Antibiogramma e nuovi criteri interpretativi EUCAST Lettura interpretativa dell'Antibiogramma: Esercitazioni - Paolina Cavalcanti - Laboratorio di ...
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Antibiogramma e nuovi criteri
interpretativi EUCAST
Lettura interpretativa
dell’Antibiogramma: Esercitazioni
Paolina Cavalcanti
Il ruolo del laboratorio di Microbiologia DIAGNOSI MICROBIOLOGICA identificazione agente eziologico e ATB tempestività dei risultati PROGRAMMI DI CONTROLLO DELLE INFEZIONI epidemiologia locale sorveglianza: “alert organisms”
ANTIBIOGRAMMA
ANTIBIOGRAMMA
L'antibiogramma è un test “in vitro” che si esegue
esponendo una concentrazione standard
dell’agente etiologico in esame ad una serie di
concentrazioni scalari e definite di farmaci
impostazione di un’antibioticoterapia
mirata
Antibiogramma: Metodi
APPROCCI FENOTIPICI
basati su attività antimicrobica e breakpoint
• Determinazione della MIC (brodo, agar, Etest, MICE)
• Altre determinazioni quantitative (MBC, MPC)
• Diffusione da dischetto (EUCAST, CLSI, BSAC, CA-SFM, ...)
• Sistemi automatici (Vitek, Phoenix, MicroScan, Wider, ...)
APPROCCI GENOTIPICI
basati sulla ricerca di un gene di resistenza o di un suo prodotto
• mecA
• blaZ
• vanA
• vanB,
• PBP2a
• β-lattamasi
APPROCCI DEDUTTIVI
lettura interpretativa (expert rules)
• Se mecA-positivo, riportare come resistente ai β-lattamici (Stafilococchi)
• Se ESBL- positivo, riportare come resistente ai β-lattamici (Enterobacteriaceae)
• Se eritromicino resistente, riportare come resistente anche a claritromicina e azitromicina ( Streptococchi)
CAMPIONE BIOLOGICO SEMINA IDENTIFICAZIONE MACROSCOPICA PRESUNTIVA DELL’ AGENTE ETIOLOGICO E SUO ISOLAMENTO
Esame della purezza delle colonie Luce Riflessa Luce trasmessa
TEST DI DISCO DIFFUSIONE SU AGAR Seleziona le colonie Prepara l’inoculo
Vortex Standardizza l’inoculo
Striscia sulla piastra Immergi il tampone
Incuba overnight Addiziona i dischi antibiotati
Misura gli aloni Luce trasmessa Luce riflessa
Modifica del terreno – germi fastidious
CONCENTRAZIONE MINIMA INIBENTE (MIC)
La più bassa concentrazione di antibiotico capace di inibire la crescita
microbica dopo 18-24 h
diluizione in brodo
0.012 0.5 1 2 4 8 16 32 64 g/mlMicrodiluizione
Prepara l’inoculoStandardizza l’inoculo e mescola
Disponi la sospensione nel supporto e inocula
Incuba overnight
Lettura MICs
Lettura MICs
MIC su striscie blottate (gradiente di concentrazione)
Sistemi automatici vitek2 phoenix
MIC
Il cardine di tutti i saggi di sensibilità
Endpoint
Valore determinato in laboratorio
Valore assoluto riferito a quel particolare microrganismo
Standardizzazione : adempimenti tecnici e procedurali
Alla base della determinazione dei breakpointBreakpoint Valori prestabiliti, stabiliti cioè da appositi comitati nazionali o sovranazionali Valori soglia di riferimento che danno un significato all’endpoint Standardizzazione : criteri interpretativi
EUCAST
EUCAST: basi per la determinazione dei breakpoint
Il processo che porta a fissare i breakpoint è un
compromesso
