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C.I. MEDICINA DI LABORATORIO
Microbiologia Clinica
CL Medicina e Chirurgia – AA 2018-2019
Modulo 8: TUBERCOLOSI
Giovanni Di Bonaventura, PhD
Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara
Dipartimento di Scienze Mediche, Orali e Biotecnologiche
Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel 0871 3554812)
Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel 0871 541519)
E-mail: gdibonaventura@unich.it
M. tuberculosis
▪ Lenta crescita (tempo di generazione medio: 15-20 h)
▪ Acidi micolici e superficie cerosa
▪ Infezione primaria
– tubercoli, caseosa, reazione alla tubercolina
▪ Infezione secondaria (riattivazione)
– consolidamento
▪ Disseminazione
– TB extrapolmonare (linfonodi, rene, ossa, tratto genitale, cervello, meningi)
Il tubercolo polmonare consiste in un
granuloma formato da un nucleo centrale
di necrosi caseosa contenente batteri
all’interno di macrofagi giganti, e da una
parete esterna formata da fibroblasti,
linfociti e neutrofili.
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Tubercolosi
Epidemiologia
Le infezioni causate da Mycobacterium tuberculosis complex rappresentano uno dei più
importanti argomenti di salute pubblica mondiale:
▪ prevalenza: 14 milioni di casi di TB
▪ incidenza: 9.4 milioni di casi di TB (soprattutto Africa sub-sahariana e sud-est asiatico per
elevato numero HIV e scarso accesso ai servizi sanitari)
▪ 1.7 milioni di morti
World Health Organization. Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planning, Financing: WHO Report 2010. Geneva, Switzerland: WHO Press; 2011. 3
Tubercolosi
Importanza della diagnostica
Resistenza alla terapia:
▪ Nel 2008 notificati 440.000 casi di multidrug-resistant TB (MDRTB), ossia il 3.3% dei nuovi
casi, causando 150.000 morti.
▪ Paesi a più alta incidenza di MDRTB sono distribuiti su tutto il globo (Europa, Asia, Africa).
▪ 1995-2005: 49 milioni di pazienti trattati, salvate oltre 6 milioni di vite.
Necessità di una diagnosi “improved”:
▪ detection rate globale non ottimale: 63%.
▪ L’adozione di programmi di controllo sanitario richiede una diagnostica rapida ed
accurata, soprattutto in quei Paesi dove difficile è l’accesso ai servizi sanitari e dove non è
possibile attendere i risultati dai laboratori di riferimento prima di avviare una terapia
anti-TB.
▪ Spesso la diagnostica si basa soltanto sull’osservazione microscopica, senza ottenere
alcun dato sulle resistenze.
▪ I tests di sensibilità (AST) sono alquanto problematici: difficile esecuzione, elevato TAT
(mesi), risultati discordanti per alcune molecule (etambutolo), mancanza di
standardizzazione per i farmaci di “seconda linea”.
E’ assolutamente indispensabile sviluppare strategie diagnostiche “rapide”, al fine di
individuare nuovi casi di TB ed i pazienti infettati con ceppi MDR.
World Health Organization. Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planning, Financing: WHO Report 2010. Geneva, Switzerland: WHO Press; 2011. 4
Tubercolosi
Valutazione medica
La valutazione medica della malattia tubercolare si articola nelle seguenti fasi:
1. Valutazione anamnestica
2. Esame obiettivo
3. Test per stabilire pregressa infezione con M. tuberculosis
4. Radiografia del torace
5. Esame batteriologico di campioni clinici
E’ necessario distinguere i soggetti:
▪ con infezione ma asintomatici (infezione latente)
▪ con infezione e sintomatici (infezione attiva)
Nel primo caso si parla di diagnosi INDIRETTA, nel
secondo di diagnosi DIRETTA.
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Tubercolosi
1. Anamnesi
▪ Presenza di uno o più sintomi suggestivi per TB; nel caso, da quanto tempo persistono.
▪ Esposizione ad un soggetto con TB.
▪ Diagnosi pregressa di infezione tubercolare latente (LTBI) o malattia TB.
▪ In caso di trattamenti inadeguati o per scarsa compliance del paziente, TB può ricorrere
con emergenza di isolati multi-resistenti.
▪ Considerare i fattori demografici (paese di origine, età, etnia, gruppo razziale,
occupazione) che possono rappresentare fattori di rischio per l’infezione tubercolare.
▪ Considerare la presenza di malattie concomitanti (HIV, diabete) che aumentino il rischio di
progressione della malattia nei soggetti con infezione latente da M. tuberculosis.
