ECONOMIA CIRCOLARE: NON SOLO GEOMETRIE - La valorizzazione sostenibile degli scarti della filiera vitivinicola - Valsovit
←
→
Trascrizione del contenuto della pagina
Se il tuo browser non visualizza correttamente la pagina, ti preghiamo di leggere il contenuto della pagina quaggiù
ECONOMIA CIRCOLARE:
NON SOLO GEOMETRIE
La valorizzazione sostenibile
degli scarti della filiera vitivinicola
La valorizzazione delle materie prime secondarie è oggi per l’industria un’occasione per incrementare la propria
competitività convertendo i costi di smaltimento in nuove strategie di profitto, creando nuovi prodotti e favoren-
do l’occupazione di personale specializzato alla gestione dei nuovi processi produttivi. Le nuove politiche euro-
pee di governo sostenibile delle produzioni potrebbero così diventare strumento propulsivo di benessere sociale e
contribuire al miglioramento della salubrità ambientale e alla conservazione e difesa della biodiversità.
*Gianni Sacchetti
**Alessandro Massi
*Alessandra Guerrini
I
l costante incremento dell’im- istituzioni di governo e di ricerca
*Massimo Tacchini patto antropico sull’ambiente a perseguire obiettivi focalizzati
in termini di inquinamento, su nuovi approcci produttivi, al-
*Immacolata Maresca
sfruttamento delle risorse, impo- ternativi allo sfruttamento diretto
*Ilaria Burlini verimento della biodiversità, au- delle risorse prime, contribuen-
*Alessandro Grandini mento della popolazione globale, do a costruire e a consolidare un
**Tatiana Bernardi accompagnato da una conseguen- nuovo paradigma, ovvero quello
**Carmela De Risi te crescita costante della doman- dell’economia circolare concre-
da in termini di energia, materie tizzato industrialmente nel con-
prime e prodotti, ha stimolato cetto di bio-raffineria.
58 t natural 1 giugno 2018
RICERCA - SOSTENIBILITà
Immagine tratta dal sito https://u.osu.edu/wine/recycle-process/
dei saperi e delle competenze, da
quella chimica a quella biologi-
ca, da quella ambientale a quel-
la dell’ingegneria impiantistica,
per rendere sempre più concreta
la realtà della bio-raffineria, oggi
sempre più consolidata in un
modello industriale bio-based. Il
passaggio dell’industria verso una
maggiore sostenibilità per miglio-
rare l’efficacia in termini di costi,
l’efficienza dei processi e le cre-
denziali ecologiche rende econo-
micamente valido lo sviluppo di
strategie sostenibili e innovative
per il riutilizzo degli sprechi. Que-
sta visione produttiva, di orizzon-
te globale e multidisciplinare, si
accompagna necessariamente alla
presa di coscienza delle istituzio-
ni governative, chiamate a regola-
mentare la riduzione degli sprechi
e dell’impatto sull’ambiente delle
produzioni non virtuose – talvolta
con modalità emergenziali (per
es. il problema dell’inquinamen-
to da agro-farmaci) – sostenendo
un nuovo sviluppo sociale e indu-
striale nella promozione della cul-
tura del riuso e dell’annullamento
dello scarto (cradle-to-cradle po-
licy). Sulla base di queste premes-
se, l’Europa ha posto in essere,
con progressiva scalarità virtuosa
e rigidità nell’applicazione, diver-
si drivers normativi che vanno
dalle Landfill directives alla più
recente revisione della Waste Po-
licy Legislation (http://ec.europa.
Mentre il concetto di economia la bio-raffineria diventa sottopro- eu/environment/waste/target_re-
circolare è definibile - in termi- dotto, materia prima secondaria view.htm).
ni sintetici ma certamente esau- convertita in nuovi prodotti com- I rifiuti prodotti dalle aziende di
stivi - come un sistema in grado merciabili utilizzando un panel trasformazione alimentare sono
di auto-alimentarsi e sostenersi di strategie produttive a basso un buon esempio di un tipo di
economicamente, il termine di impatto ambientale e sostenibili rifiuti – anche pre-consumer –
bio-raffineria concretizza lo stes- rispetto alla circolarità dell’eco- generati su larga scala e a livello
so concetto a livello di processi nomia bio che li alimenta (Lin et globale. Questo tipo di scarti sta
produttivi industriali dove vengo- al., 2013). diventando sempre più problema-
no massimizzate le rese di output tico in quanto in alcuni casi può
(energia, prodotti con riferimento Le materie prime rappresentare oltre il 50% del to-
a ogni campo industriale) rispet- secondarie: nuove risorse tale dei rifiuti prodotti nei Paesi,
to all’utilizzo delle materie pri- al servizio della sosteni- di cui almeno il 60-70% è costi-
me, minimizzando o annullando bilità e dell’innovazione tuito in media da sostanze orga-
la produzione di scarti. In so- industriale niche.
stanza, ciò che tradizionalmente Questo nuovo paradigma di ri- Da qui, la scala e il ritmo con cui
veniva considerato scarto della cerca e di produzione ha gene- le nostre filiere di trasformazione
produzione, con l’approccio del- rato e consolidato l’interazione agroalimentare producono scarti
giugno 2018 natural 1 t 59
organici, per loro natura fermen- Tech del Tecnopolo dell’Univer- (produzione di poliidrossialcano-
tabili e putrescibili, determinano sità di Ferrara, il Centro Interdi- ati, bio-anidride maleica, etc.) si
inevitabilmente un problema nor- partimentale di Ricerca Industria- veda Massi et al. (2018). In que-
mativo, di smaltimento, di logisti- le Energia e Ambiente (CIRI-EA) sto contesto, invece, verranno
ca e in ultima analisi di costi per dell’Università di Bologna, il Cen- descritte le strategie di approccio,
l’industria stessa. tro Ricerche Produzioni Animali le attività e i risultati ottenuti re-
La valorizzazione delle materie (C.R.P.A. Lab.) di Reggio Emilia, lativamente all’ottimizzazione dei
prime secondarie – non più scar- il Consorzio Laboratorio Energia processi estrattivi applicati ai sot-
ti – è invece oggi per l’industria Ambiente (L.E.A.P.) di Piacenza, toprodotti della lavorazione delle
un’occasione per incrementare la Caviro Distillerie (Faenza, RA; uve per ottenere estratti, frazioni
propria competitività converten- http://www.caviro.com/it/), Eri- e biomolecole biologicamente at-
do i propri costi di smaltimento in dania Sadam SpA (Parma; https:// tive per una valorizzazione indu-
nuove strategie di profitto (nuovi www.sadam.it), CBC (Europe) Srl striale nutraceutica, cosmetica e
prodotti), per favorire l’occupa- (Biogard Division; Cesena; http:// per la difesa delle piante coltivate
zione assumendo personale spe- www.biogard.it/index.php/it/), veicolata a parte del partenariato
cializzato alla gestione profittevo- AmbrosiaLab Srl (Ferrara, http:// aziendale specificatamente legato
le dei nuovi processi produttivi, www.ambrosialab.it/it/) hanno a questi settori di mercato. Per
per adeguarsi alle nuove politiche insieme costituito una partner- quanto attiene nello specifico alle
europee di governo sostenibile ship che si è coagulata attorno a valutazioni di attività biologica, in
delle produzioni diventando stru- un progetto di ricerca industriale questo articolo saranno riportati i
mento propulsivo di benessere so- strategica, rivolto agli ambiti pri- dati preliminari che sono stati di
ciale e contribuendo al migliora- oritari della Strategia di Specializ- indirizzo per i riscontri ottenuti
mento della salubrità ambientale zazione Intelligente (POR-FESR da altri partner di progetto e ri-
e alla conservazione e difesa della 2014-2020) della Regione Emilia portati in Caliceti et al. (2018, in
biodiversità. Romagna, dal titolo Valorizzazio- stampa).
