Dal DNA allo spazio: modelli radiobiologici a confronto
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Dal
DNA
allo
spazio:
modelli
radiobiologici
a
confronto
Gabriele
Babini &
Giorgio
Baiocco
http://radbiophys.unipv.eu/
Dipartimento
di
Fisica,
Università
di
Pavia
-‐ Seminari
del
Martedì
– 12
Dicembre
2017
RadBioPhys
RadBioPhys
4.
Gabriele
Babini,
S.
Marco,
Venezia postdoc
2. 4.
1.
Sofia
Barbieri,
dottoranda 3.
1. 5.
2.
Jacopo
Morini,
postdoc (biologo)
3.
Andrea
Ottolenghi,
5.
Giorgio
Baiocco
il
Professore ricercatore
a
t.
determinato
…e
inoltre,
anche
se
non
nel
selfie…
6.
Giuseppina
Borsci 7.
Vere
Smyth
laureanda
(t.
magistrale
in
biotecnologie) (CONCERT
project)
Complessità
e
modelli
multiscala
Il
nostro
obiettivo:
lo
studio
delle
interazioni
della
radiazione
ionizzante
(di
tutti
i
tipi!)
con
la
materia
biologica
• Meccanismi di
interazione
• Effetti,
immediati
e
a
lungo
termine
• Risposta
del
sistema
(complesso!)
alla
perturbazione rappresentata
dalla
radiazione,
e
uso
della
radiazione
come
“sonda”
per
testare
la
risposta
di
sistemi
particolari
• Valutazione
del
rischio legato
all’esposizione
• Sviluppo
di
contromisure (radioprotezione)
Abbiamo
bisogno
di
MODELLI:
• che
rispecchino
il
sistema
reale
(mapping feature)
• che
ci
permettano
di
concentrarci
su
alcune
delle
proprietà
del
sistema,
tralasciando
ciò
che
non
è
di
interesse
nello
studio
specifico
(reduction feature)
• che
possano
essere
usati
al
posto
del
sistema
reale
e
siano
informativi su
quest’ultimo
per
gli
aspetti
di
interesse
(pragmatic feature)
Complessità
e
modelli
multiscala
La
RADIAZIONE
IONIZZANTE agisce
tramite
deposito
di
energia
(eccitando
e
ionizzando
atomi
e
molecole)
con
EVENTI distribuiti:
• spazialmente su
scala
nanoscopica (10-‐9 m)
• temporalmente
in
intervalli
di
tempo
dell’ordine
del
fm
(10-‐15 s)
Vogliamo
valutarne
le
conseguenze:
• a
livello
di
cellule,
tessuti
e
organi
• su
periodi
di
giorni,
mesi,
anni…
Dobbiamo
sfruttare
al
meglio
i
nostri
strumenti
teorici e
sperimentali
applicati
ai
MODELLI a
nostra
disposizione
per
studiare
l’effetto
delle
radiazioni
su
un
sistema
complesso
5
in
silico
in
sì·∙li·∙co/
in
vitro
modelli
radiobiologici
in
vì·∙tro/
in
vivo
in
vì·∙vo/
Radiazioni
e
DNA
Le
ionizzazioni e
eccitazioni causate
dalla
radiazione possono
danneggiare
una
macromolecola di
fondamentale
importanza:
il
DNA
modello in
silico :
Es:
modellizzazione
Monte
Carlo
della
TRACCIA della
radiazione
e
della
conseguenza
dei
depositi
di
energia
sul
DNA
Perché
in
silico ?
Perché
NON
ESISTONO
tecniche
sperimentali
DIRETTE
per
misurare la
quantità
di
energia
depositata
a
livello
subcellulare
(Microdosimetria,
nanodosimetria)
Protone, 10 MeV Particella α, 10 MeV Ione ossigeno, 200 MeV Simulazioni in acqua, con il codice PARTRAC 10-‐15 s (sviluppatore principale: W. Friedland, Helmholtz Center, München, DE ) TRACCIA della radiazione: raccolta di eventi di deposito di energia – identificati dalle coordinate spaziali, dal tipo di interazione e dalla quantità di energia depositata • Interazioni PRIMARIE (della particella responsabile della traccia) • Interazioni SECONDARIE (elettroni messi in moto dalla particella primaria) Ma anche: INTERAZIONI con MOLECOLE D’ACQUA che danno origine a specie chimiche reattive (RADICALI, specie con un elettrone spaiato) che vanno seguiti nel processo di DIFFUSIONE (10-‐12 – 10-‐6 s )
Ionizzazioni dirette nei componenti del DNA (danno DIRETTO) o RADICALI che diffondono e raggiungono il DNA (danno INDIRETTO) possono causare DANNO al DNA Sovrapposizione della traccia simulata a una riproduzione software del DNA, per la valutazione delle conseguenze sul target
Danni
iniziali
al
DNA
radioindotti
Ad
esempio:
La
distribuzione
dei
DANNI
(COMPLESSITÀ)
dipende
dal
tipo
di
RADIAZIONE
e
dall’ENERGIA
SSB DSB Complex Lesion
Single
Strand Break
Double
Strand Break
DSB
cluster
1
Gy di
radiazione
(60Co),
~100
000
ionizzazioni,
di
cui
~2000
nel
DNA
1000
SSB 40
DSB ~
1CLEvoluzione
del
danno
La
cellula
ha
a
disposizione
dei
MECCANISMI
di
RIPARO,
la
cui
efficacia
dipende
però
dalla
COMPLESSITÀ
DEL
DANNO
INIZIALE
Un
processo
di
riparo
NON
FUNZIONANTE o
NON
CORRETTO
(ad
es.
