Mercodia Proinsulin ELISA
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Mercodia Proinsulin ELISA Instruzioni per l’uso 10-1118-01 REAGENTI PER 96 RILEVAZIONI Prodotto da Mercodia AB Sylveniusgatan 8A SE-754 50 Uppsala Svezia
SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI USATI SULLE ETICHETTE
Reagenti per 96 rilevazioni
∑ = 96
Data di scadenza
Conservare tra i 2–8°
Lotto n.
© Mercodia 2009-2019USO PROPOSTO
Mercodia Proinsulin ELISA fornisce un metodo per la determinazione quantitativa della pro-
insulina umana nel siero o nel plasma.
RELAZIONE E SPIEGAZIONE DEL TEST
La proinsulina è il precursore dell’insulina che è il principale ormone responsabile del controllo
del glucosio nel metabolismo. E’ sintetizzato nelle cellule beta delle isolette di Langerhans ed
è sottoposto successivamente sottoposto a formare la C peptide e l’insulina. Elevate concen-
trazioni di proinsulina si notano di solito in pazienti con concentrazioni di cellule beta tumorali
maligne o benigne, del pancreas. Molti pazienti con cellule beta tumorali hanno aumentato
l’insulina, la C peptide e concentrazioni di proinsulina, ma saltuariamente solo la proinsulina è
elevata. Nonostante la sua bassa attività biologica, la proinsulina potrebbe aumentare a suf-
ficienza da produrre ipoglicemia. AumentaTe concentrazioni di proinsulina potrebbero anche
essere rilevate in pazienti con problemi renali, di cirrosi, o di ipertiroidismo.
PRINCIPIO DI PROCEDURA
Mercodia Proinsulin ELISA, è una fase concreta dell’immunoanalisi Enzyme due-sito. E’ basata
sulla tecnica diretta sandwich nella quale due anticorpi monoclonali sono diretti contro deter-
minanti antigenici separati sulla molecula proinsulina. Durante l’incubazione la proinsulina nella
reazione del campione con anticorpi proinsulina diretto microtitrazione nei pozzetti. Dopo il
lavaggio, gli anticorpi perossidasi coniugata sono aggiunti e dopo la seconda incubazione e un
semplice lavaggio che rimuove indirettamente gli anticorpi degli enzimi marcati, il diretto Conju-
gate è scoperto dalla reazione con 3, 3’,5,5’ –tetrametibenzidine (TMB). La reazione è fermata
aggiungendo acido per dare una posizione estrema clorimetrica che è letta spettrometrica-
mente.
3PREACAUZIONI E AVVISI
• Per l’uso diagnostico in vitro.
• I contenuti di questo kit e i suoi residui non devono essere ammessi al contatto con
animali ruminanti o suini.
• Tutti presi come campione potrebbero essere trattati come capaci di trasmettere
infezioni.
• Ciascun pozzetto può essere usato una sola volta
• La Stop Solution contieneMATERIALI RICHIESTI MA NON INCLUSI
• Pipette con volumi adeguati (riutilizza le pipette in dotazione per l’aggiunta
della Assay Buffer, soluzione enzima coniugato 1X , Substrate TMB e Stop Solution)
• Provette, becher e cilindri per la preparazione di reagenti
• Acqua ridistillata
• Agitatore magnetico
• Miscelatore di vortice
• Lettore micro piastra (450 nm filtro)
• Piastra dello shaker (700-900 giri/minuto, movimiento orbital)
• Micro piastra piano di lavaggio con la funzione traboccare-lavare (consigliato ma non
obbligatorio)
REAGENTI
Ogni kit Mercodia Proinsulin ELISA contiene reagenti per 96 prove, sufficienti per 43 campioni e
una calibratura curva in duplicato. Per diverse serie di analisi, usare reagenti provenienti da
scatole portanti identici numeri di lotto. La data di scadenza del kit completo è stabilita
sull’etichetta all’esterno. Si raccomanda di conservare ad una temperatura di 2–8° C.
Coated Plate 1 piastra 96 pozzetti Pronti per l’uso
Topo monoclonale anti-proinsulina 8 strips de pozzetti
I pozzetti delle micro piastre inutilizzati, devono essere risigillati, conservare a 2-8° C e
adoperati entro 2 mesi.