ne sostenibile degli scarti della fi-
Le strategie di valorizza- liera vitivinicola per l’industria
zione e il progetto chimica e salutistica (acronimo: MATERIALI E METODI
VALSOVIT (POR-FESR VALSOVIT).
Emilia Romagna) La natura del partenariato, carat- Il materiale vegetale: le
In generale, lo stato dell’arte della terizzata da soggetti industriali di materie prime secondarie
valorizzazione degli scarti agroa- rilevante importanza nel panora- Gli scarti della lavorazione delle
limentari consiste sostanzialmen- ma produttivo della regione Emi- uve erano costituiti da vinacce
te in due tipi di approccio (Lin et lia Romagna e da istituti di ricer- (da uve bianche, VCB; e rosse,
al., 2013): ca specializzati nel trasferimento VCR) e da vinaccioli isolati, for-
- Approccio di prima generazio- tecnologico, si inserisce in un con- niti dal partner di progetto Caviro
ne. Gli scarti vengono indirizzati testo regionale di filiera vitivinico- Distillerie (Faenza, Ravenna) che
al compostaggio, alla produzione la che allo stato attuale considera provenivano dalla vendemmia del
di energia (digestione anaerobia) principalmente processi di valo- 2016 e 2017.
o trasferiti in discarica; rizzazione di prima generazione Le vinacce da uve rosse e bian-
- Approccio di seconda genera- degli scarti (raspi freschi, bucce, che dealcolate contenevano ri-
zione. Gli scarti vengono indiriz- vinaccia bianca, feccia, teste e spettivamente il 51% e il 36% di
zati verso processi con un più alto code di distillazione dell’etanolo). umidità. All’uscita dei processi di
livello tecnologico e con elevata Le finalità progettuali di Valsovit lavorazione aziendale, i campioni
sostenibilità e un ridotto impat- invece si rivolgono in particolare di vinacce sono stati posti in stu-
to ambientale (per es. tecnologie a una valorizzazione di seconda fa a 70 °C per 24 ore ed essicca-
estrattive con basso o nullo im- generazione per ricercare impor- ti fino a peso costante. Una volta
piego di solventi organici; strate- tanti ricadute per l’industria chi- essiccati, i campioni di vinacce
gie biotecnologiche e trasforma- mica e salutistica, nonché della sono stati macinati in mulino con
tive integrate; utilizzo di sistemi difesa delle piante in agricoltura rotore a velocità variabile e griglia
catalitici ad alta efficienza in pro- promuovendo, con un approccio di macinazione con pori da 2 mm
cessi a cascata) per ottenere (bio) operativo ispirato a un modello di (Fritsch, Germania).
sostanze ad alto valore aggiunto e simbiosi industriale, uno sviluppo I campioni così polverati sono
con ricadute diversificate in più tecnologico sostenibile della filie- stati conservati a -20 °C fino al
settori di mercato. ra. Per gli aspetti di progetto re- momento delle analisi. I cam-
Sulla base di questi paradigmi, il lativi alla valorizzazione rispetto pioni di vinaccioli invece (VLB,
laboratorio in rete Terra&Acqua a ricadute nel comparto chimico vinaccioli da uve bianche; VLR,
60 t natural 1 giugno 2018
RICERCA - SOSTENIBILITà
vinaccioli da uve rosse), caratte- liofilizzati e conservati a -20 ° C La caratterizzazione
rizzandosi per un contenuto d’u- fino al momento delle analisi. Gli chimica
midità inferiore al 5%, sono stati estratti SFE sono stati conservati La caratterizzazione chimica de-
posti immediatamente a -20 °C a -20 °C tal quali in quanto privi gli estratti è stata focalizzata sulla
sin dal momento della consegna della frazione solvente, mentre gli rilevazione di classi di composti
e mantenuti in quella condizione estratti ottenuti per distillazio- generalmente noti per proprietà
fino al momento delle estrazioni e ne in corrente di vapore d’acqua funzionalmente utili nei contesti
analisi. Parte dei campioni di vi- sono stati immediatamente ana- di ricaduta della ricerca, in parti-
nacce, sia bianche (VCB) sia rosse lizzati per gas cromatografia. colare: polifenoli, fenoli semplici,
(VCR), non sono state invece sot- Estrazione assistita da ultrasuo- flavonoidi e derivati, acidi organi-
toposte a essiccamento ma invece ni (UAE) ci, eventualmente attesi con rile-
immediatamente sottoposte a di- L’estrazione assistita da ultrasuo- vante abbondanza negli estratti
stillazione in corrente di vapore ni è stata eseguita utilizzando un idroalcolici (UAE, PFE-NAV); aci-
per valutare la qualità e la quanti- bagno a ultrasuoni (Ultrasonik di grassi, steroli e sostanze lipofile
tà della componente volatile. 104X, Ney Dental International, come stereoisomeri della vitami-
MEDWOW, Cipro) impostato a na E, eventualmente attesi con ri-
I reagenti chimici una frequenza operativa di 48 levante abbondanza negli estratti
impiegati kHz. Le condizioni estrattive non con CO2 supercritica (SFE); com-
Tutti i solventi e i reagenti impie- sono riportate per ragioni di riser- posti terpenici e derivati (mono-,
gati per le analisi chimiche erano vatezza vincolate da un accordo sesqui-, di-terpeni) eventualmen-
di qualità cromatografica, mentre di partenariato. te attesi con rilevante abbondan-
tutti i reagenti impiegati per le Estrazione con fluidi pressuriz- za negli estratti ottenuti con la
valutazioni biologiche erano co- zati (PFE; Naviglio®) distillazione in corrente di vapore
erenti per qualità e purezza con L’estrattore Naviglio® (mod. 500 d’acqua (DIS).
