Sviluppo di un metodo LC-MS/MS per l'indagine sui tenori di antibiotici negli alimenti ad uso zootecnico a seguito di carry-over inevitabile in ...
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Sviluppo di un metodo LC-MS/MS per l'indagine
sui tenori di antibiotici negli alimenti ad uso
Torino
zootecnico a seguito di carry-over inevitabile in
27 novembre 2020
produzione. Torres Elena
Premessa
I prodotti destinati all’alimentazione animali possono
contenere sostanze indesiderate
Necessità di valutare la presenza nei mangimi di
antibiotici , anche a livelli sub terapeutici, che possono
creare fenomeni di antibiotico resistenza.
Premessa
Antibiotico - resistenza
L’esposizione a dosaggi sub-terapeutici di principi attivi antimicrobici permette ad un
significativo numero di patogeni di sopravvivere e può stimolare la selezione di
ceppi resistenti.
Perdita di efficacia di antibiotici fondamentali per la cura delle patologie animali ma
ancor più umane.
Premessa
Direttiva 2009/8/CE:
“Vi è la possibilità che operatori del settore
dei mangimi producano nello stesso
impianto una vasta gamma di mangimi e
che nella stessa linea di produzione siano
immagine fabbricati consecutivamente prodotti di tipo
diverso. Può quindi accadere che altri
mangimi che escono dalla stessa linea di
produzione rechino inevitabilmente tracce
di un altro prodotto. Questo trasferimento
da un lotto di produzione a un altro è detto
«carry-over» o «contaminazione crociata».
Cosa dice la legge sul carry-over nei mangimi
Fino al 2002 non vi era alcuna regolamentazione in merito; vi erano alcuni pareri EFSA
che sembravano orientati a considerare come livello di concentrazione di farmaco
ascrivibile a carry-over inevitabile, il 10% della dose massima di utilizzo.
Direttiva immagine
2002/32/CE
relativa alle sostanze indesiderabili nell’alimentazione degli animali.
L’ allegato 1,sezione VII « additivi per mangimi autorizzati presenti in mangimi destinati a
specie non bersaglio in seguito a carry-over inevitabile» definisce limiti massimi
ammesso dei coccidiostatici.
Cosa dice la legge sul carry-over nei mangimi
Direttiva 2009/8/CE del 10 febbraio 2009
“modifica l’allegato 1 della Dir. 2002/32/CE per quanto riguarda i tenori massimi di
coccidiostatici e istomonostatici presenti per effetto di carry-over inevitabile in mangimi
destinati a specie non bersaglio”.
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REGOLAMENTO (UE) N. 574/2011 del 16 giugno 2011
che modifica l’allegato I della direttiva 2002/32/CE per quanto riguarda i livelli massimi di
carry-over di alcuni coccidiostatici e istomonostatici presenti nei mangimi destinati a
specie non bersaglio.
Cosa dice la legge sul carry-over nei mangimi
L’allegato prevede due diversi livelli di tolleranza per il carry-over di coccidiostatici
autorizzati in specie non-target:
• 3% : alimenti per specie non-target non sensibili
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• 1% : alimenti per specie non-target sensibili, per finissaggio e per specie da
produzione alimentare continua (se vi è evidenza di carry-over da mangime ad
alimento)
Cosa dice la legge sul carry-over da principi attivi
farmacologici
Assenza di un regolamento comunitario che armonizzi i tenori massimi accettabili di
farmaci autorizzati per effetto di carry-over inevitabile tra i vari Stati Membri.
Assenza a livello nazionale, dei livelli massimi di carry-over di farmaci ammessi nei
mangimi
immagine
Assenza di metodiche analitiche ufficiali armonizzate
Non essendoci limiti di carry-over da principi attivi ammessi nei mangimi, il limite critico
tra conformità e non conformità equivale alla sensibilità del metodo analitico.
Cosa dice la legge sul carry-over da principi attivi
farmacologici
Nel 2015 il Ministero della Salute considerata la necessità di:
- contenere l’indiscutibile aumento di antibiotico-resistenza negli animali da reddito.
- fissare i livelli di carry-over da farmaci a livello nazionale al fine di valutare la conformità
o meno dei mangimi in modo armonizzato tra la rete degli IZS
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Nota ministeriale del 11/05/2015
Cosa dice la legge sul carry-over da principi attivi
farmacologici
Nota ministeriale fissa livelli per non conformità al carry-over per le diverse sostanze
antibiotiche ricercate nel PNAA
Famiglia / principio attivo Limite di azione stabilito
per la sostanza (mg/kg)
Avermectine 1
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Chinolonici 1
Colistina 1
Macrolidi 1
Penicilline 0,5
Sulfamidici 1
Tetracicline 1
Tiamulina 1Come valutare il carry-over degli antimicrobici
Ministero della Salute C.Re.A.A. ASSALZOO
Progetto : "CROSS: Carry-over Stato dell'arte Mangimifici Italia"
Valutare fenomeno del carry-over da tetracicline e sulfamidici
correlato alla produzione di mangimi medicati in impianti industriali.
Non abbiamo dati sulle altri classi di antibioticiCome valutare il carry-over degli antimicrobici
Per garantire un risultato efficace in un controllo al carry-over, sarebbe necessario l’uso di
metodi MULTICLASSE, in grado di ricercare simultaneamente il maggior numero di
analiti di una stessa famiglia e di classi diverse, e avente sensibilità adeguata a
raggiungere i livelli di concentrazione richiesti dalla nota.
immagineScopo della ricerca
Sviluppare e validare un metodo analitico multiclasse quantitativo nei mangimi a livello
di carry-over in LC-MS/MS.
