Corso di Biologia Strutturale - Structural Biology
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Corso di Biologia Strutturale
CdLM in Biologia Cellulare e Molecolare e Scienze Biomediche
Dott. Federico Iacovelli; e‐mail: federico.iacovelli@uniroma2.it
Dipartimento di Biologia, Dente H, Piano 1, Stanza 378H, http://structuralbiology.bio.uniroma2.it/Le proteasi a serina e le superossido dismutasi a rame‐zinco
(SOD)
Le proteasi a serina sono una classe di proteasi che basano il loro meccanismo di catalisi sulla presenza della
serina, particolarmente reattiva ed essenziale per la loro attività enzimatica.
La considerevole uguaglianza strutturale del sito attivo delle serin proteasi implica che i loro meccanismi
catalitici siano simili.
Le SOD a rame e zinco sono invece enzimi caratterizzati da una kcat/KM molto elevata, dovuta al fatto che
il sito attivo è preformato in modo ottimale per reagire con il suo substrato.
Si tratta di una classe di enzimi che viene definita perfetta, per cui considerando la più semplice equazione
per il procedere di una reazione enzimatica:
si verifica la situazione in cui kcat >> k‐1, ovvero la dissociazione del complesso ES è spostata verso la
formazione del prodotto. In questo caso:
kcat/KM = kcat k1 / k‐1 + kcat ~ kcat k1 / kcat ~ k1
l’efficienza enzimatica è assimilabile in prima approssimazione alla velocità di associazione enzima‐
substrato k1.Le proteasi a serina Le proteasi a serina costituiscono una particolare classe di proteasi, il cui meccanismo catalitico si basa sulla fondamentale presenza di un residuo di serina nel sito attivo. Idrolizzano il legame peptidico all’interno di una catena peptidica. Le proteasi a serina eucariotiche (tripsina, la chimotripsina, lʹelastasi) sono molto simili sia a livello del sito catalitico che per struttura tridimensionale. Sono sintetizzate sotto forma di zimogeni inattivi e vengono attivate a seguito di tagli proteolitici. La tripsina e la chimotripsina, ad esempio, vengono sintetizzate nel pancreas ed attivate nellʹintestino ad opera di altre proteasi. Entrambe sono delle endopeptidasi (idrolizzano i legami peptidici interni della proteina, dando origine a frammenti più corti). Un’altra proteasi a serina è la subtilisina, isolata dal batterio Bacillus subtilis. Possiede un sito attivo identico, ma una struttura tridimensionale del tutto differente e non correlata a quella delle altre proteasi.
Le proteasi a serina
Chimotripsina Elastasi Subtilisina
La principale forza motrice della catalisi delle proteasi a serina è rappresentata da un insieme di tre
aminoacidi, denominati “triade catalitica” (una serina, un’istidina ed un aspartico), conservata in tutte
le proteasi in una posizione spaziale idonea al taglio di specifici legami peptidici.Formazione della chimotripsina attiva
La forma attiva della chimotripsina è costituita da tre catene
peptidiche che traggono origine da una singola catena iniziale
denominata chimotripsinogeno.
Come si può osservare in figura, il chimotripsinogeno è
formato da 245 residui e ospita cinque ponti disolfuro.Formazione della chimotripsina attiva
Il processo di maturazione avviene in seguito a quattro tagli
sequenziali che avvengono sui legami peptidici che seguono
i residui 13 e 15 e 146 e 148.
I due dipeptidi costituiti dai residui 14‐15 e 147‐148
vengono rilasciati, mentre i tre nuovi polipeptidi sono
tenuti assieme dai ponti disolfuro, oltre che dalle interazioni
non covalenti.
L’eliminazione dei due dipeptidi porta ad un
riarrangiamento tridimensionale.
In particolare, l’eliminazione del dipeptide 14‐15 conduce
alla formazione di un ponte salino tra il nuovo N‐terminale
del residuo 16 e l’aspartico 194, il quale provoca un
riarrangiamento della serina 195, (facente parte della triade),
indispensabile per l’attivazione dell’enzima.Triade catalitica
La triade è conservata in più proteasi a serina, tra cui la
subtilisina di origine batterica, non correlata da un punto
di vista strutturale con le proteasi a serina digestive, come
la tripsina e la chimotripsina.
