Calprotectina ELISA KIT - Per la determinazione di calprotectina fecale in vitro (MRP 8/14)
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Calprotectina ELISA KIT
Per la determinazione di calprotectina fecale in vitro (MRP 8/14)
1
Manuale Calprotectina(MRP8/14)
1. APPLICAZIONE
Il kit ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) presentato è indicato per la determinazione in vitro di
Calprotectina (MRP 8/14) nelle feci. E’ da utilizzarsi solamente per la diagnosi in vitro.
2. INTRODUZIONE
Nomi alternativi della Calprotectina:
Calgranulina A: MRP8, CP-10 (nel topo)
Calgranulina B: MRP 14, S100A9
MRP 8/14: L1, (p8,14), p34
La Calprotectina è una proteina legante il calcio secreta prevalentemente dai neutrofili e dai monociti. La
Calprotectina fecale è un marker di patologie infiammatorie e neoplastiche intestinali.
E’ spesso difficoltoso discriminare fra sindromi di intestino irritabile e problemi organici cronici. Questo porta nella
maggior parte dei casi ad eseguire indagini invasive (es: colonscopie…). Il test per la determinazione di
Calprotectina permette di differenziare i due gruppi di pazienti. I livelli di Calprotectina fecale correlano
significativamente con gli accertamenti istologici ed endoscopici nel morbo di Crhon e nella retto-colite ulcerosa
tanto quanto l’eliminazione nelle feci di Indio-111-marcato da parte dei granulociti neutrofili. Per questo motivo è
suggerito come “gold standard” del livello di infiammazione nelle patologie infiammatorie intestinali. D’altro canto
la determinazione di Indio-111-marcato è estremamente costosa (ospedalizzazione del paziente, dispositivi per
l’analisi di materiale radioattivo) ed è vincolata all’esposizione del paziente a radioattività. Per questa ragione è
sconsigliata la determinazione ripetuta in bambini e gestanti.
Livelli elevati di Calprotectina sono da considerarsi valori predittivi migliori di altri markers di infiammazione tipici,
quali PCR e VES. Il confronto fra uno screening condotto con questo marker e i valori di sangue occulto nelle feci
nel cancro del colon-retto ha dimostrato chiaramente la superiorità diagnostica del test della Calprotectina fecale.
I risultati dimostrano un elevato significato diagnostico. Ad un basso livello di Calprotectina nelle feci corrisponde
un’elevata possibilità che non esistano patologie organiche intestinali.
INDICAZIONI
• Marker di infiammazione acuta
• Valutazione del grado di infiammazione gastro-intestinale
• Monitoraggio del morbo di Crhon, Colite ulcerosa o dopo rimozione di polipi intestinali o cancro del colon-
retto.
• Diagnosi differenziale tra semplici problemi di “intestino irritabile” (IBS) e patologie intestinali organiche
(IBD)
3. MATERIALE FORNITO
N°. catalogo denominazione Componenti del kit quantità
K 6930MTP PIASTRA Supporto con strisce 12 × 8 pozzetti
pretrattate
K 6930WP WASHBUF Tampone di lavaggio ELISA 2 × 100 ml
10×
K 6930A2 AB Anticorpo concentrato 50 µl
(anticorpo monoclonale
anti-Calprotectina
(MRP8/14), legato a
biotina)
K 6930ST STD Standard di Calprotectina, 5 flaconi
pronti all’uso (0; 3.9; 15.6;
62.5; 250 ng/ml)
K 6930KO CTRL Controllo, pronto all’uso 1 flacone
(vedere quanto specificato
per il range)
K 6930K CONJ Coniugato concentrato 50 µl
(legato alla perossidasi
exravidina)
K 6930TMB SUB Substrato TMB 15 ml
(tetrametilbenzidina),
pronto all’uso
K 6930AC STOP Soluzione d’arresto, pronta 7 ml
all’uso
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Manuale Calprotectina(MRP8/14)
4. MATERIALE RICHIESTO NON FORNITO
• Acqua bidistillata
• Bilancia analitica
• Pipette da 10-1000 µl
• Parafilm
• Agitatore orizzontale di micropiastre con incubatore a 37°C
• Dispensatore per micropiastre o dispensatore automatico
• Centrifuga da 3000 × g
• Vortex-mixer
• Vetreria da laboratorio
• Lettore di micropiastre a 450 nm ( lunghezza d’onda di riferimento 620 o 690 nm)
1. PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI
• Al fine di poter utilizzare più volte i reattivi assicurarsi che siano conservati alle condizioni descritte sulle
etichette. Preparare solo le quantità necessarie per ciascuna determinazione. Il kit può essere
utilizzato per 4 volte entro la data di scadenza espressa sulla confezione.