quanto riportato in letteratura. cc; Atlas Filtri, Italia) è stato uti- Analisi (HP)TLC: cromatografia
Lo standard malvidina-3-O-glu- lizzato per estrarre materiale so- su strato sottile ad alta risolu-
coside è stato acquistato da Ex- lido con un metodo di estrazione zione
trasynthese (Genay, Francia). con solvente pressurizzato (Navi- Le analisi sono state eseguite su
Trolox, DPPH (1,1-difenil-2-pi- glio, 2003). una lastra di gel di silice HPTLC
crylhydrazil), metanolo deuterato Le condizioni estrattive non sono 60F254 (10 cm 20 cm; Camag,
(CD3OD), cloroformio deuterato riportate per ragioni di riserva- Swizerland). 8 μl di una soluzio-
(CDCl3), metanolo, etilacetato, tezza vincolate da un accordo di ne etanolica al 50% degli estratti
etanolo, acido formico, acido ace- partenariato. (20 mg/mL) sono stati depositati
tico, NP / PEG e acido gallico sono Estrazione di fluidi supercritici sulla lastra in bande di 6 mm di
stati acquistati da Sigma-Aldrich (SFE) ampiezza utilizzando un micro-
Italia (Milano, Italia). Toluene I campioni sono stati sottoposti depositore Linomat V (Camag,
è stato acquistato da Carlo Erba a estrazione con fluidi supercri- Swizerland) in flusso di azoto. Le
Reagents (Milano, Italia). tici (CO2; SFE) utilizzando un bande depositate sono state eluite
estrattore Speed SFE modello Ap- in due step e successivamente de-
Le strategie estrattive plied Separations (Allentown, PA, rivatizzate con soluzione NP-PEG
Sono state effettuate estrazioni su USA). (Wagner e Bladt, 2009).
campioni essiccati e polverizzati Le condizioni estrattive non sono Contenuto in polifenoli e proan-
di vinacce bianche (VCB) e ros- riportate per ragioni di riserva- tocianidine totali
se (VCR), utilizzando le seguenti tezza vincolate da un accordo di La determinazione del contenuto
tecniche di estrazione: estrazio- partenariato. polifenolico totale negli estratti
ne di fluidi supercritici (SFE), Estrazione per distillazione in è stata eseguita utilizzando uno
estrazione assistita da ultrasuoni corrente di vapore d’acqua spettrofotometro Helios-Gamma,
(UAE) e estrazione di fluido pres- Campioni non essiccati di vinacce ThermoSpectronic seguendo le
surizzato tramite estrattore Navi- bianche (VCB) e rosse (VCR), e di metodiche precedentemente de-
glio® (PFE-NAV). vinaccioli da uve bianche (VLB) e scritte in Tacchini et al. (2015). I
Campioni non essiccati di vinacce rosse (VLR) sono stati sottoposti risultati sono stati espressi come
bianche (VCB) e rosse (VCR) sono a distillazione in corrente di va- mg di acido gallico/g di estratto
stati sottoposti a distillazione in pore. secco per la quantificazione dei
corrente di vapore d’acqua (DIS). Le distillazioni sono state effet- polifenoli totali e mg di cianidin
Ogni estrazione è stata effettuata tuate seguendo le metodiche ri- cloruro/g di estratto secco per la
in triplicato. Gli estratti ottenuti portate in Scalvenzi et al. (2017) quantificazione delle proantocia-
con UAE e PFE-NAV sono stati opportunamente modificate. nidine totali.
giugno 2018 natural 1 t 61
62
t
natural 1
giugno 2018
Immagine tratta dal sito http://nordestboulevard.it/2013/10/grappa-e-design/
RICERCA - SOSTENIBILITà
Analisi HPLC: Cromatografia li-
quida ad alta prestazione
La caratterizzazione dei cam-
pioni finalizzata alla rilevazione
dei principali flavonoidi è stata
eseguita sui campioni di estra-
zione idroalcolica utilizzando un
sistema HPLC modulare JASCO
(Tokyo, Giappone, modello PU
2089) accoppiato a un detector
a fotodiodi (MD 2010 Plus). Per
l’analisi si è fatto riferimento a
quanto riportato in Kammerer et
al. (2004).
Analisi GC-MS: gas cromatogra-
fia accoppiata a spettrometria
di massa
Le analisi gas cromatografiche
sono state sviluppate sui campio-
ni ottenuti dalla distillazione di
matrici (VCA, VCB, VLB, VLR)
fresche e non essiccate. Le analisi
sono state sviluppate seguendo le
indicazioni riportate in Tardugno
et al. (2018).
L’attività biologica
Proprietà antiossidanti Pulitura dello strizzo idraulico
Le proprietà antiossidanti sono Le vinacce dopo la strizzatura
state valutate per poter verifica-
re in via preliminare gli estratti
potenzialmente utili a una proie-
zione salutistica nutraceutica e/o
cosmetica.
L’attività antiossidante degli
estratti è stata valutata sia me-
diante analisi bioautografica
(DPPH-(HP)TLC-bioautographic
assay) sia mediante saggio spet-
trofotometrico (Spettrofotometro
UV-Vis Helios) impiegando per
entrambi i test il radicale DPPH
(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil). I
saggi sono stati sviluppati come
riportato in Nostro et al. (2016).
Tutti gli esperimenti sono stati
effettuati in triplicato e i risultati
ottenuti sono stati riportati come
media ± deviazione standard.
L’attività antimicrobica
L’attività antimicrobica è stata va-
lutata sia verso batteri sia verso
funghi fitopatogeni per verificare
in via preliminare quegli estratti
potenzialmente utilizzabili per
proprietà fitoiatriche.