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Tubercolosi
2. Esame obiettivo - sintomatologia
La maggior parte dei pazienti TB presenta uno o più sintomi, sebbene NON TUTTI i pazienti
con TB siano sintomatici.
Tutti i soggetti sintomatici per TB o risultati positivi ad un test indicativo di infezione da M.
tuberculosis (tuberculin skin test, TST; interferon-gamma release assay, IGRA), debbono
essere soggetti a valutazione medica per escludere la malattia tubercolare.
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Tubercolosi
3. Diagnosi INDIRETTA: avvenuta infezione con M. tuberculosis
La scelta del test più adatto per la ricerca dell’infezione da M. tuberculosis deve tener conto di:
▪ motivi e contesto clinico
▪ disponibilità
▪ rapporto costo-efficacia
Attualmente, esistono due metodi disponibili per stabilire un pregresso contatto con il
microrganismo, basati sulla evidenziazione di una risposta di memoria T-cellulare a seguito di
esposizione agli antigeni di M. tuberculosis:
▪ Mantoux tuberculin skin test (TST)
▪ Interferon-gamma release assays (IGRAs)
▪ QuantiFERON-TB Gold In-Tube test (QFT-GIT)
▪ T-SPOT®.TB test
Questi tests consentono di individuare i soggetti che hanno una infezione da M. tuberculosis,
indipendentemente dallo stato dell’infezione stessa (attiva o latente).
Tuttavia, un risultato negativo non esclude la diagnosi di malattia tubercolare o di infezione
latente (Latent Tuberculosis Infection, LTBI).
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Tubercolosi
Test cutaneo per la tubercolosi: Mantoux test
▪ Si disinfetta una piccola superficie dell’avambraccio, quindi si inietta superficialmente con
una siringa da insulina con ago sottilissimo la dose di tubercolina.
▪ La tubercolina è una frazione proteica purificata del bacillo tubercolare che, una volta
iniettata provoca nell'organismo una risposta immunitaria, che si manifesta con una
reazione infiammatoria sulla cute (reazione di ipersensibilità ritardata, mediata dai linfociti
T di memoria)
Dopo 72 ore, si procede alla lettura del test:
▪ negativo: assenza di indurimento ed eritema
inferiore a 2 mm di diametro;
▪ dubbio: con parvenza di indurimento ed eritema
tra i 2 a 4 mm di diametro;
▪ positivo: con indurimento dermico evidente ed
eritema superiore a 5 mm di diametro.
▪ intensamente positivo: se la papula si necrotizza
centralmente e la reazione infiammatoria è
moto evidente.
Il test negativo evidenzia l'assenza di contatto con M. tuberculosis.
Il test positivo evidenzia un contatto con M. tuberculosis e la risposta immunologica è
proporzionale allo stato di attività della malattia. La diagnosi di malattia deve essere confermata su
base clinica, radiologica e laboratoristica.
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Tubercolosi:
Interferon-gamma release assays (IGRAs)
▪ La risposta cellulo-mediata può essere valutata in vitro sui linfociti periferici, misurandone
la produzione di IFN- a seguito di esposizione agli antigeni del micobatterio tubercolare.
▪ La quantità di IFN- viene misurata utilizzando una tecnica basata su membrana (ELISPOT)
o mediante ELISA.
▪ Possibile cross-reattività con M. szulgai, M. marinum, M. kansasii
Interpretazione «integrata» Mantoux test IGRA test
Immunizzazione (vaccino BCG)-infezione positivo negativo
con micobatteri ATPICI
Infezione con una specie appartenente al positivo positivo
complesso M. tuberculosis
10Tubercolosi
4. Esame radiografico
Le alterazioni osservate all’esame radiografico del torace potrebbero essere suggestive, ma mai
diagnostiche, per TB.
RX può essere utilizzato per escludere la TB polmonare in un soggetto normoreattivo, positivo a
TST o IGRA, ed asintomatico per TB.
Presenti soprattutto nei segmenti apicale e posteriore del lobo superiore o dei segmenti
superiori del lobo inferiore, le lesioni potrebbero essere localizzate ovunque e differire per
dimensioni, forma e cavitazione, soprattutto nell’immunocompromesso (es. HIV).
Soprattutto nei ragazzi, le alterazioni radiografiche sono minime;
indicato un RX laterale per diagnosi differenziale con linfoadenopatia.
La tomografia computerizzata può fornire informazioni aggiuntive,
sebbene più costosa.