• I reagenti con volumi inferiori a 100 µl possono essere centrifugati prima dell’utilizzo per evitare perdite
di volume.
• Il tampone ELISA concentrato (WASHBUF) deve essere diluito con acqua bidistillata 1:10 prima
dell’uso (100 ml di concentrato + 900 ml di acqua bidistillata), miscelare bene. Potrebbero verificarsi
delle cristallizzazioni dovute all’elevata concentrazione di sali nella soluzione madre. I cristalli devono
essere sciolti a temperatura ambiente o in acqua a 37°C prima della diluizione. Il tampone concentrato è
stabile a 2-8°C fino alla data di scadenza presente sull’etichetta. La soluzione diluita può essere
conservata in un flacone chiuso a 2-8°C per 1 mese.
• L’anticorpo monoclonale (AB) deve essere diluito 1:1000 con il tampone (WASHBUF) (10 µl AB e 10
ml di tampone). L’anticorpo è stabile a 2-8°C fino alla data di scadenza riportata. L’anticorpo diluito
non è stabile e non può essere conservato.
• Il coniugato (CONJ) deve essere diluito 1:1000 con il tampone (WASHBUF) (10 µl CONJ e). L’anticorpo
è stabile a 2-8°C fino alla data di scadenza riportata. Il coniugato diluito non è stabile e non può
essere conservato.
• Tutti gli altri reagenti sono pronti all’uso. Sono stabili fino alla data di scadenza se conservati a 2-8°C.
6. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Estrazione del campione di feci
Il tampone (WASHBUF) è usato come soluzione di estrazione.
1. si raccomanda l’uso del dispositivo di raccolta del campione di feci per dosarne 100 mg (kit di raccolta da
Roche Diagnostic, Mannheim, Germany; cat.# 745804). Il campione di feci deve essere sospeso in 5 ml di
tampone.
Volume costante del tampone: 5 ml
Fattore costante di diluizione: 1:50
2. in alternativa, il campione di feci può essere pesato manualmente entro un range di 80-120 mg.
a. l’aggiunta di 5 ml di tampone non dipende dalla quantità del campione.
Volume costante del tampone: 5 ml
Il fattore di diluizione varia a seconda della quantità di campione come mostrato nei calcoli successivi.
Controllare la tabella con i fattori corretti qui di seguito:
3Manuale Calprotectina(MRP8/14)
Peso (mg) Fattore di diluizione Peso (mg) Fattore di diluizione
80 62.5 102 49.0
82 60.9 104 48.1
84 59.5 106 47.2
86 58.1 108 46.3
88 56.8 110 45.5
90 55.6 112 44.6
92 54.3 114 43.9
94 53.2 116 43.1
96 52.1 118 42.4
98 51.0 120 41.6
100 50
b. Il volume del tampone per i singoli campioni dipende dalla quantità di campione (vedi tabella). Il fattore di
diluizione rimane costante
volume del tampone variabile
fattore di diluizione costante: 1:50
Ne consegue che, lo stesso fattore di diluizione può essere usato per tutti i campioni nella valutazione successiva
dei risultati.
Peso (mg) Volume del Peso (mg) Volume del
tampone (ml) tampone (ml)
80 4.0 102 5.1
82 4.1 104 5.2
84 4.2 106 5.3
86 4.3 108 5.4
88 4.4 110 5.5
90 4.5 112 5.6
92 4.6 114 5.7
94 4.7 116 5.8
96 4.8 118 5.9
98 4.9 120 6.0
100 5.0
Successivamente, miscelare le feci con il tampone; vortex per almeno 30 secondi a seconda della consistenza del
campione.
Trasferire circa 1 ml di sospensione (1°passaggio di diluizione) in un tubo Eppendorf e centrifugare per 5
minuti a 13000 rpm (=13000g)
DILUIZIONE DEL CAMPIONE
Campione di feci
Il sovranatante ottenuto con l’estrazione (1° passaggio di diluizione) è diluito 1:50 con il tampone (WASHBUF).