aberrazione
cromosomica) può
portare
a
conseguenze
quali
ad
esempio:
• la
MORTE
CELLULARE – obiettivo
dell’uso
della
radiazione
sul
bersaglio
tumorale
in
radio/adroterapia
• l’iniziazione
del
processo
di
CARCINOGENESI
– alla
base
del
RISCHIO di
conseguenze
a
lungo
termine
dell’esposizione
alla
radiazione
Se
la
complessità
del
DANNO dipende
dal
tipo
di
radiazione,
e
l’efficacia
del
RIPARO
dipende
dalla
complessità
del
danno…
…
l’esito
finale
dell’esposizione
(anche
a
lungo
termine!)
dipende
dal
TIPO
di
RADIAZIONE:
• Maggiore
efficacia
biologica
della
terapia
con
ioni
Carbonio
rispetto
alla
terapia
con
protoni
per
l’eradicazione
tumorale
• Maggiore
rischio
a
lungo
termine
per
astronauti
esposti
a
ioni
pesanti
nello
spazio
per
l’insorgenza
di
tumore
Trasporto
di
radiazione
e
struttura
di
traccia
Un
esempio
di
applicazione
della
simulazione
di
irraggiamento
a
cellula
singola
con
target
DNA:
Durante
la
terapia
con
particelle
le
interazioni
nei
tessuti
generano
neutroni
secondari,
che
possono
portare
a
una
dose
di
radiazione
ai
tessuti
sani,
lontani
dal
tumore
da
trattare.
Assessing the risk of second malignancies after modern
radiotherapy
W.D. Newhauser & M. Durante 2011, Nat Rev Cancer
11(6): 438–448Danno
da
neutroni
secondari
in
adroterapia
I
neutroni
a
seconda
della
loro
energia
inducono
diverse
reazioni
nucleari
e
accelerano
specie
cariche
diverse,
che
vanno
a
colpire
il
DNA
G.
Baiocco
et
al.
https://www.nature.com/articles/srep34033
rispetto
al
danno
da
fotoni
Danno
da
neutroni
Commissione
EU
Studiando
come
cambia
il
danno
finale
al
DNA
(lesioni
complesse)
in
funzione
dell’energia
dei
neutroni
spieghiamo
la
variazione
degli
effetti
misurati
sperimentalmente
Misure
radiobiologiche
in
vitro
modello in
vitro
COLTURA
CELLULARE
Tecnica
che
permette
di
far
crescere
e
proliferare
cellule
in
ambiente
artificiale
controllato
IRRAGGIAMENTO
di
una
coltura
CELLULARE
Riproduzione
in
silico
per
verifica
condizioni
irraggiamento
e
dosimetria
Misure radiobiologiche in vitro ENDPOINT Effetto che si vuole misurare al termine di un particolare processo di risposta del sistema alla radiazione (o a altri stimoli) Es.: DANNO al DNA • Possiamo misurare un MARCATORE del DANNO (con diverse tecniche) e ottenere una QUANTIFICAZIONE che sarà dipendente dal marcatore e dalla tecnica scelta per la lettura Es.: FOSFORILAZIONE dell’istone H2AX Istoni: Proteine strutturali attorno alle quali si avvolge il DNA In caso di danneggiamento del DNA l’istone H2AX più vicino viene fosforilato (addizione di un gruppo fosfato, γH2AX) richiamando proteine e enzimi per la riparazione del danno
γH2AX
foci
Introducendo
opportune
colorazioni
è
possibile
osservare
(ad
es.)
al
microscopio
a
fluorescenza
la
distribuzione
dei
siti
dove
è
avvenuta
la
fosforilazione
dell’istone
–
ovvero
dei
siti
in
cui
è
in
corso
il
processo
di
riparo
al
DNA
danneggiato
Nucleo
cellulare
• NUMERO
dei
FOCI
T.
