Investigation of the gene regulatory networks behind the control of lymphatic endothelial cell identity and function

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Investigation of the gene
regulatory networks behind the
control of lymphatic endothelial cell
identity and function

 Doctoral Thesis

 Author(s):
 Ducoli, Luca

 Publication date:
 2020

 Permanent link:
 https://doi.org/10.3929/ethz-b-000452067

 Rights / license:
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DISS. ETH NO. 26983

 Investigation of the gene regulatory networks
behind the control of lymphatic endothelial cell
              identity and function

       A thesis submitted to attain the degree of
      DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
             (Dr. sc. ETH Zurich)

                     presented by
                     Luca Ducoli

                   MSc in Biology
                  University of Zurich

                 born on 24.06.1989
                 citizen of Trub, Bern

         accepted on the recommendation of
              Prof. Dr. Michael Detmar
                Prof. Dr. Jonathan Hall

                         2020

1. Summary

1.1. Summary

Supply of oxygen, nutrients, signaling molecules and leukocytes to peripheral tissues, removal of waste
products, and the preservation of fluid homeostasis are the major tasks of blood and lymphatic vessels
in vertebrates. Increased activation or impaired function of these vascular networks can contribute to
the development of severe pathological conditions such as cancer, chronic inflammatory diseases,
atherosclerosis, and neurodegeneration. Few other organ systems have such a significant impact on
the organism. While the blood vascular system has been considerably characterized since its discovery,
research in lymphatic biology has only been addressed in depth during the past two decades. In this
time frame, extensive genetic and biochemical studies have revealed the critical role of multiple
signaling factors, adhesion molecules, transcriptional and post-transcriptional regulators that control the
development and reactivation of lymphangiogenesis. It is therefore well established that lymphatic
endothelial cells (LECs) must undergo tight regulatory mechanisms to ensure, on the one hand, the
proper maintenance of their phenotype and, on the other hand, flexible responsiveness to external
environmental changes.

Therefore, in this dissertation, we aimed to increase the general understanding of how LECs employ
their gene expression regulatory portfolio to drive the precise regulation of several aspects that
guarantee their structure, identity, and function.

In the first project, we investigated the global transcriptional response of LECs after specifically
stimulating the vascular endothelial growth factor receptor 3 (VEGFR3), a crucial player in the formation
of the lymphatic system during embryogenesis and under pathological conditions in adults. We found
that activation of VEGFR3 provoked the downregulation of many genes involved in the regulation of
inflammation and immunity, demonstrating the anti-inflammatory effects of VEGFR3 activation on
LECs. Through the comparison of the transcriptional impacts raised after VEGFR3 or VEGFR2
stimulation, we found that both signaling pathways rely on an almost identical downstream regulatory
cascade. Besides, we were also able to identify some genes showing a receptor-dependent regulation
in LECs. Among the identified targets, we found that VEGFR3 stimulation, compared to VEGFR2
stimulation, induces the expression of the transcription factors SOX18 and KLF4, which were previously
shown to be involved in LEC differentiation.

In the second project, we investigated the role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in lymphatic biology.
The technological boost in sequencing techniques has recently allowed researchers to set lncRNAs as
essential regulators of gene expression acting through multiple mechanisms. In a first step, we defined
a landscape of lncRNA candidates expressed in primary human dermal LECs and blood vascular
endothelial cells (BECs). We then established a first robust set of lncRNA candidates with specific
expression in LECs or BECs from neonatal to adult. Antisense-oligonucleotide mediated knockdown of

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these candidates, followed by transcriptional profiling, revealed that knockdown of a lymphatic
endothelial-specific lncRNA, LINC01197, which we renamed LETR1 (lymphatic endothelial
transcriptional regulator lncRNA 1), caused the deregulation of many genes involved mainly in the
control of cell growth and cell migration. With a combination of in vitro functional studies, we confirmed
the involvement of LETR1 in guarding the capability of LECs to grow and migrate. A multilayered
biochemical approach, comprising subcellular localization determination, interaction analysis, and
rescue studies, let us describe the mode of action of LETR1 as a nuclear trans-acting lncRNA
transcriptionally regulating essential target genes governing the growth and migratory ability of LECs.

In conclusion, our studies provide several additional lines of evidence that LECs possess, on one side,
great plasticity in response to specific external stimuli, and, on the other side, they rely on tightly
controlled regulatory networks to maintain their phenotype and function. Moreover, through our analysis
of lncRNAs in vascular biology, we provided the first functional evidence that lncRNAs act as prominent
regulators of vascular biology, highlighting them as novel subjects for future vascular development and
pathology studies.

