
      sfrangiato (terreni poveri, 25°C)

                                                                       pseudomicelio

Candida albicans - morfologia

Candida albicans
PATOGENICITA’
 Adesività e formazione di biofilm:
     tubulo germinativo più adesivo delle cellule lievitiformi
     colonizzazione di superfici (biotiche e non) per mezzo di adesine, con formazione di biofilm
 Invasività:
     produzione di enzimi extracellulari che lisano la cellula ospite: proteasi, fosfolipasi, etc.
 Plasticità metabolica (utilizzo di differenti sorgenti di C) e morfologica (transizione ifa-lievito,
  dimorfismo)
 Produzione di micotossine
 Elusione della risposta immmunitaria:
     resistenza a fagocitosi, cambiamenti della struttura parietale
     depressione della risposta immune cellulo-mediata secondaria al rilascio in circolo di
      frammenti parietali di mannano (candidosi mucocutanea)
 Induzione di una intensa risposta immunitaria cellulo-mediata:
     responsabile di molte manifestazioni cliniche delle candidiasi

Candida albicans
PATOGENICITA’

CANDIDIASI
Manifestazioni cliniche
 Infezioni CUTANEE
     meno frequenti di quelle mucosali
     localizzate in sedi cutanee caldo-umide (pieghe cutanee,
      ascelle, inguine, spazi interdigitali)
     mimano le infezioni causate dai Dermatofiti:
          cute (intertrigine, candidosi da pannolino)               intertrigine
          sottocutaneo dita (paronichia), unghia (onicomicosi)

                                                                     dermatite da pannolino

                                   paronichia          onicomicosi

CANDIDOSI
 Manifestazioni cliniche
 Infezioni MUCOSALI (MUCO-CUTANEE)
     Mucosa orale:
          stomatite (associato a glossite)
          mughetto: macchie biancastre su lingua e mucosa orale; nel neonato
            (contaminazione durante il parto ad opera di secrezioni vaginali materne)
            e nell’adulto debilitato
     Mucosa esofagea:
          candidosi esofagea (neonati, HIV, diabetici, terapia antibiotica prolungata);
            si presenta con disfagia, dolore retrosternale
     Mucosa genitale:
          vulvo-vaginite (eritema su mucosa vaginale e genitali esterni, leucorrea)
          balanite (infiammazione della testa del glande, prurito e bruciore intensi)
     Candidosi mucocutanea cronica:
          infezioni croniche (cute, unghia, orofaringe) caratterizzate da placche
            ispessite rosse, pustolose, ricoperte da croste; resistenti alla terapia
          spesso associate a timoma ed a condizioni sottostanti (ipotiroidismo,
            iposurrenalismo, ipoparatiroidismo)

CANDIDOSI
Manifestazioni cliniche-III
  Infezioni DISSEMINATE (SISTEMICHE)
      Nell’ospite immunocompromesso (neutropenico) Candida raggiunge la via ematogena
          attraverso lesioni della mucosa orofaringea o gastrointestinale; quindi, dissemina
          verso numerosi siti:

        Peritonite                 Epatosplenica
        Polmonite                  Endoftalmite
        Cistite                    Artrite
        Pielonefrite               Osteomielite
        Endocardite                Meningite
        Miocardite

   Una severa neutropenia è considerata il più importante fattore
   predisponente per infezioni disseminate potenzialmente letali.

PATOGENESI DELLE CANDIDOSI DISSEMINATE
La transizione da una candidosi muco-cutanea ad una infezione disseminata prevede:
1. Adesione delle blastocellule alla mucosa
2. Proliferazione e produzione del tubulo germinativo
3. Produzione di acidi carbossilici a catena corta (piruvato ed acetato quali sottoprodotti del
   metabolismo degli zuccheri). L’acidificazione dell’ambiente causa irritazione mucosale ed
   attivazione delle proteasi fungine vs IgA secretorie protettive
4. Perforazione della membrana basale epiteliale, favorita
   dalla risposta infiammatoria tissutale e dalla liberazione di
   fattori di diffusione quali fosfolipasi e proteasi
5. Adesione delle pseudoife a coaguli fibrinosi ed endotelio
6. Disseminazione sistemica mediante sangue e linfa
7. Rilascio di mannani ad attività immunosoppressiva ed in
   grado di interferire con la presentazione antigenica ai monociti

CANDIDIASI
  Diagnosi
   Campioni
       frammenti di cute/unghia, tamponi (forme cutanee)
       escreato, urine, biopsie, sangue, liquor (forme sistemiche)
  Ricerca DIRETTA:
        Esame microscopico diretto
        Coltura
        Identificazione di C. albicans
  Ricerca INDIRETTA:
        Esame sierologico

I lieviti fanno parte della flora microbica commensale oppure sono colonizzatori transitori.
Pertanto, la rilevanza eziologica di un isolato da campione prelevato da siti sterili (sangue, liquor)
è maggiore vs isolati da campioni provenienti da sorgenti fisiologicamente non sterili
(espettorato, urine).

