ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN FORMALINA E INCLUSI IN PARAFFINA (FFPE) - SALVATORE ...

ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON
PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA
ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN
    FORMALINA E INCLUSI IN
       PARAFFINA (FFPE)

          SALVATORE GIRLANDO

   LABORATORIO PATOLOGIA MOLECOLARE
         ANATOMIA PATOLOGICA
                TRENTO

Estrazione acidi nucleici

• Estrazione DNA primo passo nelle applicazioni di biologia
  molecolare

• Metodi si basano sul tipo di acido nucleico che si vuole estrarre
  (DNA/RNA)

• Materiale di partenza ad esempio sangue o tessuti o altro materiale

• Risultato desiderato (quantità, purezza)

• Applicazione prevista post-estrazione ad esempio tipo di indagine
  molecolare

Estrazione acidi nucleici

• DNA molecola molto lunga soggetta a frammentazioni

• Difficile estrarlo in forma intatta

• Frammenti di 50 – 100 kilobasi (kb) sono ottimi per effettuare tutte le
  indagini di biologia molecolare

• Da materiale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) il
  DNA si presenta molto degradato ed è consigliabile amplificare al
  massimo frammenti di 300 bp

Estrazione degli acidi nucleici

• Può essere estratto da qualsiasi tessuto o cellula nucleata

• Da materiale fresco e/o congelato

•   Da materiale fissato in formalina e incluso in paraffina

•   Altro (sangue, plasma, capelli, frammenti di tessuti, ecc.)

Estrazione degli acidi nucleici
       (DNA/RNA) da campioni fissati in
     formalina e inclusi in paraffina (FFPE):
                       fasi

1.   Taglio 8-10 fette da biopsie, 2-3 da pezzo operatorio dello
     spessore di 10 µm

2.   Sparaffinatura/digestione O.N. con tampone di lisi più proteinasi K

3.   Purificazione dell’acido nucleico (più metodi)

4.   Precipitazione DNA

5.   Valutazione quantitativa

6.   Conservazione

1. Taglio delle fette di tessuto

• Da pezzo operatorio: 3-4 fette spesse 10 µm in provetta o su vetrino

• Da biopsia: 7-8 fette sempre dello stesso spessore (10µm )

• Altri metodi prevedono lo scraping, direttamente da vetrino, di cellule
  o fette di tessuto precedentemente colorate e utilizzati per diagnosi
  cito o istologiche

Fase 2. Processo di Sparaffinatura

       • Aggiungere 1 ml di xilene e mescolare per
         10 minuti

       • Centrifugare a 12000 rpm per 5 minuti

       • Eliminare il surnatante facendo attenzione
         al pellet

       • Si ripete una seconda volta il passaggio

2. Processo di sparaffinatura

       • Aggiungere 1 ml di Etanolo Assoluto

       • Mescolare per 5 min

       • Centrifugare a 12000 rpm per 2 min

       • Eliminare l’Etanolo assoluto          facendo
         attenzione a non toccare il pellet

       • Fare asciugare i campioni e aggiungere il
         tampone di lisi (TRIS-HCl 50 mM ph 8.3) e
         proteinasi K (20 mg/ml)

3. Purificazione acidi nucleici


   Metodo fenolo/cloroformio (miscela fenolo:cloroformio:
    alcool isoamilico (25:24:1)


   Metodo del salting out (precipitazione delle molecole
    proteiche)


   Kits commerciali (molto in uso), maggiore velocità di
    estrazione

Purificazione Fenolo/Cloroformio

•   Inattivazione della proteinasi K ad alta temperatura

•   Purificazione con miscela fenolo: cloroformio: isoamil alcool (25:24:1)

•   Separa una componete organica inferiore contenete lipidi, proteine e
    estratti cellulari

•   Fase acquosa superiore contenente gli acidi nucleici

•   Fase intermedia proteine denaturate e in parte dissolte dal fenolo

 Precipitazione DNA
  - Aggiunta etanolo assoluto (1 mL) e tampone ad alta forza ionica (50 µL)
     (Na acetato 3 M pH 5.2)
   - Precipitazione DNA (formazione gomitolo)
  - Centrifugazione a velocità alta (12.000 rpm)
  - Lavaggio pellet con etanolo 70 %(1 mL) per rimuovere sali in eccesso
  - Evaporazione etanolo (potente inibitore enzimatico), per almeno
    15 min a provetta aperta
  - Il DNA precipitato e asciutto può essere conservato a -20°C.

 Risospensione DNA precipitato
  - Il DNA viene risospeso in H2O o nel tampone previsto
    dalla metodica.
  - Può essere conservato a +4°C per qualche settimana o a
  - 80°C per molti anni (evitare i congelamenti e scongelamenti ripetuti
   che danneggiano il DNA)
                                                                           11

Estrazione fenolo/cloroformio

• Precipitazione del DNA in etanolo assoluto e in presenza
  di Sali ad alte concentrazioni (100 – 500 mM) per
  eliminare i residui di Fenolo e cloroformio

• Eliminazione surnatante e successivo lavaggio con
  EtOH       70% per eliminare i cationi

• Centrifugazione ed eliminazione dell’ETOH 70%

• Risospendere il pellet con buffer TE o con H2O

Purificazione con metodica salting-out

• Dopo inattivazione della proteinasi K mediante alta
  temperatura vengono aggiunte 200µl di ammonio
  acetato (sale) 4 M favorendo la precipitazione delle
  proteine

• Campioni vengono vortexati e centrifugati ad alta
  velocità per 3 min.

• Trasferimento del surnatante in altra provetta e aggiunta
  di isopropanolo (600 ul)

Purificazione con metodica salting-out

• Centrifugazione ad alta velocità per 5 min.

• Pellet lavato con ETOH 70% e centrifugazione sempre
  ad alta velocità per 1 min

• Eliminazione del surnatante

• DNA sciolto in 50 µl di TE o H2O

Estrazione con kit commerciale (Qiagen)

• QIAmp DNA mini kit

• QIAmp DNA FFPE kit (specifico per tessuti paraffinati)

• Accorciamento dei tempi di estrazione

• Minore resa in termini di concentrazione di DNA (solo se si usa
  sistema automatizzato)

Purificazione DNA da tessuti FFPE

              • Lasciare asciugare il pellet facendo
                attenzione a non seccarlo

              • Risospendere in 180 µl di buffer ATL
                contenente detergenti più 20 µl di
                proteinasi k

              • Incubare a 56°C per almeno 3 ore o
                fino a che il pellet non sia
                completamente digerito

              • Procedere con la fase di
                purificazione

Purificazione DNA da tessuti FFPE

           • Aggiungere 200 µl di buffer AL
             contenente agenti caotropici e incubare
             per 10 min a 70°C;

           • Aggiungere 200 µl di ETOH ass.

           • Trasferire il tutto in una colonnina con una
             base di silice, centrifugare

           • Fare lavaggi con due passaggi con buffer
             AW1 e AW2 per lavare il DNA legati alla
             membrana

           • Eluire con 50 – 200 µl di buffer AE o H2O

MACRODISSEZIONE

Blocchetto paraffina   Ematossilina/eosina   Fetta in bianco

MICRODISSEZIONE
Biopsia bronchiale        Dopo
  colorazione EE     microdissezione

MICRODISSEZIONE

    Agoaspirato             Dopo
polmonare citologico   microdissezione

BAL > 50
tumor cells
   Esperienza di Modena