Per esempio:
20 µl di sovranatante (diluizione 1) + 980 µl di tampone (WASHBUF) = 1:50 (2°passaggio di diluizione)
per l’analisi, pipettare 100 µl di sovranatante del 2° passaggio di diluizione per pozzetto.
La Calprotectina nelle feci è da considerarsi stabile per 6 giorni circa. In ogni caso, si raccomanda di conservare I
campioni per non più di 48 ore a 2-8°C. Periodi di conservazione più lunghi prevedono lo stoccaggio a –20°C.
Scongelare lentamente i campioni, ad esempio una notte a 2-8°C, e portare a temperatura ambiente prima
dell’analisi.
(Poullis A et al (2002) Aliment Pharmacol Thr 16: 675-681)
4Manuale Calprotectina(MRP8/14)
2. PROCEDURA
Principio del test
Il sistema utilizza la tecnica a “sandwich” con due anticorpi monoclonali selezionati che legano la Calprotectina
umana.
Gli standard, i controlli e i campioni diluiti dei pazienti che devono essere processati sono aggiunti ai pozzetti della
micropiastra che presentano sul fondo un anticorpo monoclonale ad alta affinità anti-Calprotectina umana.
Durante la prima incubazione, la Calprotectina, presente nel campione, si lega con l’anticorpo fissato.
Nell’incubazione successiva, un anticorpo monoclonale legato a biotina anti-Calprotectina umana è aggiunto al
contenuto di ogni pozzetto della micropiastra. Viene poi aggiunto in ogni pozzetto un coniugato legato alla
exravidina e successivamente si formano i complessi: l’anticorpo legante - Calprotectina umana – anticorpo
biotinilato di rilevazione – coniugato con perossidasi. La tetrametilbenzidina è utilizzata come substrato per la
perossidasi. Infine, viene aggiunta una soluzione acidificante d’arresto per terminare la reazione. Il colore cambia
da blu a giallo. L’intensità della colorazione gialla dipende dalla concentrazione di Calprotectina presente nel
campione. Si ottiene una curva dose-risposta dell’unità di assorbanza (densità ottica, OD a 450 nm) riferita alla
concentrazione, usando come riferimento i valori ottenuti dagli standard. La Calprotectina presente nei campioni
dei pazienti è determinata direttamente da questa curva.
Procedura del test
1. Portare tutti i reagenti e i campioni a temperatura ambiente (18-26°C) e miscelare bene
2. Riportare le posizioni di STANDARD/CAMPIONE/CONTROLLO in un protocollo operativo
3. Preparare tante strisce della micropiastra quante sono necessarie. Stoccare le strisce che non
vengono utilizzate a 2-8°C dopo averle coperte. Sono stabili fino alla data di scadenza.
4. Lavare berne ogni pozzetto per 5 volte dispensando 250 µl di tampone diluito in ciascuno di essi.
Dopo l’ultimo lavaggio, la micropiastra capovolta può essere battuta su carta assorbente per
facilitare l’asciugatura.
5. Aggiungere 100 µl di STD/CAMPIONE/CTRL in doppio nei rispettivi pozzetti
6. Coprire con cura la piastra e incubare per 1h a 37°C su un agitatore orizzontale**
7. Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto. Lavare 5 volte dispensando 250 µl di tampone diluito in
ciascun pozzetto. Dopo l’ultimo lavaggio, la micropiastra capovolta può essere battuta su carta
assorbente per facilitare l’asciugatura.
8. Aggiungere 100 µl di AB (anticorpo di rilevazione) in ciascun pozzetto
9. Coprire bene la piastra e incubare per 1h a 37°C su un agitatore orizzontale**
10. Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto. Lavare 5 volte dispensando 250 µl di tampone diluito in
ciascun pozzetto. Dopo l’ultimo lavaggio, la micropiastra capovolta può essere battuta su carta
assorbente per facilitare l’asciugatura
11. Aggiungere 100 µl di CONJ (coniugato) in ciascun pozzetto
12. Coprire con cura la piastra e incubare per 1h a 37°C su un agitatore orizzontale**
13. Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto. Lavare 5 volte dispensando 250 µl di tampone diluito in
ciascun pozzetto. Dopo l’ultimo lavaggio, la micropiastra capovolta può essere battuta su carta
assorbente per facilitare l’asciugatura
14. Aggiungere 100 µl di SUB (substrato) in ciascun pozzetto
15. Incubare per 10-20 minuti al buio* a temperatura ambiente (18-26°C)
16. Aggiungere 50 µl di STOP (soluzione d’arresto) in ciascun pozzetto, miscelare perfettamente
17. Determinare immediatamente l’assorbanza con un lettore di micropiastre a 450 nm contro 620 (o
690) nm come riferimento. Se non vi è la possibilità di una lunghezza d’onda di riferimento, leggere
solo a 450 nm. Se lo standard più alto cade fuori dalla capacità del fotometro, l’assorbanza deve
essere misurata immediatamente a 405 nm contro un riferimento di 620 nm.