Ohnishi et
al.,Biochem. and
Biophys.
Res.
Comm.
390(3)
485
(2009)
Detection of
space radiation-‐induced double
strand
NON
irraggiato
• GRANDEZZA
• CINETICA
(comparsa
e
scomparsa)
• …
Tenendo
conto
della
limitazione
della
Nucleo
cellulare
tecnica
di
lettura
(risoluzione
del
microscopio,
etc…)
breaks
as a
track in
cell nucleus
irraggiato
con
fotoni
e
utilizzando
la
modellizzazione
per
riprodurre
l’osservatore…
Tracce
di
ioni
Ferro
visibili
nel
nucleo
cellulare
Tesi
di
Dottorato
di
S.
Barbieri13/12/17 Dottorato in Fisica XXIII ciclo 19
13/12/17 Dottorato in Fisica XXIII ciclo 20
Effetto
Bystander
Attraverso
giunzioni
“gap”
(solo
piccole
molecole,
come
ad
esempio
il
Calcio,
possono
essere
scambiate)
Attraverso
rilascio
di
proteine
di
segnalazione
nell’ambiente
circostante
(e.g.
proteine
rilasciate
nel
terreno
di
coltura,
nel
plasma,
etc).13/12/17 Dottorato in Fisica XXIII ciclo 22
13/12/17 Dottorato in Fisica XXIII ciclo 23
Co-‐Coltura
1)
Cellule Bystander
(non irraggiate)
Cellule irraggiate
Particelle
Alpha
13/12/17Un
esempio
Le
cellule
Caco-‐2
sono
cellule
epiteliali
del
carcinoma
del
colon-‐retto.
In
vitro
X-‐RAYS
creano
una
barriera
impermeabile
agli
ioni,
come
nell’intestino.
Caco-‐2
monolayer
CYTOKINES
PBMC
I
PBMC
sono
invece
i
globuli
bianchi
presenti
nel
sangue
J.
Morini,
G.
Babini et al,
Frontiers in
Immunology,
8:223. doi: 10.3389/fimmu.2017.00223Un
esempio
X-‐RAYS
J.
Morini,
G.
Babini et al,
Frontiers in
Immunology,
8:223. doi: 10.3389/fimmu.2017.00223Analisi
effettuate
A
24h
e
48h
Vitalità
cellulare
Ogni
3-‐4
ore
Resistenza
Elettrica
Trans-‐Epiteliale
A
48h
Studio
dell’espressione
delle
giunzioni
serrate
A
48h
Studio
dei
livelli
di
rilascio
di
proteine
di
segnalazione
J.
Morini,
G.
Babini et al,
Frontiers in
Immunology,
8:223. doi: 10.3389/fimmu.2017.00223Modelli
in
vivo
Quali
vantaggi
offrono
rispetto
ai
modelli
in
vitro?
Perché
a
volte
sono
necessari?
Modelli
in
vivo
Nonostante
gli
studi
sulle
cellule
possano
essere
estremamente
dettagliati,
essi
difficilmente
riproducono
fedelmente
i
complessi
sistemi
di
regolazione
e
comunicazione
tra
le
diverse
cellule
che
compongono
tessuti,
organi
e,
più
in
generale,
un
intero
organismo.
Questi
modelli
sono
particolarmente
utili,
ad
esempio,
nel
caso
di
studi
per
trial
clinici
di
nuove
terapie
nella
cura
dei
tumori
(o
le
cause
di
insorgenza).
Medulloblastoma e
radiazioni
ionizzanti
Il
medulloblastoma è
un
tumore
pediatrico
del
Sistema
Nervoso
Centrale,
localizzato
nel
cervelletto.
Lo studio dell’incidenza di Medulloblastoma in
un modello in vivo (topo) ha permesso di
osservare, quasi per caso, l’effetto abscopale
indotto da radiazioni ionizzanti.Setup sperimentale
Topi
Ptch1+/-‐ al
giorno
2
post
nascita.
M.
Mancuso
et al, PNAS,
vol.
105
no.
34,
12445–12450,
2008Nonostante il topo fosse schermato alla testa, l’insorgenza di
medulloblastoma aumenta signficativamente (linea rossa) rispetto
ad un irraggiamento con basse dosi ma distribuite su tutto il corpo
(WB 0.036 Gy).