▪ Lesioni fibrotiche: possibile presenza di bacilli tubercolari in divisione
con un alto potenziale per la progressione verso la malattia TB. Poichè
RX non può differenziare una pregressa TB da una forma attiva, i
soggetti con un quadro radiografico suggestivo per una TB pregressa e
TST+ oppure IGRA+ dovrebbero essere sottoposti a terapia per LTBI
soltanto dopo aver escluso una infezione in atto previa indagine
colturale.
▪ Al contrario, lesioni nodulari non fibrotiche, pienamente calcificate e
discrete, suggestive per la presenza di granuloma, indicano un basso
rischio per la progressione verso la malattia TB.
11Tubercolosi
5. Esame batteriologico
Obiettivo: dimostrare la presenza di M. tuberculosis o di altri micobatteri tubercolari (M. bovis,
M. africanum)
E’ necessario che tutti i soggetti sospetti per la malattia TB debbano essere sottoposti ad
indagine batteriologica.
L’indagine, effettuata su campioni di differente tipologia (escreato, urine, liquor), si articola nelle
seguenti fasi:
▪ Prelievo del campione
▪ Osservazione microscopica per la presenza di micobatteri (AFB, Acid-Fast Bacilli)
▪ Ricerca diretta di M. tuberculosis utilizzando tests di amplificazione degli acidi nucleici
(Nucleic Acid Amplification, NAA tests)
▪ Indagine colturale ed identificazione
▪ Tests di sensibilità agli antibiotici
12Tubercolosi
Prelievo dei campioni – Rischio biologico
M. tuberculosis è considerate un agente biologico di classe III, in quanto altamente contagioso (dose
infettante: 10 bacilli).
Durante la raccolta dei campioni indossare adeguati DPI (in particolare: mascherina).
La lavorazione del campione necessita di un livello di contenimento previsto per il “laboratorio di
sicurezza” (BSL-3) che protegga dall’infezione sia il personale che l’ambiente esterno.
13Tubercolosi
Prelievo dei campioni – TB polmonare
La tecnica più frequentemente utilizzata prevede la raccolta di espettorato.
E’ necessario prelevare almeno 3 campioni consecutivi ad intervalli di 24 h; il campione deve essere
raccolto al mattino, a digiuno, perché le secrezioni si accumulano durante la notte.
MODALITA’ DI PRELIEVO
▪ praticare la pulizia del cavo orale (denti, gengive, lingua e parte interna delle guance) con acqua
distillata sterile; sciacquare il cavo orale sempre con acqua distillata sterile, per limitare
contaminazioni
▪ a seguito di tre respiri profondi, il pz effettuerà un energico colpo di tosse per raccogliere almeno
3-5 ml di campione in un contenitore sterile, a bocca larga, in plastica, con tappo a vite
Qualora non fosse possibile produrre un campione di espettorato, è possible ricorrere ad un aspirato
tracheo-bronchiale (pz. intubati), oppure a broncoscopia.
Quale ultima soluzione, si può ricorrere a:
▪ un aspirato gastrico (3 giorni consecutivi), soprattutto nei pediatrici
▪ uno sputo “indotto”, ossia raccolto a seguito di aerosol con salina ipertonica (3-5%), sterile e
riscaldata. Contrassegnare il campione come “indotto”, in quanto la secrezione in questo caso è
altamente idratata e potrebbe pertanto essere scambiata come saliva
TRASPORTO: entro 1 ora dalla raccolta.
CONSERVAZIONE: fino a 48 ore in frigorifero. Non congelare.
14Tubercolosi
Prelievo dei campioni – TB polmonare
Durante la raccolta del campione, il paziente produce un aerosol altamente contagioso per operatori sanitari/pazienti in
prossimità. La raccolta deve, pertanto, essere effettuata in un ambiente dedicato dotato di ventilazione controllata (stanza
di isolamento AII), in grado di contenere il rischio biologico aerogeno. Il personale sanitario deve dotarsi di mascherina.
15Tubercolosi
Prelievo dei campioni – TB extra-polmonare
Nel caso si sospetti una TB extra-polmonare, debbono essere considerate altre tipologie di campione.
campione modalità contenitore
Urine In 3 giorni consecutivi: raccogliere la prima minzione completa del sterile, bocca larga,
mattino, preferibilmente scartando il primo getto plastica, tappo a vite
Liquor prelevare, mediante rachicentesi, la maggior quantità possibile di sterile
liquor (minimo 2 ml)
Sangue 2-3 prelievi; avvertire Lab (affinchè si adotti vial dedicata) vial per emocoltura
Pus ▪ disinfettare la cute con alcool prima della raccolta ▪ sterile, bocca larga,
▪ utilizzare per la raccolta una siringa; se non è possibile, usare un plastica, tappo a vite
tampone con terreno di trasporto Amies o Stuart ▪ tampone in terreno di
trasporto
Biopsia ▪ raccogliere, asetticamente, almeno 1 gr di tessuto sterile, a bocca larga, in
▪ non avvolgere in garza, immergere in fissativi o conservanti plastica, con tappo a vite
▪ aggiungere una minima quantità di soluzione salina sterile, per
evitare l’essicamento
Trasporto: entro 1 ora dalla raccolta.