Per valutare l’attività antibatte-
giugno 2018 natural 1 t 63
rica degli estratti vegetali è stato Per le estrazioni, si è scelto di se- interazioni matrice-solvente in
utilizzato un batterio, Pseudo- lezionare quelle metodiche che ciascuna delle metodiche estratti-
monas syringae pv. syringae van meglio potessero coagulare, come ve adottate. Per le distillazioni in
Hall ATCC 19310. Gli esperimen- finalità di principio, criteri di ef- corrente di vapore d’acqua, inve-
ti di attività antibatterica (MIC, ficienza (alta resa quali-quantita- ce, tutti i campioni sono stati uti-
Minima Concentrazione Iniben- tiva di biomolecole attive), soste- lizzati allo stato fresco minimiz-
te; MCB, Minima Concentrazio- nibilità (basso o nullo impiego di zando in questo modo la perdita
ne Battericida) sono stati allestiti solventi organici) e opportunità dei composti più volatili. Le mo-
seguendo le indicazioni riportate di trasferimento tecnologico (sca- lecole target per l’ottimizzazione
dal National Committee for Cli- le up laboratorio vs. industria). delle estrazioni erano rappresen-
nical Laboratory Standards (NC- In relazione a questi aspetti, pe- tate da polifenoli, fenoli semplici,
CLS, standard M7-A6). raltro caratterizzanti la finalità flavonoidi e derivati, acidi organi-
Per la valutazione dell’attività di valorizzazione sostenibile del ci, eventualmente attesi con rile-
antifungina sono stati invece uti- progetto Valsovit, si è quindi op- vante abbondanza negli estratti
lizzati due funghi fitopatogeni, tato per individuare nell’ampio idroalcolici (UAE, PFE-NAV); aci-
Sclerotinia minor e Sclerotinia e moderno contesto della green di grassi, steroli e sostanze lipofile
sclerotiorum; l’allestimento delle chemistry l’estrazione con ultra- come stereoisomeri della vitami-
colture dei funghi filamentosi e gli suoni (UAE), l’estrazione con flu- na E, eventualmente attesi con ri-
esperimenti di attività antifungi- idi sotto pressione con strumen- levante abbondanza negli estratti
na sono stati condotti seguendo le tazione Naviglio®, l’estrazione con CO2 supercritica (SFE); com-
indicazioni riportate in Guerrini con CO2 supercritica (SFE) e la posti terpenici e derivati (mono-,
et al. (2009). La Minima Concen- distillazione in corrente di vapo- sesqui-, di-terpeni) eventualmen-
trazione Inibente la crescita fun- re d’acqua (DIS) (Baiano, 2014). te attesi con rilevante abbondan-
gina (MIC) e la Minima Concen- Ciascuna matrice di scarto è stata za negli estratti ottenuti con la
trazione Fungicida (MCF) sono dunque sottoposta ad ogni me- distillazione in corrente di vapo-
state determinate seguendole in- todica estrattiva individuata per re d’acqua (DIS). Per le metodi-
dicazioni riportate in Cavalerio verificare quale risultasse la più che UAE e PFE-NAV si è scelto di
et al. (2005). Infine, è stata cal- performante rispetto alle finalità operare con solvente idroalcoli-
colata la concentrazione efficace di principio sopra descritte (Ta- co (etanolo-acqua) individuando
in grado di dare il 50% di effetto bella 1). sperimentalmente nel rapporto
massimale (EC50). Prima di procedere alle estrazioni 50:50 la combinazione più effica-
UAE, PFE-NAV, SFE, le matrici da ce rispetto alle categorie chimi-
vinacce rosse (VCR) e da vinacce che estratte, valutate per numero
RISULTATI bianche (VCB) sono state sotto- e ampiezza delle bande su lastre
E DISCUSSIONE poste a essiccazione in stufa a 70 per cromatografia su strato sotti-
°C per 24 ore fino a ridurre il con- le ad alte prestazioni (HP-TLC),
Le strategie estrattive tenuto di acqua a valori inferiori confermando così anche le indi-
bioguidate da fingerprin- al 5%, seguendo un protocollo di cazioni di letteratura (Da Porto
ting HP-TLC trattamento degli scarti normal- et al., 2013). Analogamente, si è
Le matrici di scarto della lavora- mente adottato in azienda. I vi- operato con SFE individuando le
zione delle uve sono state fornite naccioli da uve rosse (VLR) e da condizioni di set up strumentale
dall’azienda Caviro Distillerie (Fa- uve bianche (VLB) presentavano e tempistiche di estrazione stati-
enza, RA; http://www.caviro.com/ già un tenore di umidità coerente ca e dinamica più adeguate. Per
it/), partner aziendale di progetto, con le esigenze di conservazione DIS, si è fatto invece riferimento
ed erano caratterizzate da vinac- ed estrazione (
RICERCA - SOSTENIBILITà
te al contenuto totale in polifenoli
non si è dimostrata altrettanto ef-
ficace. Infatti, per tutte le matrici,
tranne che per i campioni VCR
dove peraltro lo scarto è risultato
ridotto al 15%, la metodica PFE-
NAV è risultata più performante
nell’estrazione dei polifenoli tota-
li. In particolare, i campioni che
Figura 2. Cromatografia su strato sottile ad alta risoluzione (HP-TLC) degli estratti idroalcolici (a titolo si sono rilevati più ricchi in poli-
d’esempio) per l’individuazione delle condizioni ottimali per ottenere un profilo fitochimico di com- fenoli totali sono risultati sempre
promesso qualitativamente e quantitativamente ottimale rispetto alle categorie chimiche di interesse.
Bande bu-azzurre: polifenoli; bande giallo-verdi: flavonoidi; bande rosse: clorofille. A, campioni VCR; gli estratti da vinaccioli. In parti-
B, campioni VCB; C, campioni VLB. La regione circoscritta in ciascuna lastra corrisponde all’eluizione colare, i vinaccioli da uve bianche
di un estratto idroalcolico al 50%.