La triade catalitica è conservata anche nella
carbossipeptidasi II, un’esopeptidasi isolata dal germe di
grano.
Nei tre tipi di proteasi, l’ordine delle sequenze
amminoacidiche primarie dei residui localizzati nei
corrispondenti siti attivi è molto diverso, così come
differenti sono le strutture tridimensionali delle proteine.
Conseguentemente, lapossibilità che tali proteasi siano
state originate da una proteina ancestrale comune è
davvero remota.Le quattro caratteristiche strutturali delle proteasi a
serina necessarie a conferirne la funzione
Le proteasi a serina sono caratterizzate da
quattro caratteristiche strutturali conservate
necessarie al mantenimento ed all’ottimizzazione
del proprio meccanismo catalitico:
1. la triade catalitica;
2. la buca dell’ossianione;
3. la tasca di specificità;
4. la capacità di instaurare interazioni deboli
aspecifiche.Triade catalitica La triade catalitica è costituita da tre aminoacidi: serina, istidina e aspartico. Nella chimotripsina si trovano in posizione Ser195‐His57‐Asp102. Nella subtilisina in posizione Ser221‐His64‐Asp32. La triade è fortemente conservata e permette l’attacco nucleofilo della serina sul carbonio del legame peptidico che deve essere tagliato.
Buca dell’ossianione
Nel processo catalitico la buca dell’ossianione delle
proteasi è l’elemento che consente l’accelerazione della
reazione enzimatica.
Serve infatti a stabilizzare il complesso di transizione e
quindi ad abbassarne l’energia di attivazione.
La stabilizzazione avviene attraverso legami idrogeno
tra gruppi presenti in questa cavità e l’ossigeno legato al
carbonio, a sua volta legato dalla catena laterale della
serina.
Nella chimotripsina, ad esempio, si ha la formazione di 2
legami idrogeno tra l’ossigeno parzialmente negativo del
carbonile e 2 NH della catena principale di Ser195 e
Gly193.
La capacità di legare in modo efficace il complesso di
transizione tetraedrico velocizza la reazione.Tasca di specificità Le proteasi a serina manifestano una parziale specificità nella proteolisi di legami peptidici prossimi ad alcune catene laterali. Considerando come punto di partenza il gruppo N‐terminale della proteina substrato, la catena laterale di riconoscimento precede il legame che deve essere tagliato. La specificità è a carico di una tasca i cui elementi principali sono 3 residui, la cui dimensione e carica varia a seconda della catena laterale della proteina substrato con cui devono interagire.
Interazioni aspecifiche Il riconoscimento tra la proteasi e la proteina substrato avviene attraverso una serie di legami idrogeno tra le due catene principali. Nello specifico, essi avvengono attraverso un “loop” presente nella proteasi e la proteina substrato. Questa interazione porta alla formazione di un breve foglietto β antiparallelo con la proteina substrato. In particolare uno di questi legami a idrogeno si «fortifica» (riducendo la sua distanza) nel passaggio dal complesso enzima‐substrato alla formazione dello stato di transizione. Si rileva, in tal modo, la sua utilità ai fini della stabilizzazione dello stato di transizione e, quindi, dell’accelerazione della reazione.
Reazione catalitica
Le proteasi a serina sono così denominate perchè un
residuo di serina è responsabile dellʹattacco nucleofilo al
carbonile del legame peptidico.
Normalmente lʹossidrile della serina non è un buon
nucleofilo, in quanto il pK di dissociazione del protone
è estremamente elevato e quindi il suo protone non si
stacca.
Nelle proteasi a serina, però, è presente la ʺtriade
cataliticaʺ, che coinvolge i residui amminoacidici Asp‐
102, His‐57 e Ser‐195 la cui funzione è quello di
abbassare il pKa dellʹossidrile della serina
permettendone la ionizzazione.Reazione catalitica
Il primo evento del meccanismo catalitico è l’interazione
enzima‐substrato.