tra aspetti clinici, epidemiologici e metodologiciEUCAST breakpoint clinici e cut-off epidemiologici EUCAST riconosce e distingue due tipi di breakpoint: breakpoint clinici Per prevedere un esito migliore (sensibile) o peggiore (resistente) del trattamento di una data infezione con un dato antibiotico. Usati nell’attività quotidiana del laboratorio di microbiologia clinica per fornire informazioni utili ai fini della terapia. cut-off epidemiologici per riconoscere precocemente lo sviluppo di una resistenza. Devono essere usati come la misura più sensibile dello sviluppo di una resistenza. Epidemiologic cut-off = ECOFF
EUCAST : categorie in base ai breakpoint clinici
Sensibile (S)
Il livello di attività dell’antibiotico nei confronti del microrganismo
è associato ad un’elevata probabilità di successo terapeutico
Intermedio (I)
Il livello di attività dell’antibiotico nei confronti del microrganismo è
associato ad un effetto terapeutico incerto
Non è escluso che l’infezione possa essere trattata
appropriatamente in distretti corporei in cui il farmaco è
attivamente concentrato o utilizzando alti dosaggi
La categoria intermedia rappresenta anche una zona cuscinetto che
potrebbe evitare che modesti ma difficilmente controllabili fattori
tecnici possano causare importanti discrepanze interpretative
Resistente (R)
Il livello di attività dell’antibiotico nei confronti del microrganismo
è associato ad un’elevata probabilità di fallimento terapeuticoEUCAST : categorie in base ai cut-off epidemiologici Wild-type (WT) Un microrganismo che non ha acquisito meccanismi di resistenza all’antibiotico in questione. Un microrganismo wild-type può rispondere clinicamente oppure no al trattamento con quell’antibiotico Non-wild-type (NWT) (Resistenza microbiologica) Un microrganismo che ha acquisito meccanismi di resistenza all’antibiotico in questione. Un microrganismo non-wild-type può rispondere clinicamente oppure no al trattamento con quell’antibiotico.
EUCAST : 2 breakpoint clinici, 1 cut-off epidemiologico
breakpoint clinici (sistema SIR):
Breakpoint della sensibilità
divide i ceppi sensibili (S) da quelli intermedi (I)
Breakpoint della resistenza
divide i ceppi intermedi (I) da quelli resistenti (R)
cut-off epidemiologico:
divide i ceppi wild-type (WT) da quelli non-wild-type (NWT)Cut-off epidemiologici e breakpoint clinici,
sensibilità e resistenza
Numero
di isolati
Cut-off Breakpoint
epidemiologico clinici
S R
WT NWT
MIC
S I R
Concentrazioni di antibiotico
raggiungibili nei tessutiREGOLA BASE IN CHEMIOTERAPIA
CONCENTRAZIONE PLASMATICA
> MIC = MIC < MIC
Successo quasi certo Risultato incerto Probabile fallimentoCOFATTORI DI EFFICACIA DI
UNA TERAPIA ANTIBATTERICA
MICROBIOLOGICI
Sensibilita’
Intermedio FARMACOLOGICI
Resistenza Adeguati
Probabilmente adeguati
Inadeguati
IMMUNOCOMPETENZA
Normale
Parzialmente compromessa
CompromessaIl “puzzle” della (appropriata) terapia antibiotica
Pea & Viale Clin Infect Dis 2006; 42: 1764-71.Un poster della seconda guerra mondiale
Classificazione degli antibiotici sulla base della solubilità e
delle proprietà farmacocinetiche / farmacodinamiche
Antibiotici idrofili Antibiotici lipofili
Macrolidi
Fluorochinoloni
Beta lattamici Tetracicline
Glicopeptidi Caf
Aminoglicosidi Rifampicina
Linezolid
Limitato volume di distribuzione Largo volume di distribuzione
Incapacità a diffondere passivamente attraverso Diffondono liberamente attraverso
la membrana cellulare delle cellule eucariotiche la membrana cellulare delle cellule eucariotiche