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1.2. Riassunto

Fornire ossigeno, nutrienti, molecole di segnalazione e leucociti ai tessuti periferici; rimuovere i prodotti
di scarto; e preservare l’omeostasi dei fluidi sono le funzioni principali del sistema vascolare ematico e
linfatico nei vertebrati. Eccessiva attivazione o disfunzione di questi due sistemi circolatori possono
contribuire allo sviluppo di severe condizioni patologiche come cancro, malattie legate ad
infiammazione cronica, arteriosclerosi, e malattie neurodegenerative. Pochi organi hanno un impatto
cosi marcato nell’organismo. Sebbene il sistema vascolare ematico sia stato considerevolmente più
caratterizzato fin dalla sua scoperta, ricerca nel campo della biologia del sistema linfatico è stata solo
affrontata durante le ultime due decadi. In questo spazio temporale, intensi studi genetici e biochimici
hanno mostrato il critico ruolo di molti fattori di segnalazione, molecole di adesione, regolatori
trascrizionali e post-trascrizionali, che controllano lo sviluppo e la riattivazione della linfangiogenesi. Per
questo è ben stabilito che le cellule endoteliali linfatiche debbano subire meccanismi di regolazione
molto rigidi in modo da assicurare, da una parte, una manutenzione ottimale del proprio fenotipo e,
dall’altra, una risposta flessibile a cambiamenti dovuti a fattori ambientali esterni.

Perciò lo scopo di questa dissertazione è di accrescere la nostra comprensione generale di come le
cellule endoteliali linfatiche utilizzano il loro portafoglio di regolazione genica per condurre la precisa
regolazione di molti aspetti che garantiscano la loro struttura, identità, e funzione.

Nel primo progetto, abbiamo investigato la risposta trascrittomica delle cellule endoteliali linfatiche dopo
la stimolazione specifica del recettore VEGFR3 (vascular endothelial growth factor receptor 3), che è
un fattore molto importante per la formazione del sistema linfatico durante l’embriogenesi e in condizioni
patologiche in età adulta. Abbiamo trovato che l’attivazione di VEGFR3 provoca la sottoregolazione di
molti geni coinvolti nella regolazione di processi infiammatori e di immunità dimostrando l’effetto anti-
infiammatorio dell’attivazione del VEGFR3 nelle cellule endoteliali linfatiche. Attraverso il confronto
dell’impatto trascrittomico generato dopo la stimolazione di VEGFR3 and VEGFR2, abbiamo trovato
che entrambi i processi di segnalazione si basano su una simile cascata di regolazione. Nonostante
ciò, abbiamo identificato una serie di geni che mostrano una regolazione specifica a dipendenza del
recettore attivato nelle cellule endoteliali linfatiche. Tra questi geni, abbiamo trovato che la stimolazione
di VEGFR3, in confronto alla stimolazione di VEGFR2, induce l’espressione di fattori di trascrizione, tra
i quali troviamo SOX18 and KLF4, due fattori precedentemente descritti come attori principali nella
differenziazione delle cellule endoteliali linfatiche.

Nel secondo progetto, abbiamo investigato il ruolo dei RNA non codificanti chiamati long noncoding
RNAs (lncRNAs) nella biologia del sistema linfatico. L’avanzamento tecnologico delle tecniche di
sequenziamento ha recentemente permesso ai ricercatori di determinare i lncRNAs come regolatori
essenziali dell’espressione genica attraverso una moltitudine di meccanismi. In primo luogo, abbiamo
definito quali lncRNAs fossero specificamente espressi nelle cellule endoteliali linfatiche o ematiche. In
seguito, abbiamo stabilito un robusto set di candidati con un’espressione specifica in una delle due

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cellule endoteliali che si mantenga da neonato fino ad adulto. L’abbattimento genico usando
oligonucleotidi antisenso seguito da profilazione trascrizionale di questi candidati ha mostrato che
l’assenza di un lncRNA specificamente espresso nelle cellule endoteliali linfatiche chiamato
LINC01197, che abbiamo poi rinominato LETR1 (lymphatic endothelial transcriptional regulator lncRNA
1), causa la deregolazione di molti geni coinvolti maggiormente nel controllo della crescita e migrazione
cellulare. Con una combinazione di studi funzionali in vitro, abbiamo confermato il coinvolgimento di
LETR1 nel proteggere la capacità delle cellule endoteliali linfatiche di crescere e migrare. Un approccio
biochimico multistrato, composto dalla determinazione della localizzazione subcellulare; analisi di
interazione; e studi di salvataggio, ha fatto in modo che potessimo descrivere il meccanismo d’azione
di LETR1 come un lncRNA nucleare che agisce in trans per regolare la trascrizione di geni essenziali
che governano l’abilità di crescita e migratoria delle cellule endoteliali linfatiche.

In conclusione, i nostri studi forniscono diverse prove che le cellule endoteliali linfatiche possiedano, da
una parte, una grande plasticità genica in risposta a specifici stimoli esterni, e, dall’altra, si basano su
network di regolazione severamente controllati con lo scopo di mantenere il proprio fenotipo e la propria
funzione. Inoltre, attraverso la nostra analisi dei lncRNAs nella biologia vascolare, abbiamo fornito la
prima funzionale evidenza che i lncRNAs agiscono come regolatori importanti nella biologia vascolare
proponendoli come nuovi soggetti per futuri studi nel campo dello sviluppo del sistema vascolare e delle
patologie legate a quest’ultimo.

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