5Manuale Calprotectina(MRP8/14)
*l’intesità del colore cambia con la temperatura. Si raccomanda di osservare il cambiamento di colore e di
fermare la reazione quando si presenta una chiara differenza.
**l’incubazione a 37°C su un agitatore orizzontale è raccomandata dalla metodica, se non è possibile
miscelare durante l’incubazione, si raccomanda di incubare a 37°C senza alcuna agitazione.
8. RISULTATI
I seguenti algoritmi possono essere utilizzati alternativamente per calcolare i risultati. Si raccomanda di usare
l’ “algoritmo a 4 parametri”.
1. algoritmo a 4 parametri
si suggerisce di utilizzare in ordinata lineare la densità ottica e in ascissa logaritmica la concentrazione.
Quando si usa un’ascissa logaritmica, lo zero del calibratore deve essere corrispondente ad un valore
inferiore ad 1 (es. 0.01)
2. calcolo point-to-point
si raccomanda un’ordinata lineare per la densità ottica ed un’ascissa lineare per la concentrazione.
3. curva algoritmica
si suggerisce di utilizzare in ordinata lineare la densità ottica e in ascissa logaritmica la concentrazione.
Quando si usa un’ascissa logaritmica, lo zero del calibratore deve essere corrispondente ad un valore
inferiore ad 1 (es. 0.01)
L’accettabilità dei risultati potrebbe essere verificata prima di una loro validazione. Se questo non è
possibile con il programma in uso, un controllo dei risultati in doppio potrebbe essere fatto manualmente.
Campioni di feci
Per ottenere la concentrazione di Calprotectina nei campioni di feci, moltiplicare il valore ottenuto con il
fattore di diluizione stabilito nella preparazione del campione:
preparazione del campione 1 e 2b: fattore di diluizione costante: 1:50
moltiplicare il risultato ottenuto con 2500 (1° passaggio di diluizione × 2° passaggio di diluizione) per
ottenere la concentrazione finale
preparazione del campione 2a: il fattore di diluizione è variabile
il fattore di diluizione corrispondente è preso dalla tabella e deve essere moltiplicato per 50 (2° passaggio
di diluizione) per ottenere la concentrazione finale.
6Manuale Calprotectina(MRP8/14)
Curva di calibrazione
STD OD1 OD2 Media OD CV (%) Conc. [ng/ml]
0 0.050 0.047 0.049 4.7 0
1 0.119 0.104 0.112 9.5 3.9
2 0.275 0.268 0.271 1.8 15.6
3 1.021 1.080 1.050 4.0 62.5
4 2.208 2.333 2.270 3.9 250
I dati sono solo dimistrativi e non possono essere utilizzati per verificare i risultati delle determinazioni.
7Manuale Calprotectina(MRP8/14)
Sensibilità
La sensibilità è stata misurata a Bo + 1SD. Lo zero di riferimento è stato misurato 24 volte.
Campione Calprotectina Deviazione standard Limite di lettura
valore medio (SD) [ng/ml]
[OD]
1 0.094 0.011 2.915
Linearità
Due campioni sono stati diluiti con il tampone e poi analizzati. I risultati sono mostrati di seguito:
Campione Diluizione Atteso Rilevato
[ng/ml] [ng/ml]
A 10 000 223.0 223.0
20 000 111.5 116.5
40 000 55.75 61.0
B 10 000 135.0 137.0
20 000 67.5 62.5
40 000 33.75 36.125
12. PRECAUZIONI
• solo per diagnostica in vitro
• devono essere osservate le linee guida del controllo di qualità
• il materiale di derivazione umana presente nel kit è stato testato ed è negativo per HIV, Epatite B ed
Epatite C. In ogni caso, per ragioni di sicurezza, si raccomanda di trattare ogni componente come
potenzialmente infetto.