(VLB) hanno dato in assoluto i
risultati migliori con entrambi i
corrente di vapore d’acqua (DIS, La caratterizzazione metodi estrattivi ed evidenziando
Tabella 1), rendendo sostanzial- chimica uno scarto di circa il 48% rispetto
mente impraticabile l’ipotesi di I campioni di vinacce di uve rosse ai campioni VLR a parità di me-
scale-up industriale di processo (VCR) e bianche (VCB) e di vi- todo estrattivo più performante
per uno sfruttamento razionale naccioli da uve rosse (VLR) e da (PFE-NAV). Il contenuto negli
dei distillati. Il dato quantitativo uve bianche (VLB) ottenuti con le estratti VLB con PFE-NAV è ri-
riflette quanto riportato in lette- estrazioni con solvente idroalco- sultato sensibilmente superiore a
ratura per quanto attiene alle rese lico mediante ultrasuoni (UAE) e quello con UAE (12% circa). Mag-
totali di estrazioni idroalcoliche e con fluidi pressurizzati con stru- giore lo scarto quantitativo (25%
SFE, mentre sostanzialmente ine- mentazione Naviglio® ottimizza- circa) tra gli estratti PFE-NAV e
dito è il dato relativo agli estratti te per la migliore resa quantitati- UAE per i campioni VLR. Decisa-
DIS. va in polifenoli, sono stati valutati mente più ridotti i risultati relati-
con metodo spettrofotometrico vi alle vinacce, benché gli estratti
per la quantificazione dei polife- da vinacce rosse (VCR) siano ri-
Campioni Metodo estrattivo Resa % Dev. St.
noli totali (Figura 3). sultati con il maggior contenuto
VCR UAE 25,13 3,71
PFE-NAV 10,42 2,38
SFE 4,99 0,06
DIS 0,05 0,002
VCB UAE 27,59 1,68
NAV 13,41 6,25
SFE 1,67 0,03
DIS 0,05 0,002
VLR UAE 12,40 1,04
NAV 13,38 0,56
SFE 8,36 0,19
DIS 0,008 0,002
VLB UAE 11,61 4,39
NAV 9,52 0,76
SFE 6,63 0,50
Figura 3. Nel grafico sono riportati i valori dei polifenoli totali (mg acido gallico/g estratto secco) degli estratti
DIS 0,008 0,002 (VCR, vinacce rosse; VCB, vinacce bianche; VLR, vinaccioli da uve rosse; VLB, vinaccioli da uve bianche) ottenuti
con le metodiche UAE (estrazione con ultrasuoni) e PFE-NAV (estrazione con fluidi sotto pressione con strumen-
Tabella 1. Rese di estrazione (riportate come tazione Naviglio ®) ottimizzate per la migliore rilevazione qualitativa e quantitativa. I dati sono relativi a quanto
valori percentuali medi), relativamente ad estra- ottenuto con solvente idroalcolico al 50%.
zione assistita con ultrasuoni (UAE), estrazione
con fluidi sotto pressione con metodo Naviglio®
(PFE-NAV), estrazione con fluidi supercritici
(SFE) e distillazione in corrente di vapore (DIS; Benché l’estrazione UAE sia ri- in polifenoli totali rispetto ai cam-
su matrici non essiccate). VCR, vinacce rosse sultata più performante rispetto pioni VCB, con uno scarto medio
essiccate; VCB, vinacce bianche essiccate; VLB,
vinaccioli da uve bianche; VLR, vinaccioli da uve alla variabile della resa totale di del 39% rispetto al dato riferito al
rosse. Dev. St., deviazione standard. estratto (Tabella 1), relativamen- metodo estrattivo più performan-
giugno 2018 natural 1 t 65
te. Benché in letteratura siano nu- nidine sono risultati comunque i anche per il contenuto di flavo-
merosi gli esempi relativi al con- vinaccioli, sia da uve rosse (VLR) noidi (Figura 5).
tenuto polifenolico di scarti della sia da uve bianche (VLB). Come In generale, derivati glicosilati
lavorazione delle uve compatibili per i polifenoli totali, però, anche della quercetina e del kaempfe-
con quelli da noi usati per quanto per il contenuto totale in proan- rolo con relativi agliconi, e ruti-
attiene alla loro tipizzazione, non tocianidine i campioni VLB sono na sono risultati sempre presenti
è invece possibile effettuare un risultati i più ricchi con uno scar- in tutti i campioni, sebbene con
confronto costruttivo in quanto to rispetto agli stessi campioni da sensibili variazioni quantitative di
non ne viene mai indicata la pro- uve rosse di circa il 29% a parità profilo cromatografico.
venienza rispetto ai diversi step di di processo estrattivo più perfor- In figura viene riportato, a titolo
lavorazione in filiera. Infatti, dalla mante (UAE). di esempio, il profilo cromatogra-
nostra esperienza, condivisa con
la partnership di progetto, il con-
tenuto in composti polifenolici
può ragionevolmente e significa-
tivamente cambiare in relazione
al momento di processo in cui le
matrici vegetali vengono conside-
rate scarti e quindi indirizzabili
ad altri processi di lavorazione.
Pertanto, per ragionevoli motiva-
zioni di accordo di partenariato e
di potenziale ricaduta applicativa,
i risultati prodotti e qui riportati
sono da ritenersi puramente indi-
cativi e non sostanziali per quan-
to attiene al dato fitochimico, ma Figura 4. Nel grafico sono riportati i valori delle proantocianidine totali (mg di cianidin cloruro/g di
utili sul piano del riscontro della estratto secco) relativi agli estratti (VCR, vinacce rosse; VCB, vinacce bianche; VLR, vinaccioli da
strategia operativa ed estrattiva uve rosse; VLB, vinaccioli da uve bianche) ottenuti con le metodiche UAE (estrazione con ultrasuoni)
e PFE-NAV (estrazione con fluidi sotto pressione con strumentazione Naviglio ®) ottimizzate per
più adeguata all’individuazione la migliore rilevazione qualitativa e quantitativa. I dati sono relativi a quanto ottenuto con solvente
del momento più adatto al pre- idroalcolico al 50%.
lievo dei sottoprodotti in filiera
come adeguate fonti di polifenoli. Gli estratti idroalcolici UAE e fico relativo ai campioni di vinac-
PFE-NAV dei campioni VCR, ce bianche (VCB) ottenuti con
Analoghe premesse e considera- VCB, VLR e VLB sono stati ana- metodo estrattivo con ultrasuoni
zioni sono alla base dei risultati lizzati qualitativamente via HPLC (UAE).
spettrofotometrici ottenuti per
le proantocianidine totali (Figura
4). In particolare, va sottolineato
che a differenza del dato relati-
vo ai polifenoli totali, per tutti i
campioni la metodica estrattiva
più performante rispetto al con-
tenuto totale di proantocianidine
è risultata quella con ultrasuoni
UAE (Figura 4). In particolare,
la differenza a parità di qualità
di campione tra i metodi estrat-
tivi (PFE-NAV, UAE) rispetto alla
quantità totale di proantocianidi-
ne era estremamente diversificata
ma sempre piuttosto rilevante,
ovvero: del 42% per VCR, del
64% per VCB, dell’89% per VLR e
Figura 5. Profilo cromatografico di un estratto da vinacce bianche (a titolo di esempio) ottenuto con
del 93% per VLB. I campioni più analisi HPLC in fase inversa e con detector a fotodiodi (RP-HPLC-DAD) da cui è possibile evincere i
ricchi in assoluto di proantocia- composti flavonoidici rilevati glicosilati e non glicosilati più abbondanti.