Questo riconoscimento permette la cessione del protone
dell’ossidrile della catena laterale della serina 195
all’istidina 57 che diventa doppiamente protonata ed è
stabilizzata dalla carica negativa dell’Asp102.
L’Asp102 non si protona durante il processo di catalisi
avendo un pKa < 2, bensì orienta His57 in modo tale che
possa prendere il protone da Ser195 e stabilizza la carica
positiva di His57 protonata.Reazione catalitica
La serina sarà così in grado di effettuare
l’attacco nucleofilo al carbonio carbonilico del
legame peptidico, generando un intermedio
tetraedrico
Lʹintermedio tetraedrico è stabilizzato dalla
formazione di legami idrogeno tra lʹossigeno
del carbonile interagente con la serina ed i
gruppi NH di Gly‐193 e Ser‐195.Reazione catalitica
Successivamente, lʹintermedio tetraedrico collassa
nell’intermedio acil‐enzima.
In seguito alla catalisi acida esercitata da His57,
avviene la donazione di un protone da parte del N3
dell’istidina.
L’acil‐enzima è estremamente instabile ma è stato
caratterizzato strutturalmente, attraverso diffrazione a
raggi X, nell’elastasi bloccandolo a basse temperature.
In tal modo, si verifica la liberazione della porzione
del polipeptide con NH2 terminale, ma il resto del
polipeptide risulta legato con legame estere a Ser195.Reazione catalitica Il nuovo gruppo aminico viene rilasciato e sostituito da una molecola di acqua che interagisce con l’N3 dell’istidina.
Reazione catalitica
Il residuo di His57 preleva un protone dalla
molecola di acqua generando un gruppo
ossidrilico che attacca il carbonio carbonilico: si
genera così un nuovo intermedio tetraedrico.
Lʹintermedio tetraedrico viene stabilizzato dalla
formazione di legami idrogeno tra lʹossianione ed
i gruppi NH di Gly193 e Ser195.Reazione catalitica
Lʹintermedio tetraedrico collassa a causa della catalisi
acida esercitata da His57, ovvero His57 cede un protone
alla catena laterale di Ser195.
La seconda parte del polipeptide viene rilasciata e la
proteasi torna nello stato iniziale, pronta per un nuovo
ciclo di catalisi.
In questa parte della reazione l’acqua è il gruppo
nucleofilo e la serina è il gruppo uscente.La buca dell’ossianione L’importanza della buca dell’ossianione è stata messa in evidenza dall’analisi comparata di alcune strutture di proteasi a serina e loro inibitori ottenute per diffrazione X. Lo schema della proteina in prossimità della buca, riportato in figura, mostra l’interazione tra la proteasi ed il substrato prima e dopo la formazione dello stato di transizione. Prima della formazione dello stato di transizione, il carbonio carbonilico del legame peptidico che deve essere proteolizzato viene distorto per entrare nella tasca dell’ossianione, ma non riesce ad effettuare nessuna interazione non covalente con i residui della proteasi.
La buca dell’ossianione Successivamente alla formazione del complesso tetraedrico (ovvero dello stato di transizione), l’ossigeno del gruppo carbonilico, provvisto di carica negativa (ossianione), interagisce e forma un legame idrogeno con il gruppo NH della catena principale sia di Ser 195 che di Gly 193. Inoltre, la distorsione avvenuta a causa della formazione del complesso tetraedrico, porta alla creazione di un ulteriore legame idrogeno tra il gruppo NH del residuo, che precede il legame peptidico ed il carbonile della Gly 193. Il complesso tetraedrico ha, rispetto al legame enzima‐substrato, un legame preferenziale con la proteasi, che conferisce gran parte dell’efficienza della proteasi stessa.
La tripsina ed il suo inibitore
Una dimostrazione dell’esistenza del complesso
tetraedrico è data dalla struttura derivante dalla
diffrazione a raggi X del cristallo della tripsina, coordinata
con il suo inibitore naturale, l’inibitore della proteasi
tripsina pancreatica bovina (BPTI).