Inattivi sui patogeni intracellulari Attivi sui patogeni intracellulari
Eliminazione renale come farmaco non modificato Spesso eliminati mediante metabolismo epatico
mod. Pea & Viale Clin Infect Dis 2006; 42: 1764-71.Attività degli antibiotici
Tempo dipendenti Concentrazione-dipendenti
Correlazione PK/PD
AUC / MIC
T > MIC
Cmax / MIC
Mazzei T., 2004T>MIC – Il tempo durante il AUC/MIC – Progressivo quale le concentrazioni incremento di attività plasmatiche si mantengono antibatterica all’aumentare al di sopra della MIC del della concentrazione patogeno dell’antibiotico
POSOLOGIA ANTIMICROBICI
EFFETTO EFFETTO
TEMPO - DIPENDENTE CONCENTRAZIONE - DIPENDENTE
(es. beta LATTAMICI) (es. AMINOGLICOSIDI)
SOMMINISTRAZIONE CONTINUA ALTE DOSI
O A BREVI INTERVALLI A LUNGHI INTERVALLIPenetration of different β-lactam antibiotics into
Epithelial lining fluid (ELF)
Protein Penetration
Agent Reference
binding (%) (%)
Cefepime 30 20 104
Ceftazidime 31 20 20
Ertapenem 32 90 30
Ceftobiprole 33 18 15–26
Piperacillin 36 20 ∼57
Tazobactam 36 25 ∼91
2013 British Society for Antimicrobial ChemotherapyARBITRARY INTERPRETIVE CRITERIA
FOR ANTIBIOTIC COMBINATIONS
Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC Index)
FIC Index= MICAB/MICA + MICBA/ MICB
FIC Index Interpretation
≤ 0.5 Synergy
> 0.5 and ≤ 1.0 Additative
> 1 and ≤ 4.0 Indifference
> 4.0 Antagonism
Pseudomonas aeruginosa
FIC Index = 0.28
Amikacina R
128 µg/ml
Cefepime R
16 µg/ml
Amikacina +
Cefepime 4µg/mlSVILUPPO DELLA RESISTENZA La pressione selettiva
DEVELOPMENT OF RESISTANCE:
Food
Food is also a source of infection that could affect the development of resistance.
- More meals are prepared outside the home.
- Contamination goes unnoticed until infection has
started.
Outbreaks of Escherichia coli O157 in spinach and
lettuce in the US.
- As the number of foodborne infections increases,
so does the use of antibiotics.USO APPROPRIATO DI ANTIBIOTICI
NELLA PRODUZIONE DEL CIBO PER
ANIMALI
Antibiotic resistance can pass from animals
to humans (CDC 2006)
Antibiotic resistance is increasing in human
and veterinary medicineAntibiotic Resistance
A Global Problem
PRP VRE VISA
MRSA
ESBL MBL VRSA
1961 1967 1983 1986 1988 1996 2002
All β-lactams Vancomycin Vancomycin
and teicoplanin
Penicillin 3rd gen. Carbapenem Vancomycin
Cephalosporin and TeicoplaninGram-negativi Evoluzione dell’antibioticoresistenza
Enterobacteriaceae ESBL
caratteristiche
Amoxicillina alto grado di Resistenza Cefotaxime Ridotta Sensibilità
Ampicillina Ceftriaxone
Piperacillina Ceftazidime
Azlocillina Cefepime
Ticarcillina Aztreonam
Cefalotina (Cefalosporine I-II gen.)
Clavulanato CEFAMICINE: Cefoxitina, Cefotetan e
Sulbactam Moxalactam
Sensibilità
Tazobactam inibiscono le ESBL CARBAPENEMI: Imipenem, Meropenem
Sensibilità
Non sono idrolizzati da ESBLΒ lattamasi classificazione
CARBAPENEMASI (CPE)
resistenza
Penicilline
Cefalosporine
Inibitori β lattamasi
CarbapenemiIl 2010: il problema “emergente” si complica
Klebsiella pneumoniae NDM-I
(New Dehli Metallo B-lattamasi tipo I)
Enzima capace di trasferirsi con estrema facilità ad diversi generi di microorganismi
l plasmide NDM-I è stato isolato in E.coli e K.pneumoniae in USA, Canada, Europa,
India e Pakistan
Efficaci solo Colistina e Tigeciclina
Lancet Infect Dis. 2009 Apr;9(4):228-36.