• I reagenti contengono sodio azide e mertiolato come battericida. Sono entrambi tossici. I substrati per le
reazioni enzimatiche colorimetriche sono tossici e cancerogeni. Evitare il contatto con la pelle e le
mucose.
• La soluzione di arresto è composta da acido solforico, che è un acido forte. Anche diluito va maneggiato
con cura. Può causare bruciature e deve essere maneggiato con guanti, occhiali e camice. Gli schizzi
devono essere immediatamente risciacquati con abbondanti quantità d’acqua.
13. ACCENNI TECNICI
• Non utilizzare componenti del kit di lotti differenti
• I reagenti non devono essere usati oltre la data di scadenza espressa sull’etichetta
• La soluzione del substrato deve rimanere incolore fino all’utilizzo
• Per assicurare risultati corretti è necessario chiudere in modo appropriato le piastre durante le
incubazioni.
• Evitare la produzione di schiuma quando si miscelano i reagenti
• La seduta deve procedere seguendo quanto spiegato nel manuale
9Manuale Calprotectina(MRP8/14)
9. RACCOMANDAZIONI
I campioni di feci con valori di Calprotectina più alti dello standard maggiore devono essere diluiti con il tampone e
riletti.
10. CONTROLLO DI QUALITA’
Immundiagnostik AG raccomanda l’uso di campioni di controllo per il controllo di qualità interno, se sono reperibili.
I campioni di controllo dovrebbero essere analizzati ad ogni seduta. L’accettabilità dei risultati deve essere
verificata con appropriati metodi statistici. I risultati dei campioni dei pazienti potrebbero non essere validi se nella
stessa seduta uno o più valori del controllo di qualità sono fuori dai limiti.
Valori attesi
Valori normali
(1g di feci è equivalente ad 1ml)
Calprotectina fecale: < 15 mg/l
Area grigia 10-15 mg/l
Si suggerisce a ciascun laboratorio di stabilire dei propri range di concentrazione.
11. CARATTERISTICHE DEL TEST
Precisione e riproducibilità
Intra-Assay (n=40)
Campione Calprotectina CV
[ng/ml] [%]
1 12.768 9.75
2 18.997 4.18
Inter-Assay (n=20)
Campione Calprotectina CV
[ng/ml] [%]
1 8.485 16.55
2 17.512 6.04
Due campioni sono stati miscelati con 4 differenti concentrazioni di standard di Calprotectina e misurati usando il
seguente schema.
n=2
Campione Aggiunta Calprotectina attesa Calprotectina rilevata
[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml]
8.2 50.0 58.2 65.0
8.2 21.0 29.2 34.0
8.2 9.5 17.7 20.0
8.2 4.5 12.7 15.0
19.2 50.0 69.2 77.3
19.2 21.0 40.2 41.5
19.2 9.5 28.7 29.9
19.2 4.5 23.7 25.2
8Manuale Calprotectina(MRP8/14)
14. NOTE GENERALI SUL TEST
• Questo sistema è stato prodotto e presentato sul mercato in accordo con le linee guida IVD del 98/79/EC.
• Tutti i reagenti contenuti nel kit sono solo per uso diagnostico in vitro.
• Sono state osservate le linee guida per i laboratori bio-medici.
• I tempi di incubazione, le temperature di incubazione e i volumi utilizzati sono definiti nella procedura.
Ogni variazione della procedura del test, non accordata con la casa produttrice, può influenzare i risultati
del test. Immundiagnostik AG non è responsabile degli eventuali danni recati da un uso non appropriato.
• Segnalazioni e reclami devono essere fatti entro 14 giorni dal ricevimento del prodotto. Il prodotto deve
essere rispedito ad Immundiagnostik accompagnato da una spiegazione scritta.
15. BIBLIOGRAFIA
1. Poullis A et al. (2002) Aliment pharmacol Thr 16 : 675-681
2. Fagerhol et al. (2000) The Lancet 356 : 1783-1784
3. Tibble et al. (2000) Gut 47 : 506-513
4. Tibble et al. (2000) Gastro 119 : 15-22
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