Il BPTI è una piccola proteina di 58 residui che forma con
la tripsina un complesso molto stabile, grazie ad una
notevole complementarità di superficie ed alla presenza
di numerose interazioni deboli (vdW e elettrostatica).
La costante di dissociazione tra queste due proteine è 10‐13
M e questa forte interazione impedisce a qualsiasi
molecola di tripsina, che sia stata attivata prematuramente
nel pancreas, di svolgere una qualsiasi attività proteolitica
sulle proteine presenti nell’organo.La tripsina ed il suo inibitore
Il BPTI interagisce con la proteasi tramite un’interazione
simil‐substrato.
La catena laterale di una lisina si introduce nella tasca di
specificità ed il legame peptidico Lys‐Ala si posiziona con il
carbonio carbonilico pronto ad essere attaccato dalla catena
laterale della serina del sito attivo.
Il complesso ha una conformazione che si trova lungo le
coordinate di reazione, che conduce alla formazione del
complesso tetraedrico.
L’ossigeno della serina crea contatti van der Waals con il
carbonio carbonilico del legame peptidico del BPTI, tuttavia
la reazione non procede perché, essendo il complesso
sigillato, il gruppo non può essere allontanato e l’acqua non
può entrare.
Di conseguenza, il sistema non si deforma, non si ottimizza
la formazione del complesso tetraedrico ed il BPTI funge da
inibitore perfetto.Caratteristiche generali della struttura delle proteasi a serina
Le strutture tridimensionali delle proteasi a
serina eucariotiche sono molto simili.
La prima struttura è stata risolta nel 1967 ed
è quella della chimotripsina.
La proteina è costituita da due domini,
ognuno di circa 120 residui.
Ogni dominio forma un barile β composto
da sei filamenti di cui i primi quattro
formano un motivo a greca e gli ultimi due
un motivo a forcina antiparallela.
Il sito attivo si trova in una cavità compresa
tra i due domini ed i residui che
costituiscono la triade catalitica si trovano
sui “loop” di connessione dei filamenti β.Caratteristiche generali della struttura delle proteasi a serina
Due residui, l’His57 e l’Asp102, sono presenti sul primo dominio,
l’altro, la Ser195 si trova sul secondo.
In dettaglio: l’His57 e la Ser195 sono all’interno del “loop” 3‐4 del
dominio 1 e 2 rispettivamente, mentre l’Asp 102 è nel “loop” 5‐6
del dominio 2.
Gli altri residui che possono considerarsi parte del sito attivo, quali
i residui che definiscono la tasca di specificità o che formano
legami idrogeno con la catena principale della proteina substrato,
si trovano sui “loops” 3‐4 e 5‐6 del dominio 2.
Anche in questo caso è rispettata la regola generale secondo cui la
parte strutturale e la parte funzionale sono localizzate in regioni
differenti dell’enzima.
La parte strutturale è costituita dai filamenti β che formano il
barilotto, mentre la parte del sito attivo si trova sulle anse di
connessione dei filamenti β.Caratteristiche generali della struttura delle proteasi a serina
I due domini presentano un basso grado di identità, ma sono
molto simili da un punto di vista tridimensionale.
Ciò fa supporre che queste proteasi siano frutto di una
duplicazione genica di un unico gene ancestrale.
Tuttavia, quest’ultimo non avrebbe potuto possedere la triade
catalitica, in quanto i residui della triade si trovano uno su un
dominio e due sull’altro, contravvenendo all’ipotesi
formulata.
Vari esperimenti di mutagenesi sito‐diretta hanno
evidenziato che le proteasi continuano ad avere un’attività
catalitica anche dopo eliminazione di alcuni residui della
triade, dimostrando che la triade non è essenziale ma serve
ad ottimizzare l’efficienza enzimatica.