Analizzare il primo lotto di mangimi successivo alla produzione di un mangime
immagine
medicato e valutarne il carry-over usando il metodo multiclasse.Principi attivi ricercati
Classe Analita
ampicillina, amoxicillina, penicillina G,
Penicilline
penicillina V,
Diamminopirimidine trimetoprim
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Lincosamidi lincomicina
eritromicina A, gamitromicina, josamicina,
Macrolidi kitasamicina, oleandomicina, neospiramicina I,
spiramicina I, tilmicosina, tilosina
Pleuromutiline tiamulina, valnemulina
Amfenicoli tiamfenicolo, florfenicoloImpostazione metodica in massa
immagineImpostazione metodica in massa
Intensità del segnale in
matrice
Stabilità del segnale
Ion ratio costante
immagineSviluppo procedura di estrazione
penicillina eritromicina
valnemulina
lincomicina
tiamfenicolo
trimetoprimSviluppo procedura di estrazione
immagine
ESTRATTO
MANGIME
Trattamento del campione e scelta modalità estrattive in grado di portare in soluzione
contemporaneamente più analiti con comportamenti chimici diversi.Trattamento del campione
Ø < 0.5 mm 4g
50 g
Campione rappresentativo
Omogenea distribuzione del farmaco
Risultati non significativamente diversiSviluppo procedura di estrazione
Miscele di estrazione: - % acqua / CH3CN
- pH soluzione di estrazione
Miscela di ripresa: - % acquoso/organico
- Soluzioni a diverse forza ionica e pHModalità operative
1° Estrazione: 15 mL Agitazione per 10’,
Pesata 4g e
H2O/CH3CN 20:80 ultrasuoni per 10’ e
aggiunta I.S.
centrifugazione
V/V + CH3COOH
0.05%
Riunire gli estratti. Agitazione per 10’,
Prelevare 0,5 ml da 2° Estrazione: 10 mL
ultrasuoni per 10’ e CH3CN con CH3COOH
portare a secco centrifugazione
0.05%
Riprendere il residuo con
NH4COOH/CH3CN e
filtrare o
ultracentrifugazioneParametri strumentali
HPLC Dionex Ultimate 3000
Luna Omega Polar C18 (150x3,0 mm, 3 mm)
A: HCOOH 0,1% in CH3CN
B: HCOOH 0,1% in H2O
Temp: 30 °C Flusso: 250 uL/min
Volume di iniezione 10 uL H-ESI + 3,6 KV H-ESI – 3,5 KV
Acquisizione : MRM
Vaporizer temperature : 250°C
Thermo TSQ Endura Capillary temperature : 150°C
Sheet Gas: 40
Auxiliary gas : 20
Collision Gas Pressure : 1,5 mTorrAnalisi LC-MS/MS
Quantificazione:
-retta in matrice in area 2,0
relativa 1,6
y = 1,6515x - 0,0001
- I.S. deuterato. 1,2 R² = 0,9954
RISPOSTA
Mettere foto retta in matrice
0,8
0,4
LOQ (mg/kg) fissato a
metà del LM: 0,0
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
- Penicilline : 0,25 CONCENTRAZIONE (mg/kg)
- Altre classi : 0,5
Retta in matrice come area relativa dell’amoxicillinaCromatogrammi di un mangime completo per suini tal quale e drogato (macrolidi) al LOQ
Parametri di validazione
Validazione del metodo di conferma è stata condotta secondo il Reg. 882/2004 CE,
prendendo in considerazione i parametri :
• Linearità
• Specificità
immagine
• LOQ
• Esattezza
• Precisione, Limite di ripetibilità
• Robustezza
• IncertezzaValutazione del Carry-Over in campioni di campo
Prelevati 12 mangimi prodotti dopo un mangime medicato
Il prelievo ha riguardato mangimi completi e complementari per tutte le specie di animali
da reddito.
E’ stato acquisito il cartellino del mangime campionato e quello del mangime medicato
immagine
del lotto precedente di produzione, con le indicazioni relative alla tipologia e alla
concentrazione del principio attivo usato.
ANALISI QUANTITATIVA MULTIRESIDUO PER CARRY-OVER
9 negativi 3 rilevatiValutazione del Carry-Over in campioni di campo
Mangime A prodotto dopo mangime medicato con
tiamulina 300 mg/kg, tiamulina identificata ma a
concentrazione < LOQ.
Mangime B prodotto dopo mangime medicato con
immagine
amoxicillina 600 mg/kg, amoxicillina identificata a
concentrazione pari al LOQ.
Mangime C prodotto dopo mangime medicato con
lincomicina 200 mg/kg, lincomicina identificata a
concentrazione di 0.9 mg/kg.Vantaggi del metodo
Unica procedura preparativa per l’estrazione
di 19 analiti.
Determinazione nella stessa seduta analitica
di farmaci appartenenti a diverse famiglie.
immagine
Ottimizzazione dei tempi di risposta, delle
risorse strumentali, del tempo-operatore e
conseguente vantaggio economico.Vantaggi del metodo
Applicabile nella routine a livello di screening
(qualitativo) e nelle prove di conferma
(quantitativo).
Il metodo è idoneo a dosare concentrazioni di
farmaco comprese tra 0.25 e 0.75 mg/kg per le
immagine
penicilline e tra 0.50 e 1.50 mg/kg per gli altri
analiti.
Il metodo risulta adatto all’indagine del carry-
over di antibiotici nei mangimi animali e può
essere utilizzato nei controlli ufficiali previsti
dal PNAAGRAZIE PER L’ATTENZIONE
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