Conservazione: a +4°C (tranne il sangue, a RT), per max 1 giorno; non congelare.
16Tubercolosi
Decontaminazione del campione
▪ I campioni polmonari sono generalmente caratterizzati da una flora accessoria contaminante.
▪ La crescita dei contaminanti (più veloce di quella del micobatterio), unitamente alla scarsa
concentrazione del micobatterio, potrebbero causare risultati falsi-negativi.
▪ Pertanto, bisogna procedure alla decontaminazione e concentrazione del campione prima di avviare
le indagini di laboratorio.
▪ Tecnica di Kubica: N-acetilcisteina (mucolitico) + NaOH (base con attività antibatterica)
17Tubercolosi
Diagnosi DIRETTA: osservazione microscopica per AFB
▪ La ricerca microscopica di AFB nello striscio colorato allestito da un campione
può fornire una iniziale e rapida evidenza batteriologica della presenza di
Micobatteri in un campione clinico.
▪ Due sono le tecniche più frequentemente impiegate a tal fine:
– microscopia in fluorescenza, previa colorazione con auramina-O
oppure auramina-rodamina; (rapida e semplice)
– microscopia diretta, previa colorazione con carbolfucsina (Ziehl-
Neelsen, Kinyoun); (ZN gold-standard, più sensibile rispetto a K)
▪ I Micobatteri, una volta colorati, resistono alla decolorazione con alcol/acido
(Acid-Fast Bacilli, AFB). Essi tendono inoltre a formare strutture cordoniformi,
grazie alla elevata idrofobicità superficiale (fattore cordale).
▪ Tale tecnica consente soltanto una identificazione presuntiva della malattia
TB poichè M. tuberculosis non è l’unica specie AFB.
▪ Inoltre, la sensibilità dell’indagine microscopica è scarsa (5.000 – 10.000
bacilli/ml di campione), significativamente minore rispetto a quella
dell’isolamento colturale (10 - 100 bacilli/ml), sebbene fornisca risultati in
tempi più rapidi (entro 24h dal prelievo).
▪ Pertanto, una osservazione microscopica negativa per AFB non esclude la
malattia TB. Alcuni pazienti possono infatti avere uno striscio AFB- ma essere
positivi al colturale.
18Tubercolosi
Osservazione microscopica per AFB
▪ Nei campioni AFB+ si procede alla conta cellulare, ottenuta a seguito dell’osservazione di un
numero minimo di campi microscopici
▪ Il risultato viene, quindi, refertato in maniera semi-quantitativa mediante l’adozione di uno score
(4+, 3+, 2+, 1+) che sarà direttamente proporzionale alla presenza di AFB e, conseguentemente,
alla contagiosità del paziente.
19Tubercolosi
Diagnosi DIRETTA: amplificazione degli acidi nucleici
▪ Questa metodica si basa sulla amplificazione di specifiche sequenze contenute nel DNA/RNA
di M. tuberculosis.
▪ Molto più rapida rispetto all’esame colturale (2-4 ore vs settimane); sensibilità del 100% sse
effettuata su campioni di espettorato (minore in quelli extrapolmonari).
▪ CDC raccomanda l’utilizzo di questi tests:
– nei pazienti sintomatici con sospetta TB polmonare
– per la ricerca dei “contatti” (necessaria per le attività di controllo).
▪ Possibili vantaggi associati all’utilizzo della NAA:
– precoce conferma di malattia TB, rapido avvio della terapia antibiotica, migliore
outcome del paziente;
– maggiore efficacia degli interventi di salute pubblica (precoce e più efficiente utilizzo
dell’isolamento respiratorio, interruzione della trasmissione, precoce inizio della
individuazione dei “contatti”)
▪ L’interpretazione è funzione dell’osservazione microscopica:
– se microscopia+/NAA+, conferma di infezione
– se microscopia-/NAA+, avvio della terapia in funzione del contesto geografico e clinico
– se microscopia+/NAA-, probabile infezione non tubercolare
20Tubercolosi
Diagnosi DIRETTA: isolamento colturale ed identificazione
▪ L’indagine colturale rimane il “gold standard” per la conferma della malattia, oltre che necessaria per
valutare il genotipo dell’isolato, nonchè la sua sensibilità agli antibiotici.