È plausibile dunque ritenere che le proteasi derivino da
duplicazione di un unico gene ancestrale.Caratteristiche generali della struttura delle proteasi a serina Ulteriore peculiarità delle proteasi consiste nel fatto che la tasca di specificità, accomodando la catena laterale del residuo precedente il legame peptidico che deve essere proteolizzato, determina la specificità di taglio. In figura sono rappresentate le tasche della chimotripsina, tripsina ed elastasi. La specificità è essenzialmente determinata dalla tipologia delle catene laterali degli amminoacidi in posizione 189, 216 e 226. Le loro caratteristiche chimico‐fisiche ne determinano la specificità: nella chimotripsina la tasca è specifica per catene laterali aromatiche, nella tripsina per catene laterali cariche positivamente e nell’elastasi per catene laterali di dimensioni ridotte.
La proteasi a serina subtilisina
La subtilisina è una proteasi batterica a serina con
caratteristiche strutturali completamente differenti da
quelle eucariotiche.
La subtilisina è una proteina di 275 residui con una
struttura tridimensionale complessa, in cui il dominio
principale è rappresentato dal dominio N‐terminale,
costituito da cinque filamenti β paralleli circondata da
quattro α‐eliche, due per ogni lato.
Il motivo strutturale che caratterizza la subtilisina è un
motivo di tipo α/β in cui è presente un’eccezione
strutturale.La proteasi a serina subtilisina Infatti, tutti i motivi di tipo β‐α‐β presenti nelle proteine sono di tipo destrorso, mentre nella subtilisina il motivo β2‐αB‐β3 è di tipo sinistrorso, come si può osservare nel diagramma topologico. Il motivo di questa eccezione è dovuto al fatto che l’His64, facente parte della triade catalitica, è situata nel primo giro dell’elica αB. Se il motivo fosse destrorso, la posizione tridimensionale dell’istidina sarebbe inadatta a formare la triade catalitica.
La proteasi a serina subtilisina Nonostante le forti diversità strutturali tra la subtilisina e le altre proteasi a serina, anche questa proteasi batterica possiede le quattro caratteristiche strutturali tipiche delle proteasi a serina. Si configura quindi un palese caso di evoluzione convergente a livello molecolare. La subtilisina è stata ampiamente studiata al fine di comprendere in profondità il meccanismo di funzionamento delle proteasi a serina. In particolare, alcuni studi hanno permesso di delineare bene il ruolo della buca dell’ossianione nella stabilizzazione dello stato di transizione.
La proteasi a serina subtilisina
Nella subtilisina, il complesso tetraedrico viene stabilizzato da
legami idrogeno che avvengono con la catena laterale
dell’asparagina 155 e non con la catena principale.
Eliminando per mutagenesi sito diretta questo residuo, è stato
possibile verificarne il ruolo da un punto di vista funzionale.
Sostituendo l’Asn155 con un altro aminoacido, la cui catena
laterale non è in grado di effettuare legame idrogeno con il
complesso tetraedrico, si riduce il valore di kcat/KM.
Tale diminuzione deriva da una riduzione del valore di kcat,
perché eliminando la possibilità di effettuare il legame idrogeno
non si abbassa l’energia di attivazione del complesso di
transizione.
La buca dell’ossianione ha quindi un ruolo determinante nel
modulare l’efficienza catalitica di questa classe di enzimi.Superossido dismutasi
Le superossido dismutasi sono una classe di metallo enzimi che catalizzano la dismutazione dello
ione superossido in perossido di idrogeno ed ossigeno, attraverso la riduzione ciclica del rame
presente nel sito attivo.
La reazione è la seguente:
2O2‐. + 2H+ O2 + H2O2
La funzione di questo enzima è di proteggere le cellule dall’azione tossica del radicale superossido
che si forma nelle cellule aerobiche, principalmente a causa della perdita di elettroni dai diversi
componenti delle catene di trasporto elettronico.
Le superossido dismutasi sono ubiquitarie, risultando presenti in quasi tutti i sistemi biologici aerobi.Superossido dismutasi
In base alla natura del metallo prostetico presente nel sito
attivo, che consente loro di svolgere l’attività catalitica, sono
distinte in Cu,ZnSOD, FeSOD e MnSOD.
Le ultime due sono caratterizzate da una simile struttura
secondaria (ad α‐elica) e terziaria e sono presumibilmente
evolute da uno stesso gene ancestrale.