Calibrators 1, 2, 3, 4 4 fiale 1000 μL Liofilizzato
Ricombinante dell’proinsulina umana Aggiungere 1000 μL
Giallo colore codificato acqua ridistilata
Concentrazione affermato sull’etichetta della fiala per fiala.
Usare entro 1 mese, conservare a 2-8° C.
Per conservare più di 1 mese, conservare a –20° C.
Calibrator 0 1 fiala 5 mL Pronti per l’uso
Giallo colore codificato
Assay Buffer 1 fiala 6 mL Pronti per l’uso
Rosso colore codificato
Enzyme Conjugate 21X 1 fiala 600 μL Per la preparazione
Peroxidasi Conjugate topo monoclonale anti-proinsulina vedi sotto
Enzyme Conjugate Buffer 1 fiala 12 mL Pronti per l’uso
Blu colore codificato
Wash Buffer 21X 1 bottiglia 50 mL Diluir con 1000 mL
Conservazione dopo la diluizione: d’aqua ridistillata
2-8 °C per 2 mesi per fare diluenti la
soluzione de wash
buffer 1X.
Substrate TMB 1 bottiglia 22 mL Pronti per l’uso
Solución incolore
Nota! Sensibile alla luce!
Stop Solution 1 fiala 7 mL Pronti per l’uso
0.5 M H2SO4
5Preparazione della soluzione enzyme conjugate 1X
Preparare la quantità della soluzione enzyme conjugate 1X con la diluizione dell’Enzyme Con-
jugate 21X nel Enzyme Conjugate Buffer in base alla tabella sottostante. Quando si prepara la
soluzione enzyme conjugate 1X per tutta la piastra, versare tutto il tampone Enzyme Conjugate
Buffer nella fiala dell’Enzyme Conjugate 21X. Mescolare lievemente prima dell’uso.
Enzyme Enzyme
Numero de strisce Conjugate 21X Conjugate Buffer
12 strisce 1 fiala 1 fiala
8 strisce 350 μL 7 mL
4 strisce 200 μL 4 mL
Conservazione dopo la diluzione: 2-8°C per 2 mesi.
LA RACCOLTA E IL TRATTAMENTO DEL MODELLO
Il siero
Il prelievo in vena di sangue, permette di coagulare, e separare il siero con la centrifugazione.
I campioni possono essere conservati a 2–8°C fino a 24 ore. Per periodo più lunghi, conservare
i campioni a –20°C. Evitare di ripetere il congelamento e lo scongelamento.
Plasma
Prelevare il sangue direttamente in vena in provette contenenti eparina o EDTA come anticoa-
gulante, e separare la frazione del plasma con la centrifugazione. I campioni possono essere
conservati a 2–8°C fino a 24 ore. Per periodi più lunghi conservare i campioni a –20°C. Evitare
di ripetere il congelamento e lo scongelamento.
Preparazione dei campioni
Normalmente non è richiesta alcuna diluizione, tuttavia, i campioni al di sopra del valore Cali-
brator 4 devono essere diluiti con Calibrator 0.
6PROCEDIMIENTO DE EVALUACIÓN
Tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente prima dell’ uso.
Preparar una calibratura curva per serie di analisi. Il prodotto è stato ottimizzato e validato senza
utilizzare la pellicola sigillante.
1. Preparar di soluzione enzyme conjugate 1X y di soluzione wash buffer 1X.
2. Preparare sufficienti pozzetti nelle micropiastre a comporre Calibrators, controlli e cam
pioni in duplice copia.
3. Pipette 50 μL per ogni Calibrators, controlli e campioni in appropriati pozzetti.
4. Aggiungere 50 μL al Assay Buffer per ogni pozzetto.
5. Mettere in incubatrice in una piastra shaker (700-900 rpm) per un’ora a temperatura
ambiente (18–25°C).
6. Lavare 6 volte con 700 μL di soluzione wash buffer 1X per pozzetto usando un lavatore
automatico per piastre con la funzione traboccare-lavare. Dopo il lavaggio finale,
capovor gere la piastra e picchiettarla con decisione contro della carta assorbente. Nella
procedura di lavaggio non utilizzare la funzione immersione.
O manualmente,
Eliminare il volume di reazione capovolgendo la micropiastra su un lavabo. Aggiungere
350 μL di soluzione wash buffer 1X ad ogni pozzetto. Eliminare la soluzione di lavaggio,
sbattere con forza diverse volte contro carta assorbente per rimuovere il liquido in
eccesso. Ripetere 5 volte. Evitare prolungate pause di immersione durante la procedura
di lavaggio.