The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing bacteria.
Nordmann P, Cuzon G, Naas T.
J Infect Dev Ctries. 2012 May 14;6(5):457-61.
Detection of carbapenem-resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
producing NDM-1 in Lebanon.
El-Herte RI, Araj GF, Matar GM, Baroud M, Kanafani ZA, Kanj SS.Gram-positivi Evoluzione dell’antibioticoresistenza
Cocchi Gram-positivi
Evoluzione dell’antibioticoresistenza
Penicillina Meticillina
[1940s] S. aureus [1960s] S. aureus (MRSA)
S. aureus
penicillino-resistente meticillino-resistente
Vancomicina
[1960s]
S. aureus (VRSA)
resistente
alla vancomicina S. aureus (VISA/GISA)
Enterococco (VRE)
intermedio o resistente
resistente
a vancomicina/glicopeptidi
alla vancomicina
2002 1997 1986
CDC, Prevent Antimicrobial Resistance, Aprile 2002Come si identificano?
K.pneumoniae, E.coli, P.mirabilis, K.oxytoca ESBL +
Test di screening e di conferma ai fini epidemiologici per la valutazione della presenza di ESBL
K.pneumoniae, E.coli, P.mirabilis, K.oxitoca
Ceftazidime MIC no
e/o ESBL -
≥ 2mg/L
Cefotaxime
si
Screening positivo
per la produzione di
ESBL
test di confermaProduzione di Carbapenemasi nelle Enterobacteriaceae
Test di screening e di conferma ai fini epidemiologici della presenza di
carbapenemasi
AMCLI, Marzo 2012
Indicazioni per la conferma fenotipica della produzione di carbapenemasi
nelle Enterobacteriaceae
Screening positivo
Meropenem ≥ 0.5 mg/L o diametro alone di inibizione ≤ 25 mm
test di confermatest di conferma
Test di sinergia con EDTA
Test di sinergia con Ac Boronico
EDTA –
Ac.BOR +
K.pneumoniae MBL+ K. pneumoniae KPC+
Test di Hodge
E.coli ATCC 25922
Alone di
inibizione
Alone di inibizione
modificato evidenzia solo la
presenza di attivita’ carbapenemasica
(es. OXA-48)Staphyococcus aureus hVISA e VISA
VSSA
VISA
hVISA VSSA
VSSA VISA
Esempi di cambiamento nella morfologia delle colonie che si ha nei ceppi
hVISA , VISA , VSSANota A: • breakpoint per vancomicina è stato portato a 2 mg/L • il test di diffusione da disco non è raccomandato
Cosa si nasconde dietro una MIC
compresa tra 1 e 2 mg/L?
hVISA
Etest vancomicinaAntibiogramma: Metodi
APPROCCI FENOTIPICI
basati su attività antimicrobica e breakpoint
• Determinazione della MIC (brodo, agar, Etest, MICE)
• Altre determinazioni quantitative (MBC, MPC)
• Diffusione da dischetto (EUCAST, CLSI, BSAC, CA-SFM, ...)
• Sistemi automatici (Vitek, Phoenix, MicroScan, Wider, ...)