Le superossido dismutasi a rame‐zinco, Cu,Zn‐SOD, sono
caratterizzate da una struttura secondaria a foglietti β
organizzati in motivi strutturali a greca a formare una
struttura terziaria a barile.
Generalmente, negli eucarioti si trova nel citoplasma, ma è
stata riscontrata anche nel periplasma dei batteri gram‐
negativi.Caratteristiche strutturali delle Cu,ZnSOD
Le Cu,Zn‐SOD eucariotiche sono proteine omodimeriche di
peso molecolare pari a 32 KDa.
Ogni subunità è composta da circa 150 aminoacidi e contiene
un atomo di rame, essenziale per il processo catalitico, e uno
di zinco che ha principalmente funzione strutturale.
La subunità è costituita da otto filamenti β antiparalleli,
disposti in una struttura terziaria a cilindro leggermente
schiacciato da un lato e collegati tra loro da tre lunghe anse
(“loop” 4,7‐ “loop” 6,5‐ “loop” 7,8) e da regioni con inversione
di catena (“turns”and “tight turns”).
La struttura è a β‐barrel ed evidenzia il motivo topologico
definito a “greca” che è comune a molti sistemi biologici di
grande interesse, tra cui le immunoglobuline.Caratteristiche strutturali delle Cu,ZnSOD Il cilindro è asimmetrico e può essere diviso in due sezioni: una comprende dal primo al quarto segmento β, l’altra dal quinto all’ottavo. I segmenti β di questʹultima sono più corti, instaurano un numero inferiore di legami idrogeno, possiedono unʹalternanza meno regolare delle catene laterali e una maggiore distorsione, spiegando così l’asimmetria del cilindro β. Sono presenti tre anse principali: la 6,5; la 7,8 e la 4,7.
Caratteristiche strutturali delle Cu,ZnSOD Lʹansa 6,5 può essere divisa in due sottodomini: • il primo, che si estende dalla Gly47 alla Pro60, contribuisce al contatto tra le subunità, forma un lato del canale del sito attivo ed è stabilizzato dallʹunico ponte disolfuro del monomero (Cys55‐Cys144); • il secondo, che comprende i residui tra His61 e Leu82, è la regione che include i quattro ligandi dello zinco che provvedono a mantenere lo ione completamente nascosto al solvente.
Caratteristiche strutturali delle Cu,ZnSOD Lʹansa 7,8 forma una sorta di coperchio sul sito attivo ed è funzionalmente rilevante, in quanto contiene i residui che, attraverso un’attrazione elettrostatica, guidano il substrato nel canale del sito attivo verso il rame catalitico Cu(II). Lʹansa 4,7 è la più piccola e lega lʹAsp99 allʹArg113 dando origine ad una connessione a greca che attraversa una estremità del cilindro β.
Struttura del sito attivo metallico
Studi di cristallografia e spettroscopia hanno dimostrato
che la struttura del sito attivo della superossido dismutasi
a rame e zinco è altamente conservata.
Il sito catalitico di ciascuna subunità è orientato nella
regione opposta all’interfaccia che le unisce ed è costituito
da un lungo canale che ha per base il foglietto β del
cilindro ed è delimitato lateralmente dalle anse 6,5 e 7,8,
creando una sorta di coperchio attorno ad esso.
In fondo al canale si collocano il rame e lo zinco, il primo
esposto al solvente, mentre il secondo è inaccessibile ad
esso.Struttura del sito attivo metallico
Il rame è coordinato agli atomi di azoto di quattro
istidine: His44 e His 46 localizzate nel sesto segmento β,
His118 del settimo segmento β e His61 del “loop” 6,5.
La disposizione dei suoi ligandi determina la geometria
quadrato planare con distorsione tetraedrica.
La distorsione, insieme al particolare orientamento degli
anelli imidazolici, rende la posizione del rame più aperta
dal lato del solvente, permettendo la presenza di una
molecola di acqua coordinata in posizione assiale.