7. Aggiungere 100 μL di soluzione enzyme conjugate 1X per ogni pozzetto.
8. Mettere in incubatrice in una piastra shaker (700-900 rpm) per 1 ora a temperatura
ambiente (18–25°C).
9. Lavare come descritto in 6.
10. Aggiungere 200 μL Substrate TMB.
11. Mettere in incubatrice per 15 minuti a temperatura ambiente (18–25°C).
12. Aggiungere 50 μL di Stop Solution ad ogni pozzetto.
Mettere la piastra in uno shaker per approssimativamente per 5 secondi per garantire la
miscelazione.
13. Leggere l’assorbività a 450 mn e calcolare i risultati.
Leggere entro 30 minuti.
Nota! Fare particolare attenzione a non contaminare il substrato TMB con la soluzione.
7CONTROLLO DI QUALITA’ INTERNO
I controlli commerciali tale come il Mercodia Diabetes Antigen Control (codifica No. 10-1134-
01/10-1164-01) e/o il siero interno proveniente da diversi donatori con basse, intermedie e
alte concentrazioni di C-peptide dovrebbero essere analizzate periodicamente come se fossero
esterne, e i risultati tracciati di giorno in giorno. E’ buona norma di un laboratorio registrare i se-
guenti dati per ciascuna analisi: un certo numero di kit, dati dei preparazione e dei componenti
del kit, i valori di OD per il modulo, Calibrature e controlli.
I laboratori dovrebbero seguire le norme governative o i requisiti di accreditamento per la
frequenza dei controlli di qualità.
IL CALCOLO DEI RISULTATI
Calcolo computerizzato
La riduzione dei dati computerizzati dell´assorbenza per le Calibrators, eccetto il Calibrator 0,
verso la concentrazione usando un regressione cubica flessibile potrebbe essere effettuata per
ottenere la concentrazione di proinsulina.
Il Calcolo manuale
1. Tracciare i valori di assorbanza ottenuti per i Calibrators, etto il Calibrator 0, contro la
concentrazione di proinsulina su carta log-log e costruire una curva di calibrazione.
2. Leggere la concentrazione dei campioni sconosciuti dalla calibratura curva.
Pozzetti Identità A450 Conc. princ. pmol/L
1A–B Calibrator 0 0.070/0.069
1C–D Calibrator 1* 0.156/0.163
1E–F Calibrator 2* 0.347/0.354
1G–H Calibrator 3* 1.157/1.176
2A–B Calibrator 4* 2.862/2.831
2C–D Campioni 1 0.208/0.208 5.25
2E–F Campioni 2 0.252/0.254 7.07
2G–H Campioni 3 0.563/0.589 19.8
3A–B Campioni 4 1.592/1.571 63.2
*Concentrazione affermato sull’ etichetta della fiala.
8Esempio di una calibratura curva
Una calibratura rappresentativa è mostrata qui. Non usare questa curva per determinare i risul-
tati attuali delle analisi.
A450
Proinsulin (pmol/L)
LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA
Come tutti i test diagnostici, una diagnosi clinica definitiva non dovrebbe essere basata sui
risultati di un singolo test, ma dovrebbe essere fatto medico dopo averne valutate le conclusioni
cliniche. L’applicazione di questo test su individui già sottoposti a terapie di insulina è ostacolato
dalla formazione di anticorpi anti-insulina, in grado di interferire nell’analisi.
Grossolanamente campioni lipemic, itterico o hemolysed non interferiscono nell’analisi. Tuttavia,
l’emolisi nel siero o nel plasma potrebbe dare luogo ad una degradazione dell’insulina con
conseguenti valori falsamente bassi e un’alta variabilità interserie. Per evitare la degradazione
dell’insulina, conservare i campioni emolizzati a basse temperature o in ghiaccio.
VALORI PREVISTI
E’ buona norma e pratica di ogni laboratorio stabilire una serie del tutto sua di presunti valori. I
seguenti risultati potrebbero servire come guida fino a che il laboratorio abbia raccolto dati suf-
ficienti del tutto suoi. I livelli di digiuno per 112 esaminati, individui apparentemente sani, hanno
reso un media di 10 pmol/L, una mediana di 7 pmol/L e una serie corrispondente al centrale
95 % delle osservazioni dei 3.3–28 pmol/L.
