CROMATOGRAFIA E SPETTROMETRIA DI MASSA - Prof. Manuel Sergi
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CROMATOGRAFIA E SPETTROMETRIA DI MASSA Prof. Manuel Sergi msergi@unite.it 1 29 April 2022
TECNICHE CROMATOGRAFICHE 29 April 2022 2
TECNICHE CROMATOGRAFICHE 29 April 2022 3
CROMATOGRAFIA Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo. 29 April 2022 4
Cromatografia GASSOSA (GC) Cromatografia LIQUIDA (LC) • Fase stazionaria: Film di fase inerte depositato in una colonna GC • Fase stazionaria: silice o silice funzionalizzata • Fase mobile: un gas che fluisce attraverso la • Fase mobile: Solvente (o miscele di solventi) fase stazionaria e rappresenta la fase mobile (carrier gas). 29 April 2022 5
GC HPLC 29 April 2022 6
COLONNE CAPILLARI PER GC
COLONNE IMPACCATE PER HPLC
Schema di un GC 29 April 2022 9
29 April 2022 10
Schema di un GC-MS 29 April 2022 11
29 April 2022 12
Cromatografia Liquida 29 April 2022 13
INIEZIONE DEL CAMPIONE Valvola a 6 vie: 2 posizioni Pull to Fill Autosampler - www.CHROMacademy.com - YouTube 29 April 2022 14
Asdorption Chromatograpy Partition Chromatograpy The sylanolic groups are derivatized Competition between solvent and modifyng the surface properties for solutes for the active sites on the specific applications R' R' stationary phase Si OH + Cl Si R Si O Si R + HCl R' R' 29 April 2022 15
REVERSED PHASE CHROMATOGRAPHY CH3 Si O Si CH3 CH3 End-capping 29 April 2022 16
29 April 2022 17
EFFICIENZA della SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA H: altezza Equivalente di un Piatto Teorico (HEPT) H= L/N= L/16 (W / t Ri ) Equazione di van Deemter: H= A+B/u+Cu A= diffusione vorticosa (è inutile per GC). B= diffusione longitudinale C= trasferimento di massa (cinetica di adsorbimento/desorbimento) 29 April 2022 18
HIGH EFFICIENCY HPLC New particles feature a high-capacity, porous silica layer fused to a solid silica core Shorter diffusion path for Fused-Core improves mass transfer and minimizes peak broadening, resulting in efficiency similar to a sub-2 μm particle with the pressure drop of a 3 μm particle. 29 April 2022 19
UHPLC Colonne contenenti una fase stazionaria con diametro delle particelle molto minore oltre a pompe e parti meccaniche in grado di operare a pressioni di esercizio ancora più elevate. La tecnica UHPLC permette di ottenere una separazione delle sostanze eluite caratterizzata da una maggiore efficienza e in tempi notevolmente ridotti, utilizzando come fase stazionaria particelle dal diametro solitamente inferiore a 2 μm e pressioni che possono superare i 1000 bar. 29 April 2022 20
UHPLC: PARTICLE SIZE 29 April 2022 21
Particle diameter vs HETP 29 April 2022 22
29 April 2022 23
CROMATOGRAMMA 29 April 2022 24
CROMATOGRAMMA HPLC (o GC)-MS 29 April 2022 25
Cromatografia e Spettrometria di Massa La spettrometria di massa è una tecnica analitica basata sulla ionizzazione di atomi e/o molecole e la successiva rivelazione dei generati ioni gassosi in base al rapporto massa/carica (m/z). 2. Desorption: (Non richiedono volatilizzazione: fase condensata) • Field Desorption (FD) 3. Fase condensata a pressione 1. Gas Phase: • Fast Atom Bombardment (FAB) ambiente • Electron ionization (EI) • Secondary Ion Mass Spectrometry (SIMS) • DESI • Chemical ionization (CI) • Laser Desorption (LD) → MALDI • DART • Field Ionization (FI) • Plasma Desorption (PD) • DAPCI • Thermal Desorption (Thermospray) • DAPPI • Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) and • Derivati DESI photoionization (APPI) • Electrospray ionization (ESI) 29 April 2022 26