66 t natural 1 giugno 2018
RICERCA - SOSTENIBILITà
Sono state poi effettuate analisi punto di vista di quantità relative gia di composti né per la quantità.
gas cromatografiche degli estratti sono emerse differenze interes- Il dato atteso era piuttosto quello
con CO2 supercritica per valuta- santi. In particolare nei campioni di un fitocomplesso prevalente-
re la qualità degli estratti lipo- di vinacce rosse (VCR) i composti mente terpenico, mentre invece
fili con specifico riferimento al più abbondanti espressi per area i composti rilevati erano presenti
contenuto di acidi grassi e alla % sono risultati l’acido palmitico sostanzialmente con una abbon-
composizione della frazione insa- (53,7%), acido miristico (7,6%), danza inferiore all’1%. Questo
ponificabile (Figura 6). In parti- acido dodecanoico (6,1%), acido aspetto è probabilmente spiegabi-
colare, particolarmente interes- oleico (5,2%). Nei campioni di vi- le con il fatto che le vinacce fre-
sante sono risultati i campioni nacce bianche (VCB) erano pre- sche, prima di essere fornite per le
di vinaccioli, già peraltro noti senti l’acido palmitico (41,3%), analisi, avevano subito condizioni
per essere fonte di un olio dalle acido palmitoleico (6,7%), acido per cui la maggior parte dei com-
pregiate qualità nutrizionali e per oleico (5,49%), acido miristico ponenti volatili era scomparsa.
cui emerge la prevalenza dell’aci- (4,8%). I campioni di distillato di Ha sorpreso invece la composizio-
do linoleico confermando peral- vinaccioli invece sia da uve bian- ne in acidi grassi che per i nostri
tro i dati di letteratura relativi a che e sia da uve rosse sono risul- campioni è risultata sia qualita-
estratti ottenuti con la medesima tati con un profilo quali-quanti- tivamente sia quantitativamente
tecnica (Passos et al., 2010). tativo sostanzialmente analogo più ricca rispetto ai campioni ot-
Per quanto riguarda gli estratti caratterizzato da acido palmitico tenuti con SFE. Dal momento che
Figura 6. Estratti SFE. Profili gas cromatografici di un estratto SFE di vinaccioli da uve bianche (VLB). A, profilo gas cromatografico dove vengono eviden-
ziati i principali acidi grassi. B, profilo gas cromatografico della frazione insaponificabile.
ottenuti per distillazione in cor- (29,6%), acido linoleico (19,4%), i campioni estratti con SFE erano
rente di vapore (DIS), l’analisi etilestere dell’acido palmitico stati essiccati mentre gli stes-
gas cromatografica ha rivelato (11,1%), acido alfa linolenico si campioni distillati erano stati
una composizione di tutti i cam- (10,5%), acido oleico (6,9%). Non estratti freschi (con la speranza
pioni prevalentemente caratte- ci sono dati di letteratura che ci fossero ricchi nella componen-
rizzata da acidi grassi (Tabella permettono di confrontare questi te volatile terpenica) è possibile
2) con tracce di composti sesqui- risultati relativamente a distillati ipotizzare che il pre-trattamento
terpenici (dati non presentati). I di scarti, tuttavia è possibile fare in stufa a 70 °C abbia degradato
campioni hanno presentato tut- alcune considerazioni rispetto al la gran parte della componente di
ti un profilo qualitativo sostan- dato oggettivo. Innanzitutto, il acidi grassi, rimasta invece nelle
zialmente simile, mentre da un dato non era atteso né per tipolo- matrici fresche.
giugno 2018 natural 1 t 67Figura 7. Attività antiossidante con metodo spettrofotometico del DPPH. Nel grafico sono riportati gli
estratti che hanno evidenziato le attività più rilevanti. I valori sono riportati come mmol equivalenti di
Trolox / g di estratto secco.
derazione gli estratti idroalcolici dine totali rapportato al metodo
ottenuti con metodo PFE-NAV e estrattivo, in quanto i campioni
UAE in quanto caratterizzati dalla maggiormente ricchi di polifenoli
componente polifenolica più ab- erano quelli ottenuti con il metodo
bondante e normalmente presa a PFE-NAV. Questo aspetto è evinci-
riferimento per esprimere attività bile anche per gli altri estratti, per
antiossidante (Figura 7). Non si è esempio VCR UAE e VLR UAE. In
osservata una corrispondenza di- ogni caso e come premesso, il dato
Tabella 2. Estratti ottenuti per distillazione retta tra il contenuto di polifenoli, è del tutto preliminare e neces-
in corrente di vapore d’acqua (DIS). A titolo proantocianidine e flavonoidi con sita di ulteriori approfondimenti
di esempio viene riportata la composizione l’attività antiossidante espressa nel non solo dal punto di vista della
dell’estratto ottenuto dalla distillazione di vi-
nacce bianche (VCB) dal momento che, benché saggio spettrofotometrico, se non bioattività, ma anche dal punto di
estremamente bassa, hanno rivelato una resa che i campioni vinaccioli da uve vista fitochimico per poter meglio
complessivamente più elevata (0,05%). bianche (VCB) hanno espresso i correlare i dati di caratterizzazio-
risultati di maggior rilievo. In que- ne chimica e di attività biologica,
I risultati preliminari sto caso, l’attività rilevante degli ponendo in luce eventuali aspetti
sull’attività biologica estratti VCB UAE era certamente sinergici che al momento sembra-
e le possibili proiezioni attesa ma non risulta direttamente no essere alla base delle apparenti
applicative correlabile per esempio con il dato discrepanze.