M.
Mancuso
et al, PNAS,
vol.
105
no.
34,
12445–12450,
2008Radiazioni
e
Cataratta
È
possibile
effettuare
studi
sull’induzione
di
cataratta
causata
dall’esposizione
alle
radiazioni
ionizzanti?
Sì!! La
raccolta
di
informazioni
da
pazienti
sono
un’utilissima
fonte
di
dati
ma
spesso
frammentari
e
non
univocamente
riconducibili
ad
un
singolo
fattore
(dieta,
lavoro,
età,
etc).
Con
un
esperimento
mirato
in
vivo
si
possono
evitare
possibili
sinergie
con
altri
fattori
ed
individuare
il
fattore
di
rischio
dell’esposizione
a
IR.
13/12/17 33Risultati preliminari
Your
logo
here Topi
adulti
PROGETTO
EUROPEO
“LDLensRad”,
coordinato
dall’Università
di
Oxford
(Gennaio
2017
– 2020).
Courtesy of
M.
Mancuso,
ENEA-‐Casaccia,
Roma,
IT
This project has received funding from the Euratom research and training programme 2014-2018 under grant agreement No 662287.Radiazioni
ed
Effetti
Cognitivi
Per
il
video:
13/12/17 https://www.youtube.com/watch?v=ScfOE1qMIFY 35Radiazioni
ed
Effetti
Cognitivi
Tempo
di
fuga
Dose
crescente
Giorni
di
allenamentoCome
studiare
gli
effetti
delle
radiazioni
nella
singola
cellula
o
in
un
organo?
Come
analizzare
i
dati?
È
possibile
avere
una
visione
d’insieme
delle
perturbazioni
indotte
dalla
radiazione?Dogma
Centrale
della
Biologia
Processi
biologici
Replicazione
Trascrizione Traduzione Metabolismo
DNA RNA Proteine Metaboliti Fenotipo
Tipologia
di
Omica
Trascrittomica Proteomica Metabolomica
Genetica
Epigenetica
Whole Directed or
Gene
expression
Genome Comprehensive
analysis (microarrays,
Sequencing,
Metabolomics
RNA-‐Seq)
WES,
SNP
Genotyping DNA
Methylation,
Mass
Spect Proteomics,
Histone Modifications,
Post-‐Translational Tipo
di
Chromatin Remodelling Modifications analisi
Perché
al
giorno
d’oggi
spesso
si
parla
(e
si
producono
moltissimi
dati)
di
“omica”
www.genome.gov/sequencingcostsdata.Oggi Silverman et al, Discov Med 14 (75): 143-‐52 (2012)
È
possibile
analizzare
fenomeni
complessi,
fondati
su
relazioni
non-‐lineari tra
le
varie
componenti,
che
vengono
perturbati
da
agenti
esterni,
come
ad
esempio
le
radiazioni
ionizzanti?
Systems (Radiation)
BiologyCiclo iterativo della Biologia dei Sistemi (Systems Biology)
Voli e
aeroporti
La Connettività
può essere un
importante
parametro per
identificare quali
sono gli “hubs”
più importanti.
I
nodi presenti in
questa network
in
cui
si individua il maggior numero
di collegamenti (voli da/per)
sono ovviamente i più importanti!In ambito medico source: Albert-‐László Barabási
In ambito biologico
In
ambito
biologico
Q.
Ma
et
al,
Nucleic
Acids
Research
41(11),
2013Multi-‐level integration of “omics”
datasets
47
http://www.snubi.org/cancer.htmlRadiazioni
nello
spazio
Qual
è
la
risposta
di
un
sistema
biologico
alle
condizioni
estreme
dello
spazio,
in
vista
di
una
missione
a
lungo
termine
nello
spazio
profondo,
ad
es.
verso
Marte?
Fattori
di
stress:
• gravità
• Isolamento
prolungato
• ...
• Radiazione !
in
vivo
(!)
La
permanenza
di
astronauti
sulla
Stazione
Spaziale
Internazionale
ci
permette
di
avere
informazioni
“dirette”
…in
spatio
in
spà·∙ti·∙o/Radiazioni
nello
spazio
Poche
particelle
cm2/s,
1
mSv/giorno
Fino
a
1010 cm2/s,
~
Sv !
Rischi
a
lungo
termine
(GCR)
e
immediati
(Solar
events),
anche
all’interno
dell’habitat:
COME
PROTEGGERE
l’EQUIPAGGIO?
Es.