Cromatografia e Spettrometria di Massa Consente di misurare le masse molecolari (nominali o esatte) e di ottenere dei profili di frammentazione che sono specifici per ciascun composto quindi permette di effettuare il riconoscimento di una sostanza nota, di individuare la formula di struttura di composti incogniti, di ottenere informazioni strutturali. MS Analizzatore Simbolo Principio di separazione Consente di misurare le masse molecolari (nominali o esatte) Electric sector E or ESA Kinetic energy Magnetic sector B Momentum Massa Tandem MS/MS Quadrupole Q m/z (trajectory stability) Si possono effettuare esperimenti Ion trap IT m/z (resonance frequency) di MS/MS sfruttando in serie due spettrometri di massa tra i quali si Time-of-flight TOF Velocity (flight time) inserisce una cella di collisione Fourier transform ion cyclotron resonance FTICR m/z (resonance frequency) FRAMMENTI = TRANSIZIONI IONE Fourier transform orbitrap FT m/z (resonance frequency) PRECURSORE / IONE MOLECOLARE 29 April 2022 27
Gas chromatography-mass spectrometry - GC-MS Q IT Modalità di acquisizione: TOF Full scan (FS) Selected Ion Monitoring (SIM) Ampio range m/z Range di m/z ristretto (o singolo) Scansione lunga Scansione breve Bassa sensibilità Alta sensibilità Identificazione: ✓ Tempo di ritenzione ✓ Spettro di massa • Picco BASE • Frammenti • Rapporto tra i frammenti Standard Banca Dati 29 April 2022 28
GC-MS - Applicazioni m/z = 392 Sample Spectrum m/z = 336 Sample Spectrum Library Spectrum Library Spectrum 29 April 2022 29
Liquid chromatography-(tandem) mass spectrometry - LC-MS(/MS) Identificazione: ✓ Tempo di ritenzione ✓ Spettro di massa • Transizione ione precursore/ione frammento • Rapporto tra le transizioni più intense MS MS/MS MSn Targeted, Semi-Targeted 29 April 2022 30
SISTEMI DI INTERFACCIAMENTO ESI: Electrospray APCI: ionizzazione chimica a P atm APPI: fotoionizzazione EI: impatto elettronico 29 April 2022 31
ESI APCI 29 April 2022 32
QUADRUPOLO 29 April 2022 33
a) Filtro passa-alto b) Filtro passa-basso c) Banda passante 29 April 2022 34
Modalità di acquisizione MS/MS triple quadrupole triple quadrupole Q trap Linear Ion Trap (LIT) ✓ Full Range ❖ All triple quadrupole’s acquisitions mode ✓ Multiple Ion ✓ Enhanced MS (EMS) ✓ Single reaction monitoring (SRM) ✓ Enhanced Resolution (ER) ✓ Multiple reaction monitoring (MRM) ✓ Enhanced Product Ion (EPI) ✓ Precursor Ion Scan ✓ Enhanced Multi-Charge (EMC) ✓ Product Ion Scan ✓ MS/MS/MS (MS3) ✓ Neutral Loss (NL) ✓ Time Delayed Frag (TDF) ✓ Scheduled MRM™ algorithm 29 April 2022 35
HPLC-MS(/MS) - Applicazioni 29 April 2022 36
Tandem MS → SRM 29 April 2022 37
F1: 188. 14333 F1: 84.08144 F2: 105.07033 F1: 188. 14333 F2: 105.07033 F1: 84.08144 29 April 2022 38
ESEMPIO: IL CASO DELLE SOLFONAMMIDI [M+H-H2SO2] + [M+H-66] SO2 NH R + [M+H-93] O H2N S NH R + H O RNH3 + [M+H-155] N 92 m/z H2N SO2 H2N O 156 m/z 108 m/z
SPETTROMETRIA DI MASSA AD ALTA RISOLUZIONE (e accuratezza) • Standard analitici spesso non disponibili • Metaboliti sono spesso sconosciuti • Tecniche di screening immunometriche non efficaci • Basse concentrazioni LC-HRMS La spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) è uno strumento essenziale per lo screening e l’identificazione di nuove sostanze o per l’analisi di molecole ad alto peso molecolare 29 April 2022 41
Spettrometria di massa ad alta risoluzione ed accuratezza (HRAMS) Bassa Alta Risoluzione Risoluzione 300. 301, 300. 300. 1 1234 1 1241 Potere risolutivo (R) >10.000 (FWHM) Accuratezza di massa
RISOLUZIONE Il potere risolutivo di uno strumento consiste nella capacita’ di separare due picchi di massa Mn ed Mm. Si sceglie arbitrariamente e per convenzione di misurare il potere risolutivo di uno strumento su picchi separati tra loro da una valle alta il 10% dell’altezza dei picchi stessi.
In tali condizioni il potere risolutivo e’ dato da: Uno strumento si definisce “a bassa risoluzione” se separa masse unitarie fino a 2000 m/z (R= 2000/[2000-1999]=2000). Uno strumento ad alta risoluzione con R=20000 puo’ distinguere tra i picchi di C16H26O2 e C15H24NO2.