Gli estratti di vinacce rosse e bian- dei polifenoli delle proantociani- Per quanto riguarda invece l’attivi-
che (VCR, VCB) e da vinaccioli da
uve rosse e bianche (VLR, VLB)
Antibatterica (MIC µg/ml) Antifungina (EC50 µg/ml)
sono stati valutati preliminar- Pseudomonas syringae pv. syringae Sclerotinia minor Sclerotinia sclerotiorum
mente per le proprietà antiossi- VCR UAE > 1000 n. d. n. d.
danti con metodo spettrofotome- VCB UAE > 1000 n. d. n. d.
VCR PFE-NAV > 1000 n. d. n. d.
trico del DPPH, e antimicrobiche VCB PFE-NAV > 1000 n. d. n. d.
in vitro. La scelta rispetto a que- VLR UAE > 1000 > 15 > 15
sta tipologia di saggi è stata gui- VLB UAE > 1000 > 15 > 15
data dal fatto che da un punto di VLR PFE-NAV > 1000 > 15 > 15
VLB PFE-NAV > 1000 > 15 > 15
vista preliminare l’attività antios- Controllo positivo 125 < 0.5 < 0.5
sidante è senz’altro una proprietà
di sicuro interesse per le possibili Tabella 3. Attività antimicrobica di estratti idroalcolici di vinacce da uve rosse e bianche (VCR, VCB) e
da vinaccioli da uve rosse e bianche (VLR, VLB). I risultati sono espressi come Minima concentrazione
proiezioni nutraceutiche e cosme- Inibente la crescita (MIC µg/ml) per l’attività antibatterica e come concentrazione efficace in grado di
tiche del progetto Valsovit. Per le dare il 50% di effetto massimale (EC50) per quanto riguarda l’attività antifungina.
n.d.: non definite. In questi casi il ceppo ha evidenziato invece un forte incremento di crescita anzi-
proprietà antiossidanti con test ché un’inibizione, probabilmente dovuta alla componente zuccherina degli estratti. Controlli positivi:
DPPH sono stati presi in consi- Delan 70 WG, per Pseudomonas syringae pv. syringae); Heliocuivre S, per Sclerotinia sp.)
68 t natural 1 giugno 2018RICERCA - SOSTENIBILITà
tà antimicrobica, sono stati allesti- so estrattivo un fattore chiave e possono risultare un’ottima fonte
ti saggi preliminari in vitro con il determinante nel miglioramento di biomolecole utili a contesti ap-
preciso scopo di individuare estrat- sostenibile dei processi e nella loro plicativi, ma hanno altresì messo
ti eventualmente promettenti per conversione rispetto a un profilo in evidenza l’importanza della co-
ulteriori approfondimenti rispetto industriale bio-based e di econo- noscenza del grado di sfruttamen-
all’attività fitoiatrica, ovvero per la mia circolare. La scelta del metodo to delle risorse primarie, ovvero
difesa sostenibile delle coltivazioni estrattivo dipende innanzitutto dal del grado di lavorazione che han-
come ulteriore ricaduta applicativa tipo di matrice vegetale (coriacea o no subito le uve prima di essere
prevista dal progetto (Tabella 3). meno), dalla sua condizione (umi- considerate come materie prime
Sono stati saggiati, anche in questo da o secca), dalla sua pezzatura secondarie. Questo aspetto è sot-
caso in via del tutto preliminare, (frantumata, triturata, polverata), tovalutato dalla letteratura scienti-
gli estratti idroalcolici da matrici e dal tipo di biomolecole target fica specializzata e riduce l’impatto
VCR, VCB, VLR, VLB. Come evin- che si intendono ottenere per nuo- applicativo delle evidenze ripor-
cibile, non sono state registrate vi prodotti finiti. Nell’ambito del tate. In questo contesto, il merito
attività degne di nota. Anzi, con progetto Valsovit, trattandosi di un del progetto Valsovit e dell’attività
particolare riferimento all’attività contesto di valorizzazione legato di ricerca applicata che lo caratte-
antifungina, si è osservato un in- anche alla sostenibilità ambienta- rizza è senz’altro quello di porre
cremento di crescita dovuto con le, è stato necessario selezionare, in evidenza questo parametro per
ogni probabilità alla componente tra i processi individuati in relazio- poter concretizzare realisticamen-
zuccherina presente negli estratti. ne alle già elencate variabili, quelle te lo sfruttamento delle risorse in
In relazione a queste evidenze, le strategie estrattive ispirate alla gre- un’ottica di economia circolare.
prospettive di progetto riguarde- en chemistry che perseguono l’ot- In aggiunta a queste considera-
ranno la valutazione degli stessi tenimento di estratti minimizzan- zioni, le valutazioni di bioattività
estratti privati della frazione zuc- do l’impiego di solventi organici, il preliminari correlate alle evidenze
cherina, nonché delle frazioni o cui smaltimento rappresenterebbe chimiche, impongono la necessità
eventuali molecole isolate putative a livello industriale un costo sia di approfondire la caratterizzazio-
di un’attività degna di una proiezio- economico sia ambientale ingente, ne chimica degli estratti, per po-
ne applicativa su scala industriale. per di più vincolato da strette rego- ter meglio individuare eventuali
lamentazioni normative (Baiano, molecole o frazioni chimiche degli
Conclusioni 2014). estratti stessi responsabili delle
La valorizzazione delle materie pri- Gli estratti ottenuti, caratterizzati bioattività, benché deboli, con pro-
me secondarie delle filiere agro-a- da un punto di vista chimico in via iezioni nutraceutiche, cosmetiche
limentari vede innanzitutto nella preliminare, hanno dimostrato che e/o fitoiatriche. Questo portereb-
scelta e ottimizzazione del proces- gli scarti della filiera vitivinicola be, in un’ottica di processo bio-
La valorizza-
zione delle
Foto di R. Longo
materie prime
secondarie –
non più scarti
– è invece oggi
per l’industria
un’occasione
per incremen-
tare la propria
competitività
giugno 2018 natural 1 t 69guidato, a modificare le condizioni Journal of Applied Microbiology (2006), tin, L., Mazzoni, R., Viganò, F., Righi, S.,
estrattive individuando quei para- Vol. 100 pp 1333-38 Passarini, F., Soldano, M., Labartino, N.