▪ L’esame va effettuato su tutti i campioni diagnostici, indipendentemente dall’esito AFB o molecolare.
▪ Utilizzo di terreni agarizzati a base d’uovo e con aggiunta di emina (Lowensten-Jensen) oppure di
terreni liquidi (Middlebrook medium); in entrambi i casi, si aggiungono antibiotici per inibire la flora
contaminante.
▪ I sistemi automatizzati attualmente in commercio (BACTEC, MGIT, VersaTREK, MBBACT) sono in
grado di evidenziare la crescita in terreno liquido della maggior parte dei micobatteri in 4 - 14 giorni,
mentre 3 - 6 settimane sono necessarie per la crescita su agar.
▪ Un risultato positivo per M. tuberculosis conferma la diagnosi di malattia.
▪ Nel caso di negatività (refertata dopo 42 giorni di incubazione), la diagnosi può essere posta soltanto
su base clinica. Bacilli vitali potrebbero essere infatti presenti in altri campioni/siti.
▪ L’indagine colturale è importante nel monitoraggio della efficacia
della terapia e, conseguentemente, della contagiosità del paziente:
– campioni prelevati con cadenza mensile
– la negatività di 2 campioni consecutivi rappresenta la prova
dell’efficacia terapeutica
– la negativizzazione di tutti i campioni indicherà la avvenuta
eradicazione
21Tubercolosi
Valutazione della sensibilità agli antibiotici (AST)
AST indicato nei pazienti:
▪ naïve per il trattamento
▪ che sono stati trattati per > 3 mesi ma con colturale ancora positivo
▪ con recidiva a seguito di terapia
Anti-tubercolari di “prima scelta” saggiati per il primo trattamento di M. tuberculosis:
▪ isoniazide
▪ rifampicina
▪ etambutolo
▪ streptomicina
Anti-tubercolari di “seconda scelta” saggiati in caso di insuccesso terapeutico (recidivanti):
▪ fluorochinoloni
▪ aminoglicosidi
Tecniche per AST:
▪ fenotipiche (agar, brodo, E-test)
▪ genotipiche (molecolari; RAPIDE)
22Tubercolosi
AST: tecniche fenotipiche rapide
MDR-XDRTB Colour Test: antibiogramma “diretto”.
▪ Utilizza una tecnologia “thin-layer agar” in una capsula Petri contenente Middlebrook 7H11
agar e l’indicatore redox 2, 3 diphenyl-5-(2-thienyl) tetrazolium chloride.
▪ La piastra è divisa in 4 quadranti: 1 (senza antibiotico, quale controllo di crescita batterica); 2
(contenente isoniazide), 3 (contenente rifampicina), 4 (contenente ciprofloxacina).
▪ Il campione di espettorato viene collezionato in un contenitore contenente un terreno di
trasporto con disinfettante (per limitare la crescita della flora accessoria).
▪ La miscela viene seminata in ogni quadrante.
▪ Si monitora la crescita a giorni alterni fino alla comparsa di 50 CFU nel quadrante “controllo”
▪ La crescita di almeno 1% (vs controllo) indica resistenza.
▪ Di semplice esecuzione, a basso costo, rapido ed accurato nella ricercar di ceppi MDR.
http://www.finddiagnostics.org/programs/tb/find_activities/rapid_colorimetric_dst.html 23Tubercolosi
AST: tecniche rapide molecolari
Diagnosi molecolare rapida
▪ Due approcci tecnici:
▪ PCR associata a ibridazione inversa
▪ real-time PCR
▪ Ricerca di resistenza a isoniazide e/o rifampicina
PCR associata a ibridazione inversa
Realtime PCR
24Tubercolosi
AST: tecniche rapide molecolari
Principle of the reverse hybridization. After the
amplification of the target DNA by PCR using
biotinylated primer, the dsDNA is chemically
separated into single strands and hybridized to the
target DNA. The bounded DNA can be made visible by
color reaction of a chromogen mediated by the
alkaline phosphatase reaction. The enzyme is coupled
to a streptavidin linker that binds to biotin. BCIP: 5-
bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate; NBT: Nitro blue
tetrazolium.
Lane 1: susceptible strain
Lane 2: resistant strain. Mutations are
indicated by lacking hybridization of one
or more wild-type probes and by the
presence of the hybridization of one or
more muted probes.
Resistance to rifampicin is related to rpoB
mutations, where isoniazide-resistance
by mutations of katG and inhA.
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