C. albicans
Esame microscopico

                                             Clamidospore
                                             (esame microscopico a fresco)

    Blastoconidi e pseudoife in essudato
    vaginale (colorazione di Gram )

                                           Test di filamentazione: produzione del tubulo
                                           germinativo (37°C, 2-3 h, in presenza di siero);
                                           esame microscopico a fresco

C. albicans
Isolamento colturale
                       B

                                 colonie cremose, opache e
                                 bianche cresciute su Sabouraud
                                 Dextrose agar (16-20 h, 37°C)

                           pseudomicelio su agar
                           (alone opaco-sfrangiato a 25°C)

C. albicans
       colonie: varianti fenotipiche
                                                      B

                                      Varianti fenotipiche con ife                Varianti fenotipiche a cervello

Switching fenotipico quale possibile
fattore di virulenza; osservato in episodi
di vaginiti ricorrenti

                                                 Varianti fenotipiche ad anello     Varianti fenotipiche a stella

Candida spp
   identificazione di specie
                                                B
                                                               identificazione biochimica

                                                               Utilizzo di differenti substrati per la definizione di
                                                               un corredo enzimatico specie-specifico

identificazione mediante l’utilizzo di terreni “cromogenici”
I substrati cromogenici contenuti nel terreno conferiscono alle
colonie differenti colorazioni sulla base di reazioni enzimatiche
specie-specifiche:
    esosaminidasi per l’identificazione di C. albicans
    fosfatasi, per l’identificazione presuntiva di C. tropicalis,
     C. glabrata, C. krusei

Candida spp
esame sierologico
  L’indagine sierologica (per la ricerca di antigeni o anticorpi) non viene utilizzata di routine

       ELISA, immunofluorescenza, agglutinazione al lattice per la ricerca di:
           Ag mannanico parietale circolante
           Ag citoplasmatici (enolasi, 48 kDa)

       ricerca anticorpale non utile ai fini diagnostici, causa una scarsa reattività
        anticorpale vs Candida spp.

CANDIDIASI
Terapia
Infezione CUTANEA, MUCOCUTANEA
     Terapia ad uso topico (ketoconazolo, miconazolo, nistatina)
     Buona risposta clinica, eccetto per l’onicomicosi
Infezione SISTEMICA*
     Amfotericina B (anche in combinazione con 5’-fluorocitosina) (fungicida ma associata a
      rilevante tossicità)
     Fluconazolo, itraconazolo (scarsa tossicità, ma fungistatici e quindi associati a recidive
      post-terapia)
Infezione MUCOCUTANEA CRONICA*
     Amfotericina B, fluconazolo, itraconazolo

   * Nel paziente immunocompromesso, i migliori risultati si ottengono dopo aver corretto le
   condizioni sottostanti la immunocompromissione

Aspergillus spp

ASPERGILLOSI
Caratteristiche generali
 Eziologia: appartengono al genere Aspergillus oltre 900 specie; solo 5 le
  principali a rilevanza medica (forme invasive):
     A. fumigatus (90%)
     A. flavus, A. niger, A. nidulans, A. terreus
  In realtà, nei soggetti immunocompromessi altre specie possono essere causa
  di infezione (A. amstelodani, A. ustus, A. versicolor, A. glaucus, etc.)

 Reservoir naturale: aria, terreno
 Infezioni esogene
 La gran parte delle specie si riproduce in maniera asessuata; alcune mediante
  ascospore (forma sessuata o telomorfo)
 Ampio spettro di manifestazioni cliniche
 Spesso l’infezione viene rilevata soltanto in sede autoptica

Aspergillus spp
Caratteristiche macroscopiche

                        bottom
top

           A. niger                                 A. flavus

                                  Caratteristiche macroscopiche coloniali:
                                      colonie con aspetto “polveroso”
                                      colore colonia (spore) specie-specifico

         A. fumigatus

Aspergillus spp
           Caratteristiche macroscopiche
            Caratteristiche microscopiche:
                 ife settate (ramificazioni dicotomiche), vescicole,
                  metulae, fialidi, (micro)conidi
                 caratteri morfologici (conidi, fialidi, vescicola) con
                  valenza identificativa (a livello di genere)

                     Aspergillus niger
Aspergillus flavus
                                                   Aspergillus fumigatus

ASPERGILLOSI
Patogenesi e sindromi cliniche

I. Aspergillosi allergica
Inalazione di spore  la persistente colonizzazione induce reazioni di ipersensibilità
     Asma
     Broncopolmonite allergica (dispnea, bronchiectasie, fibrosi di segmenti polmonari)