RIFUGI
per
le
tempeste
solari,
con
protoni
di
energia
tale
da
poter
essere
schermatiEffetti
short-‐term non-‐cancer
Soglie
stabilite
da
NASA
per
le
missioni
in
orbita
terrestre
bassa
(Low Earth
Orbit)
per
la
dose
assorbita
(fisica,
in
Gy o
con
un
peso
per
l’effetto
biologico
in
Gy-‐Eq)
in
30
giorni
da
tessuti/organi
soggetti
all’insorgenza
di
effetti
a
breve
termine
(diversi
dal
tumore)
Acqua
per
la
radioprotezione
spaziale
Calcolo
della
riduzione
di
dose a
tessuti
sensibili(midollo
osseo)
in
caso
di
evento
solare,
per
l’astronauta
che
indossa
degli
elementi
protettivi
pieni
di
acqua,
all’interno
di
un
habitat
spaziale
ma
fuori
dal
rifugio
anti-‐radiazioni
Modelli
concettuali
Già
a
bordo…
e
efficiente!
Simulazioni
GRAS/Geant Riduzione
di
dose
~ 40%
– 50%
M.
Vuolo,
G.
Baiocco
et
al. Exploring innovative
radiation shielding approaches in
space:
Life
Sciences in
Space
Research 15,
69,
2017 A
material and
design
study for
a
wearable radiation protection spacesuitPERSEO PErsonal Radiation Shielding for intErplanetary missiOns
La sessione sperimentale a bordo della ISS 7 Novembre 2017
Da
dove
arrivano
i
fondi
per
fare
tutto
ciò…
• TRANSAT – TRANSversal Actions for Tritium (2017-2021)
• LENSRAD – Towards a full mechanistic understanding of low dose radiation induced cataracts
(2017 - 2019)
• PERSEO ASI – Personal Radiation Shielding for Interplanetary missions (2016-2019)
• ANNETTE – Advanced Networking for Nuclear Education and Training and Transfer of Expertise
(2016 – 2018)
• CONCERT – European Concerted Programme on Radiation Protection Research (2015 – 2019)
• OPERRA-SOPRANO – Systems Oriented Prediction of Radiation Risk (2014 – 2016) –
• DoReMi-TREND – TRacking damage at ions’ track ENDs (2014 – 2015) –
• OPERRA – Open Project for the European Radiation Research Area (2013 – 2017)
• EUTEMPE-RX – EUropean Training and Education for Medical Physics Experts in Radiology
(2013 – 2016)
• ESA ARIADNE – Innovative Radiation Shielding approaches (2014-2015)
• ANDANTE – Multidisciplinary evaluation of the cancer risk from neutrons relative to photons using
stem cells and the induction of second malignant neoplasms following paediatric radiation therapy,
coordinated by UniPv (2012 – 2015)
• DoReMi-INITIUM – Track structures and initial events: an integrated approach to assess the issue
of radiation quality dependence
• EpiRadBio – Combining epidemiology and radiobiology to assess cancer risks in the breast, lung,
thyroid and digestive tract after exposures to ionizing radiation with total doses in the order of 100
mSv or below (2011 – 2015)
• DoReMi – Low Dose Research towards Multidisciplinary Integration (2010 – 2015)
• MERIDIAN (INFN) Measuring the Effects of Radiation on Immunity and DIfferentiAtioN (2014-
2015)
...
In
collaborazioni
con
Università,
Istituti
di
ricerca
e
realtà
ospedaliere nazionali
e
nonQual è la strumentazione a disposizione… RadBioPhys LAB @ Dipartimento di Fisica, UniPv
Come
si
impara
a
usarla…
Oltre al training in lab, può servire guardare qualche video….
https://www.jove.com/
Video
coming soon…!
RadBioPhys LAB
@
Dipartimento
di
Fisica,
UniPvPer
tirare
le
somme…
Vi
abbiamo
mostrato
la
grande
varietà
di
modelli
radiobiologici
per
lo
studio
di
specifici
effetti
delle
radiazioni
ionizzanti
sulla
materia
vivente
Ciascun
modello
presenta
vantaggi
e
svantaggi
(ad
es.
in
termine
di
dettaglio
e
corrispondenza
con
il
sistema
reale),
ma
l’importante
è
che
il
modello
risponda
alla
domanda
iniziale
dello
studio
dei
meccanismi
o
alle
esigenze
della
applicazione!
C’è
ampio
spazio
per
ricerche
con
attività
di
tipo
teorico e
sperimentale !
Per
ulteriori
informazioni,
occasioni
di
tesi
nel
nostro
gruppo
e/o
in
collaborazione
con
gruppi
di
ricerca
all’estero:
http://radbiophys.unipv.eu/Puoi anche leggere