In diversi enzimi eucariotici si è osservato che lʹHis61
forma un ponte tra il rame e lo zinco, per cui i due metalli
sono compresi in un piano a circa 6 Å di distanza.Struttura del sito attivo metallico
I ligandi dello zinco sono collocati sul “loop” 6,5 e sono
rispettivamente l’atomo di azoto delle His61, 69, 78 ed il
residuo Asp81.
La geometria del sito è di tipo tetraedrico, con una
distorsione a piramide trigonale con l’Asp81 all’apice.
I tre anelli delle istidine sono collocati quasi di fronte allo
zinco in direzione del sito attivo: l’atomo risulta così
interno alla struttura proteica ed inaccessibile al solvente.
I due metalli rappresentano il cuore del sito attivo con
l’atomo di rame direttamente coinvolto nella reazione di
ossido riduzione necessaria a dismutare lo ione
superossido.Struttura del sito attivo metallico
Esistono tuttavia alcuni residui proteici, oltre ai ligandi
dei metalli, che hanno un ruolo fondamentale nel
processo catalitico.
In particolare, tutte le superossido dismutasi a rame e
zinco analizzate presentano in posizione 141 un residuo
di arginina che è altamente conservato.
Questo residuo si posiziona frontalmente all’atomo di
rame e risulta determinante sia nell’attrazione che nel
posizionamento dell’ione superossido.Meccanismo di catalisi enzimatica
Il ciclo catalitico è costituito da due reazioni in cui lo ione
superossido reagisce alternativamente con il rame alla
stato ossidato e allo stato ridotto.
Le due reazioni sono caratterizzate da una medesima
efficienza catalitica, essendo per ambedue kcat/KM
identica e molto elevata, dell’ordine di 2x109 M‐1 s‐1 .
La catalisi ha inizio con il sopraggiungere di una molecola
di ione superossido, che spiazza la molecola d’acqua
assiale, legando un atomo di ossigeno al Cu2+ e formando
con l’altro un legame idrogeno con l’azoto del guanidinio
di Arg141, il quale stabilizza il complesso rame‐substrato.Meccanismo di catalisi enzimatica
L’O2‐. legato provoca la riduzione di Cu2+ ʺrameicoʺ alla
forma Cu+ ʺrameoso” e contemporaneamente si rompe il
legame tra l’His61 ed il rame, viene rilasciato O2 e l’azoto
di His61 dissociato si protona.
Una seconda molecola di O2‐. si lega con il rame nello stato
ridotto Cu+.
Un trasferimento elettronico dal Cu+ abbinato ad un
trasferimento protonico dall’His61, con l’aggiunta di un
secondo protone, proveniente da una molecola di acqua
del solvente, permette la formazione di una molecola
neutra di H2O2, che viene eliminata.
Il rame, allo stato ossidato, ripristina il legame con l’azoto
di His61 deprotonata, con conseguente ritorno allo stato
strutturale iniziale del sito attivo.L’ipotesi elettrostatica
Dati sperimentali hanno dimostrato che l’efficienza di dismutazione dello ione superossido è identica
sia per l’enzima con il rame allo stato ossidato che in quello ridotto.
Inoltre, il valore di kcat/KM è molto elevato, dell’ordine di 2x109 M‐1 s‐1, uno dei maggiori mai
riscontrati per qualsiasi famiglia di enzimi.
Tali dati indicano che si tratta di una reazione ai limiti della diffusione, sia quando il rame è ossidato
sia quando il rame è ridotto.
La chimica dell’enzima non risulta in grado di influenzare l’efficienza enzimatica, perciò l’efficienza è
governata da fattori fisici indipendenti dallo stato di ossidazione del rame.
Un risultato sperimentale interessante riguarda la misura dell’efficienza enzimatica
kcat/KM in funzione del pH e della forza ionica.L’ipotesi elettrostatica
Questa misura, riportata nel grafico, indica che ad ogni
singola forza ionica l’efficienza è pH indipendente per
valori di pH compresi tra 7 e 9.
Per valori superiori l’efficienza diminuisce, ma in
percentuale inferiore se i valori di forza ionica sono alti.