Bassa risoluzione vs alta risoluzione
Analizzatori di massa ad alta risoluzione TOF Orbitrap FT-ICR Settore magnetico R up to R=20.000 R=30.000 R
Time of flight (TOF) 29 April 2022 47
TOF + Reflectron La separazione si basa sul diverso tempo di volo di ioni con diverso rapporto m/z. ▪ Estrazione ritardata: compensazione velocità iniziale Incremento di ▪ Reflectron: incremento della distanza di volo e riduzione risoluzione e della distribuzione di energia cinetica accuratezza di massa ▪ Accelerazione ortogonale: interfaccia ESI 29 April 2022 48
ORBITRAP La tecnica si basa sulla misurazione delle frequenze di oscillazione degli ioni. Attraverso la trasformata di Fourier il segnale nel dominio del r tempo viene convertito in uno spettro di m/z z U (r , z ) = k 2 2 z − r 2 / 2 + Rm2 ln(r / Rm ) = φ / • Gli ioni sono intrappolati in un campo elettrostatico; l’elettrodo centrale è mantenuto ad alto potenziale mentre su una parte di quello esterno viene applicato un potenziale pulsato. L’altra parte dell’elettrodo esterno è utilizzata per misurare l’immagine indotta dagli ioni che oscillano all’interno della trappola. • La frequenza degli ioni è proporzionale a m/z 29 April 2022 49
TOF vs ORBITRAP TOF ORBITRAP Potere risolutivo ✓ Accuratezza di massa ✓ Velocità di scansione ✓ Limite superiore m/z ✓ Sensibilità ✓ ✓ Switch polarità ✓ • TOF permette di registrare più di 50 scansioni al secondo ; ottimale per accoppiamento con UHPLC. • Orbitrap offre una risoluzione notevolmente maggiore. Possibilità di switching ma potere risolutivo scende • TOF in principio non ha limiti superiori di m/z; Orbitrap ottimale per ioni con m/z < 5000. 29 April 2022 50
MS/MS • Spettrometria di massa tandem QTOF, Q-exactive, LTQ-Orbitrap 29 April 2022 51
HRMS ed identificazione H = 1.0078 O = 15.9949 C = 12.0000 N = 14.0031 S = 31.9721 Massa Risoluzione Possibili Massa misurata [Da] strutture calcolata 32.0 0.2 O2 31.9898 CH3OH 32.0261 N2H4 32.0374 S 31.9721 32.02 0.02 CH3OH 32.0261 N2H4 32.0374 32.0257 0.002 CH3OH 32.0261 29 April 2022 52
HRMS e selettività 230,1172 Q1 Q3 Sebutilazina 230 174 104 Nepellitorin 230 174 230,1532 a 104 Sebutilazina (C9H16ClN5) e neopellitorina (C15H19NO) [1] Schürmann, A., Dvorak, V., Crüzer, C., Butcher, P., Kaufmann, A., Rapid Commun. Mass Spectrom. 23(8), 1196–1200 (2009) 29 April 2022 53
HRMS e sensibilità TIC 100mDa 10mDa 2mDa 29 April 2022 54
Acquisizione full scan ✓ Misura della massa accurata FORMULA BRUTA e ✓ Pattern isotopico grado di insaturazione (DBE) ✓ Tempo di ritenzione 29 April 2022 55
Modalità di acquisizione MS/MS ✓ Spettro MS/MS IPOTESI STRUTTURALE Conferma NMR 29 April 2022 56
Workflow di analisi LC-HRMS/MS Analisi target Suspect Non-target con standard screening screening di riferimento no standard no standard Lista di ioni target di riferimento Lista di ioni di riferimento sospetti Estrazione delle Corrispondenza Corrispondenza della masse esatte tramite della massa esatta massa esatta con software con standard quella nota Strumenti Predizione delle informatici Corrispondenza del formule brute pattern isotopico con quello teorico Ricerca in database Corrispondenza del Corrispondenza del Tr Valutazione Tr per Tr con standard con quello predetto per conferma i sospetti Corrispondenza Corrispondenza dello Corrispondenza dello dello spettro MS/MS spettro MS/MS con quello Interpretazione dello spettro MS/MS con presente nel database spettro MS/MS con standard quello dei sospetti [2] Pasin D., Cawley, A., Bidny, S., Fu, S., Anal Bioanal Chem. 409, 5821-5836 (2017) 29 April 2022 57
ANALYTICAL PROCEDURE Sample collection HPLC-MS/MS and Analysis pretreatment (ISs) with API 2000 Perkin-Elmer ESI+,Turboionspray, MRM (Multi reaction monitoring) µ-SPE clean-up 29 April 2022 58
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