metri che determinano l’otteni- Da Porto, C., Porretto, E., Decorti D. 2018. Dagli scarti delle uve una risor-
mento di estratti arricchiti in prin- 2013. Comparison of ultrasound-as- sa per l’industria chimica: il progetto
cipi attivi con le attività biologiche sisted extraction with conventional ex- Valsovit. La Chimica e l’Industria - News-
traction methods of oil and polyphenols letter, 5(4), 16-24.
desiderate rendendo il processo di
from grape (Vitis vinifera L.) seeds. Naviglio, D. 2003. Naviglio’s Principle and
sfruttamento delle materie prime
Ultrasonics Sonochemistry, 20 (2013) Presentation of an Innovative Solid–Liq-
secondarie realisticamente e con-
1076–1080. uid Extraction Technology: Extractor
cretamente operativo anche per
Favretto, D., Flamini, R. 2000. Application Naviglio®. Analytical Letters, 36(8),
uno scale up industriale. 1647–1659.
of Electrospray Ionization Mass Spec-
trometry to the Study of Grape Anthocy- Nostro, A., Guerrini, A., Marino, A., Tac-
anins. American Journal of Enology and chini, M., Di Giulio, M., Grandini, A., …
UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FERRARA Saraçoğlu, H. T. 2016. In vitro activity
Viticulture, 51, 55-64.
*
Dipartimento di Scienze della Vita e of plant extracts against biofilm-produc-
Guerrini, A., Sacchetti, G., Rossi, D., Pa-
Biotecnologie ing food-related bacteria. Internation-
ganetto, G., Muzzoli, M., Andreotti, E.,
**
Dipartimento di Scienze Chimiche e Tognolini, M., Maldonado, M.E., Bruni, al Journal of Food Microbiology, 238,
Farmaceutiche R. 2009. Bioactivities of Piper aduncum 33–39.
L. and Piper obliquum Ruiz & Pavon Passos, C.P., Silva, R.M., Da Silva, F.A., Co-
Valorizzazione sostenibile degli scarti della (Piperaceae) essential oils from Eastern
imbra, M.A., Silva, C.M. 2010. Supercrit-
filiera vitivinicola per l’industria chimica e ical fluid extraction of grape seed (Vitis
Ecuador. Environmental Toxicology
salutistica (VALSOVIT): il progetto Valsovit vinifera L.) oil. Effect of the operating
è finanziato dalla Regione Emilia Romagna and Pharmacology, 27, 39–48.
conditions upon oil composition and an-
(POR-FESR) ed ha come finalità lo sfrut- Kammerer, D., Claus, A., Carle, R., Schie-
tioxidant capacity. Chemical Engineer-
tamento di seconda generazione dei sotto- ber, A. 2004. Polyphenol Screening of
ing Journal, 160, 634–640.
prodotti della filiera vitivinicola attraverso Pomace from Red and White Grape Va-
processi sostenibili per ottenere biomoleco- Rossi, D., Guerrini, A., Bruni, R., Brognara,
rieties (Vitis vinifera L.) by HPLC-DAD-
le ad alto valore aggiunto. E., Borgatti, M., Gambari, R., Sacchetti,
MS/MS. Journal of Agricultural and
G. 2012. Trans-resveratrol in nutraceuti-
Food Chemistry, 52, 4360−4367.
Bibliografia Lin, C.S.K., Pfaltzgraff, L.A., Herrero-Da-
cals: Issues in retail quality and effective-
Baiano, A. 2014. Recovery of Biomolecules ness. Molecules, 17(10), 12393–12405.
vila, L., Mubofu, E.B., Abderrahim,
from Food Wastes — A Review. Mole- Scalvenzi, L., Grandini, A., Spagnoletti, A.,
S., Clark, J.H., Koutinas, A.A., Kopsa-
cules, 19, 14821-14842. Tacchini,M., Neill, D., Ballesteros Lara,
helis, N., Stamatelatou, K., Dickson, F.,
Caliceti, C., Calabria, D., Porru, E., Fran- J.L., Sacchetti, G., Guerrini, A. 2017.
Thankappan, S., Mohamed, Z., Brockles-
co, P., Fiori, J., Zangheri, M., Guardigli, Myrcia fallax (Rich.) DC. (Myrtaceae)
byc, R., Luque, R. 2013. Food waste as a
M., Mirasoli, M. 2018. Valorizzazione essential oil from Amazonian Ecuador:
valuable resource for the production of
sostenibile degli scarti della filiera viti- a chemical characterization and bioac-
chemicals, materials and fuels. Current tivity profile. Molecules, 22(7), art. no.
vinicola come fonte di nutraceutici per
situation and global perspective. Energy 1163.
l’industria salutistica - focus sulla dis-
& Environmental Science, 6, 426–464. Tacchini, M., Spagnoletti, A., Marieschi,
funzione endoteliale (Sustainable recov-
Maietti, S., Rossi, D., Guerrini, A., Useli, M., Caligiani, A., Bruni, R., Efferth, T., …
ery of wine by-products as a source of
C., Romagnoli, C., Poli, F., Bruni R., Sac- Guerrini, A. 2015. Phytochemical profile
nutraceuticals for the healthcare indus-
chetti, G. 2013. A multivariate analysis and bioactivity of traditional ayurvedic
try - focus on endothelial dysfunction).
approach to the study of chemical and decoctions and hydro-alcoholic mac-
Pharmanutrition & Functional Foods,
functional properties of chemodiverse erations of Boerhaavia diffusa L. and
(in stampa).
plant derivatives: lavender essential oils. Curculigo orchioides Gaertn. Natural
Cavaleiro, C; Pinto, E; Gonc¸alves, M J;
Flavour and Fragrance Journal, 28(3), Product Research, 29(22), 2071–2079.
and Salgueiro, L. Antifungal activity of
144-154 Tardugno, R., Spagnoletti, A., Grandini,
Juniperus essential oils against dermato-
Massi, A., Sacchetti, G., Galletti, P., Ber- A., Maresca, I., Sacchetti, G., Pellati, F.,
phyte, Aspergillus and Candida strains.
Benvenuti, S. 2018. Chemical profile and
biological activities of Cedrelopsis grevei
H. Baillon bark essential oil. Plant Bio-
systems, 152(1, 2), 120-129.
Wagner, H., Bladt S., 2009. Plant drug
analysis. A Thin Layer Chromatography
Atlas, second Edition, Springer Verlag,
Berlin.
70 t natural 1 giugno 2018Puoi anche leggere