APPROCCI GENOTIPICI
basati sulla ricerca di un gene di resistenza o di un suo prodotto
• mecA
• blaZ
• vanA
• vanB,
• PBP2a
• β-lattamasi
APPROCCI DEDUTTIVI
lettura interpretativa (expert rules)
• Se mecA-positivo, riportare come resistente ai β-lattamici (Stafilococchi)
• Se ESBL- positivo, riportare come resistente ai β-lattamici (Enterobacteriaceae)
• Se eritromicino resistente, riportare come resistente anche a claritromicina e azitromicina ( Streptococchi)EUCAST
Expert rules
Sono una raccolta di conoscenze di esperti su:
resistenze intrinseche
fenotipi eccezionali di resistenza
regole interpretative
che possono essere applicate ai tests antimicrobici per ridurre gli errori
e seguire appropriate raccomandazioni per refertare particolari tipi di
resistenza.Resistenza intrinseca è una resistenza connaturata, non acquisita, di tutti o quasi tutti i rappresentanti della specie
Resistenza intrinseca
Numero
di isolati
Specie intrinsecamente resistenti
(tutti i ceppi della specie sono
resistenti agll’antibiotico)
MIC
Concentrazioni di antibiotico
raggiungibili nei tessutiEnterobacteriaceae: resistenza intrinseca
Resistenze intrinseche nei batteri Gram-positivi Nota bene: i batteri Gram-positivi sono intrinsecamente resistenti ad aztreonam, temocillina, polimixina B/colistina ed acido nalidixico Gli stafilococchi sono intrinsecamente resistenti al ceftazidime
Fenotipi eccezionali di resistenza Potrebbero indicare un errore nella identificazione o nella esecuzione dei test di chemiosensibilità. Se entrambi sono confermati, bisognerebbe inviare l’isolato ad un laboratorio di riferimento. Tali fenotipi di resistenza possono cambiare con il tempo e variano in relazione a differenze geografiche
Fenotipi eccezionali di resistenza
REGOLE INTERPRETATIVE Sulla base della resistenza ad un particolare antibiotico e alla identificazione di un isolato è possibile dedurre un meccanismo di resistenza e predire la resistenza ad un altro antibiotico. L’evidenza e il significato clinico di queste regole hanno gradi diversi: A. Esistono evidenze cliniche che correlano la interpretazione di sensibilità al fallimento clinico. B. Evidenza debole e basata su pochi casi o su modelli sperimentali. C. Evidenza clinica inesistente, ma i dati microbiologici suggeriscono che l’uso clinico del farmaco deve essere sconsigliato.
REGOLE INTERPRETATIVE
EUCAST rule 13.6 (Salmonella spp.)
IF ciprofloxacin MIC is >0.06 mg/L,
THEN
report as resistant to all fluoroquinolones
Evidence for clinical failure of fluoroquinolones in cases of resistance
caused by the acquisition of at least one target mutation in gyrA
Evidence for this rule is A only for S.Typhi (B for other salmonella)REGOLE INTERPRETATIVE
EUCAST rule 11.3 (Streptococcus spp.)
IF resistant to erythromycin but susceptible to clindamycin,
THEN
Test for inducible MLSB resistance.
If positive, report as susceptible to clindamycin with a warning that
resistance may develop during treatment
Evidence for this rule is CConoscendo l’agente etiologico
Dalla valutazione
delle resistenze intrinseche, dei fenotipi eccezionali e
con l’ausilio delle regole interpretative
è possibile
intraprendere una terapia antibiotica razionaleAZIENDA OSPEDALIERA DI COSENZA
U.O.C. di Microbiologia e Virologia Clinica e Molecolare
Direttore Dr. Cristina Giraldi
Paziente XXXXXXXXXXX data di nascita XXXXXXXXX
Richiesta n° XXXXXXXXXXX del XXXXXXXXXXXXXXXXXX
URINOCOLTURA Urine da mitto intermedio
Ricerca di: -1- Escherichia coli 100.000 UFC /mL
germi non esigenti
Antibiogramma RSI MIC Break Point MIC (SENS)
ESBL -
AMPICILLINA R >32 8
AMOXIC/AC. CLAV S 8 8
PIPERACILLINA R >64 8
CEFOTAXIME SConseguenze dell’antibiotico-resistenza
Gli antibiotici sono essenziali per la medicina moderna …
Chirurgia
Trapianti d’organo
Chemioterapia oncologica
Terapia intensiva
Cura dei neonati pretermine
Fonte: Prof. Otto Cars, Director of Strama (The Swedish Strategic Programme Against Antibiotic Resistance)
82grazie Grazie
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