In particolare, mentre per valori di pH tra 7 e 10 l’efficienza
diminuisce all’aumentare della forza ionica, per valori di
pH tra 11 e 12 l’efficienza catalitica è quasi costante
qualsiasi valore assuma la forza ionica.
La dipendenza del valore di kcat/KM dalla forza ionica
indica che tale parametro è condizionato dall’elettrostatica.
Inoltre, la diminuzione di kcat/KM all’aumentare del pH
presuppone la presenza di uno o più gruppi con un pK
intorno a 10.5, la cui deprotonazione produce una
riduzione dell’efficienza catalitica.L’ipotesi elettrostatica
I dati sperimentali hanno portato alla formulazione
della così detta “ipotesi elettrostatica”, secondo la
quale il meccanismo guida per lʹinterazione enzima‐
substrato si basa sulla presenza di cariche positive
nellʹarea circostante il sito attivo.
La proteina è infatti circondata da valori di
potenziale negativi, tranne che in due regioni
definite corrispondenti alla regione occupata dal
sito attivo.
Lo ione superossido, a carica negativa, viene
respinto da ogni regione della proteina, ad
eccezione delle regioni che contengono il sito attivo.
Le cariche presenti sulla proteina creano un imbuto
elettrostatico che convoglia il superossido verso la
regione del sito attivo.L’ipotesi elettrostatica
Vi è quindi un’agevolazione elettrostatica alla
diffusione del superossido verso il sito attivo, che
risulta identica sia per la proteina ossidata che per
quella ridotta, spiegando l’identicità del valore di
kcat/KM.
L’ipotesi elettrostatica giustifica anche l’alto valore
di kcat/KM, infatti la superficie occupata dal sito
attivo è una piccola percentuale della superficie
totale dell’enzima.
Se la collisione dello ione superossido con il sito
attivo fosse determinata unicamente dalla
diffusione, la sua probabilità sarebbe bassa e la
superossido dismutasi non potrebbe avere gli alti
valori di kcat/KM misurati sperimentalmente.L’ipotesi elettrostatica
È stato inoltre dimostrato che la
distribuzione del potenziale elettrostatico
è invariata nel corso dell’evoluzione,
essendo indipendente sia dalla carica
netta delle proteine, che dalla
conservazione di singoli residuiL’ipotesi elettrostatica: considerazioni finali
L’ipotesi elettrostatica conferma che l’efficienza catalitica non è modulata dalla chimica dell’enzima
bensì dalla fisica, o meglio, dalla distribuzione del potenziale elettrostatico.
Le superossido dismutasi a rame e zinco sono quindi enzimi caratterizzati da una kcat/KM molto
elevata.
Ciò è dovuto al fatto che il sito attivo è preformato in modo ottimale per reagire con il suo substrato e
che il limite al processamento del substrato è determinato unicamente dalla capacità del substrato di
raggiungere il sito attivo.
Si tratta di una classe di enzimi che viene definita perfetta, poiché nel caso della SOD l’efficienza
enzimatica è assimilabile in prima approssimazione alla velocità di associazione enzima‐substrato k1.
L’unica via per migliorare l’efficienza di questo enzima è di
attrarre in maniera ottimale il substrato verso il sito attivo.Migliorare efficienza della SOD
L’efficienza catalitica si può migliorare ottimizzando la
distribuzione del potenziale elettrostatico e rendendo
l’imbuto più efficiente nel processo di attrazione del
substrato carico negativo.
Tale approccio è stato perseguito introducendo
aminoacidi a carica positiva ed eliminando aminoacidi a
carica negativa in prossimità del sito attivo, dando luogo
ad enzimi superefficienti con kcat/KM dell’ordine di 1 x
1010 M‐1 s‐1.
Questi esperimenti, oltre ad aver originato mutanti
super‐efficienti, hanno dimostrato definitivamente che lo
step limitante della reazione enzimatica non si trova
all’interno della chimica dell’enzima.
Bensì, si trova al di fuori dell’enzima stesso: lo step
limitante consiste infatti nella capacità dell’enzima di
attrarre il substrato verso se stesso.Puoi anche leggere