9CARATTERISTICHE E ESECUZIONE
Il limite della scoperta
Il limite di rilevabilità è 1.7 pmol/L come determinato dalla metodologia descritta nella
ISO11843- Parte 4.
La Capacità di Rivelazione deve essere considerata parte di un metodo di verifica, piuttosto che
la concentrazione minima misurabile. La concentrazione dei campioni con assorbanza inferiore
al Calibrator 1 non devono essere calcolati, maespresse come minori o uguali (≤) rispetto alla
concentrazione indicata sulla fiala per il Calibrator 1.
Riacquisto
Il recupero alla diluizione è 82-118% (media 98%)
Il recupero sull’aggiunta è 93-100% (media 95%)
Hook effect
I campioni con una concentrazione sopra i 80 000 pmol/L può essere analizzata senza dare
falsamente bassi risultati.
Precisione
Ogni campione è stato analizzato su 4 riprodotti in 7 diversi momenti.
Coefficiente di variazione
Valor principale Ripetibilità%* Interno di laboratorio%**
Campioni pmol/L
1 7.3 3.2 5.1
2 20.7 3.2 6.1
3 65.6 2.5 5.0
* Variabilità intra-assay
** La variabilità totale della prova
Specificità
Sono state trovate le seguenti reazioni trasversali:
Insulina < 0.03 %
C-peptideCALIBRATURA
Il kit Mercodia Proinsulin ELISA è calibrato contro i Riferimenti International Reference Reagent
for human proinsulin, IRR 84/611.
IL FATTORE DI CONVERSIONE
1μg/L corrispondono a 110 pmol/L.
GARANZIA
I dati dei rendimenti presentati qui sono stati ottenuti usando le procedure indicate. Qualsiasi
cambiamento o modifica nella procedura non raccomandata da Mercodia AB possono avere
effetti su i risultati, nel caso in cui Mercodia AB rinuncia al diritto tutte le garanzie espresse,
implicite o fissate, inclusa la garanzia implicita per l’uso commerciale e appropriato.
Mercodia AB e i suoi distributori autorizzati, in tal caso, non sarà soggetto a danni indiretti
o consequenziali.
RIFERIMENTI
Gaines-Das, RE and Bristiw AF (1988) WHO International reference reagents for human proinsu-
lin and human insulin C-peptide. J Biol Stand 16:179-186
Garcia CA, Prabakar KR, Diez J, Cao ZA, Allende G, Zeller M, Dogra R, Mendez A, Rosenkranz
E, Dahl U, Ricordi C, Hanahan D, Pugliese A (2005) Dendritic cells in human thymus and pe
riphery display a proinsulin epitope in a transcription-dependent, capture-independent fashion.
J Immunol 175:2111-2122
Riserus U, Vessby B, Arner P, Zethelius B (2004) Supplementation with trans10cis12-conjugated
linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men: close association with impaired insulin
sensitivity. Diabetologia 47:1016-1019
Yin H, Berg AK, Westman J, Hellerstrom C, Frisk G (2002) Complete nucleotide sequence of
a Coxsackievirus B-4 strain capable of establishing persistent infection in human pancreatic
islet cells: effects on insulin release, proinsulin synthesis, and cell morphology. J Med Virol
68:544-557
Ulteriori riferimenti sono disponibili sulla nostra pagina web: www.mercodia.com
11PROTOCOLLO DI SINTESI
Mercodia Proinsulin ELISA
Aggiungere Calibrators, controlli* e
50 μL
campioni
Aggiungere Assay Buffer 50 μL
1 ora a 18–25°C in una piastra shaker
Incubazione
(700-900 rpm)
Lavare piastra con la soluzione tampone
700 µL, 6 volte
di lavaggio 1X
Aggiungere di soluzione enzyme
100 μL
conjugate 1X
1 ora a 18–25°C in una piastra shaker
Incubazione
(700-900 rpm)
Lavare piastra con la soluzione tampone
700 µL, 6 volte
di lavaggio 1X
Aggiungere Substrate TMB 200 μL
Incubazione 15 minuti a 18–25°C
50 μL
Aggiungere Stop Solution Scuotere per 5 secondi per assi curarsi
che sia tutto mescolato
Misura A450 Valutare i risultati
*Non forniti Per tutti i dettagli vedere a pagina 7
Per assistenza tecnica contattare: support@mercodia.com
31-3110
Version 15.0
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