Infezione da HPV e metodi di diagnosi molecolare - Dr.ssa Loredana Maurelli

Infezione da HPV e metodi di
     diagnosi molecolare
     Dr.ssa Loredana Maurelli

Infezione da HPV: eziologia

Papillomavirus umani (HPV)

Papillomavirus umani (HPV)

HPV è causa necessaria del cancro
cervicale invasivo in tutto il mondo

I più comuni genotipi di HPV e le
  principali patologie correlate

Dati di incidenza in Europa

Storia naturale dell’infezione da HPV

• le infezioni genitali da HPV sono molto più frequenti intorno ai 20 anni
• la grande maggioranza delle infezioni si risolve (= test HPV negativo) entro uno-due anni
• solo in una piccola percentuale di donne l’infezione persiste e si associa a lesioni, e
anche queste possono regredire spontaneamente  concetto di persistenza (stesso tipo)
• la storia naturale è legata soprattutto al tipo di HPV e allo stato immunitario

Il virus

Il genoma virale

Manifestazione cliniche

Meccanismo trasformante

Meccanismo trasformante

Meccanismo trasformante

Risposta immunitaria

Il test HPV

   Test per l’identificazione di HPV con:
1. Tecniche immunocitochimiche
2. Tecniche molecolari

I Papillomavirus umani non possono essere coltivati in vitro, in
quanto si moltiplicano solo in cheratinociti differenziati, né sono
disponibili saggi sierologici affidabili per identificare infezioni in
atto o passate da HPV

Tecniche immunocitochimiche

Prevedono l’uso di Ab monoclonali o policlonali per la
ricerca di Ag presenti sul capside virale eseguita sia su
sezioni bioptiche che su materiale citologico fresco o
fissato.
Questa metodica presenta una sensibilità non ottimale
(ad es. nei casi in cui gli Ag del capside non sono
espressi).

Tecniche molecolari

Sono tecniche in grado di mettere in evidenza il DNA
e/o l’RNA virale e possono fornire informazioni sulla
presenza di HPV ad alto e/o basso rischio oncogenico
e/o di uno specifico sottotipo.

Metodi per l’individuazione di HPV DNA

Test HC2 – Principio della metodica

• Denaturazione per ottenere il DNA target
• Incubazione dei campioni con sonde ad RNA
• Il DNA di HPV a singolo filamento può così legare sonda a RNA (ibrido DNA/RNA

Test HC2 – Principio della metodica

• La piastra di reazione ha anticorpi specifici per l’ibrido DNA/RNA adeso al
  pozzetto
• Gli ibridi immobilizzati sono rilevati con l’aggiunta di un anticorpo coniugato alla
  fosfatasi alcalina e diretto contro l’ibrido DNA/RNA

Amplificazione genica mediante PCR
      (Reazione Polimerasica a Catena)

•DENATURAZIONE: il DNA è denaturato a 94-96°C, si
                ottengono 2 catene singole

•IBRIDAZIONE:     il DNA ,a 56-65°C è ibridato da
                  coppie di primer specifici alla
                  sequenza bersaglio

•ESTENSIONE:      nel DNA ibridato vengono
                  aggiunti, grazie alla taq polimerasi,
                  i dNTPs in maniera complementare
                  alla catena di DNA preesistente.

Amplificazione genica mediante PCR
       (Reazione Polimerasica a Catena)

Una volta che la reazione di amplificazione è avvenuta
con l’utilizzo di primers consenso, l’identificazione dei
genotipi HPV può essere eseguita con vari metodi

Amplicor HPV Test – Principio della metodica

• Estrazione ed amplificazione del DNA con primer per L1 del genoma HPV
• Ibridazione in pozzetti di micropiastre rivestiti con sonde specifiche per tipi HPV
  alto rischio
• Rilevazione dopo fasi di lavaggio il coniugato avidina-perossidasi si lega agli
  amplificati biotinilati ibridati alle sonde legate ai micropozzetti

PCR in real time

Presenta elevata sensibilità, riproducibilità e velocità di
esecuzione.
Rappresenta l’approccio migliore per la quantificazione
degli acidi nucleici e, in particolare, nel determinare la
carica virale dell’infezione da HPV.
Consente di abbandonare tutte le manipolazioni
successive all’amplificazione, potenziali fonti di
inquinamento del campione.

PCR in Real-Time

Riesce a monitorare l’andamento della PCR in tempo
reale, utilizzando combinazioni di coloranti fluorescenti
accoppiati agli oligonucleotidi che, incorporati nella
catena di DNA neosintetizzata, emettono fluorescenza.
Il segnale fluorescente è rilevato in tempo reale da un
computer che lo trasforma in un grafico nel quale in
ordinata vi è il valore di fluorescenza emessa da
ciascuna molecola di DNA per ciclo di reazione
(rappresentato in ascissa)

PCR in Real-Time

Prevede l’uso di:
• Coloranti che, intercalandosi durante la sintesi della
   doppia elica, sono in grado di emettere fluorescenza
   se opportunamente eccitati, quale il bromuro di
   etidio e il syber Green 1;
• Sonde ad ibridazione legate a molecole fluorescenti
   «reporter» e «quencher» per un approccio
   sequenza specifico

HPV mRNA

La Reverse Trasciptase PCR (RT-PCR) è una tecnica in
grado di testare la presenza dell’ mRNA virale
attraverso un processo di retrotrascrizione innescato
dall’enzima trascrittasi inversa. L’analisi dell’RNA delle
proteine virali E6/E7 e, quindi, la ricerca
dell’espressione oncogenica dell’HPV, ha un valore
clinico rilevante.
Esiste una diretta correlazione tra l’incremento
dell’espressione di E6/E7 e la severità della lesione
citologica.