II. Aspergillosi locale non invasiva
Inalazione di spore  Colonizzazione micotica (di cavità preesistenti) senza invasione dei
        tessuti contigui
      Aspergilloma (polmone, seni paranasali)
Esposizione locale a spore (contatto di spore con cute e/o mucose)
      Otomicosi (otite media esterna da A. niger)
      Onicomicosi
      Infezioni oculari (congiuntivale, corneale, intraoculare)

Aspergillosi polmonare non invasiva
Aspergilloma: «fungus ball»

 Colonizzazione cronica di cavità pre-esistenti
  (sarcoidosi, tubercolosi, polmonite da P. jirovecii)
 Massa solida sferoidale formata da ife settate
  ramificate all’interno di una cavità
 Frequentemente asintomatico (contenuto da
  risposta allergica alla colonizzazione cronica) può
  causare emottisi
 Può evolvere verso forma invasiva o forma sub-
  acuta necrotizzante

ASPERGILLOSI
Patogenesi e sindromi cliniche

III. Aspergillosi invasiva
 Diffusione dalla sede primitiva di infezione (polmoni, seni paranasali) ai tessuti
       circostanti  invasione ifale dei vasi (trombi, infarti, emorragie); elevata
       mortalità.
      polmonare (forma invasiva primaria)
      disseminata (gastrointestinale, cervello, fegato, rene, cute, occhio)

IV. Micotossicosi
Ingestione di prodotti (derrate per allevamento) contaminati con tossine prodotte
      da Aspergillus spp.:
     aflatossine (immunosoppressorie, epatocancerogene),
     gliotossine (inibiscono fagocitosi, pro-apoptotiche)

ASPERGILLOSI POLMONARE INVASIVA
   Patogenesi

A. Inalazione dei conidi (2.5-3 μm); in caso di elusione di barriere
primarie (movimento ciliare, filtro dimensionale), i conidi
raggiungono gli alveoli polmonari.
B. Agglutinazione dei conidi mediata da surfattanti (SP-A/SP-D) e
conseguente fagocitosi da parte dei macrofagi alveolari
polmonari.
In caso di elevata dose conidiale e/o ridotta attività macrofagica:
C. Interazione recettoriale dei conidi con il fibrinogeno.
D. Conidi producono proteasi (serina-proteasi) che rompono le
tight-junctions e migrano nell’epitelio.
E. Ancoraggio alla membrana basale mediante interazione con
recettori per laminina, fibronectina e collagene.
F. Conidi producono elastasi e fosfolipasi che rompono la
membrana basale promuovendo la transmigrazione nel
parenchima polmonare.
G. Trasformazione (gemmazione) dei conidi in ife (produzione di
gliotossine a funzione antifagocitaria) con tropismo per i vasi
sanguigni; angioinvasione che porta ad alterato flusso sanguigno
causando necrosi ischemica.
A questo livello, il meccanismo di difesa più efficace è
rappresentato dai neutrofili.

Aspergillosi invasiva

ASPERGILLOSI
     Diagnosi
La diagnosi è principalmente clinica ma può essere confermata da immagini radiologiche,
dall'istopatologia, e da colorazione e coltura di campioni clinici.
 Campioni:
     sputo, BAL, ma biopsia polmonare per diagnosi definitiva (difficilmente ottenibile per
      grave trombocitopenia, viene generalmente prelevata in sede autoptica)
 Esame microscopico:
     ricerca di: ife settate/dicotomiche e conidi (sputo, BAL), ife intravascolari (tessuto)
     previa colorazione (Gram, ematossilina/eosina, tricromica di Gomori)
 Coltura:
     crescita su numerosi terreni (es. Sabouraud Dextrose Agar senza cicloesimide) ed a
      differenti temperature, sebbene soltanto le specie patogene crescano a 37°C
     isolamento significativo nel paziente compromesso; negativa in caso di aspergilloma e di
      infezione invasiva
 Sierologia
     allergia (ricerca di specifiche IgE in RAST-siero)
     infezione invasiva (ricerca di Ag galattomannano mediante ELISA su BAL o siero)

ASPERGILLOSI
Diagnostica per immagini

                                  TC. Opacizzazione dei seni
     Rx. Probabile aspergilloma
                                  etmoidali e sfenoidali di destra
     del lobo superiore destro

ASPERGILLOSI
Terapia
 Allergica:
     corticosteroidi (in immunocompetenti)
 Aspergilloma (se sintomatica):
     terapia chirurgica (exeresi)
     amfotericina B
 Infezioni locali, superficiali:
     nistatina ad uso topico (otomicosi)
 Infezioni invasive:
     terapia chirurgica
     voriconazolo molto efficace vs Aspergillus spp.
     la comparsa di resistenze richiede una terapia “combinatoria”: amfotericina B + 5’-
      fluorocitosina, echinocandina + voriconazolo

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