Preparazione, realizzazione, pubblicazione dei risultati di studi in vivo: linee guida internazionali
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UNIVERSITA’ DI TRIESTE
“FORMAZIONE E TRAINING DEL PERSONALE COINVOLTO NELLE
ATTIVITA’ DI SPERIMENTAZIONE ANIMALE”
Maggio 2020
Preparazione, realizzazione,
pubblicazione dei risultati di
studi in vivo: linee guida
internazionali
Monica Forni
Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie
Alma Mater Studiorum –Università di Bologna
Layout della lezione L’importanza della pubblicazione dei risultati ottenuti mediante l’impiego degli animali sperimentali le motivazioni scientifiche: la crisi della riproducibilità le motivazioni etiche e economiche La possibile risposta: le linee guida ARRIVE 2010 NC3Rs PREPARE 2018 NORECOPA
Qualità della ricerca
Come è cambiata la ricerca
Qualità della ricerca
Sofisticati approcci tecnologici
Finanziamenti erogati in contesti di interesse ben identificati
Competenze specifiche nei diversi campi di indagine
Accesso a risorse tecnologiche sempre più complesse e costose
Necessità di reti di collaborazione
Necessità di pubblicare
L’evoluzione della figura del ricercatore
Qualità della ricerca
DA
“appassionato studioso solitario” il cui approccio scientifico era lavorare da
solo impegnandosi a provare o confutare una teoria (anche in una vita
intera)
A
“manager di un gruppo di persone” che richiede competenze su:
• Gestione della proposta progettuale
• Definizione e gestione di risorse: umane, economiche, materiali e
infrastrutturali.
• Gestione dello sviluppo del progetto
• Gestione della documentazione
Abbiamo un problema scientifico
2016
1.026 approcci terapeutici in modelli sperimentali di infarto
Systematic review CAMARADES
Abbiamo un problema economico Freedman et al., PlosBiol, 2015
In Italia abbiamo anche un problema culturale…..
Direttiva 2010/63/UE
Animal Care era stato
tradotto con Amore per
gli animali
….che facilmente diventa politico
STOP VIVISECTION
ha raccolto 1.173.130
adesioni:
690.325 (59%) in Italia,
164.304 (14%) in Germania
il resto in altre 24 nazioni
europee.Riproducibilità
•L’ esperimento deve poter essere ripetuto
– Da noi o da altri
•Condizione ideale: solo lo sperimentatore dovrebbe
introdurre variazioni
– E registrarle!
•Tutto il resto deve essere mantenuto costante
IN AN IDEAL WORLDStandardizzazione degli esperimenti con gli animali
Variazioni tra esperimenti (apparentemente identici) – RUMORE DI FONDO
• Variazione intra esperimento (tra animali)
• Variazione inter esperimento (tra prove)
E’ un “apparecchiatura” vivente e come le altre
del laboratorio deve essere tarato e calibratoFonti di variabilità
Ceppo/lo'o inviato
Qualità genetica Sistema di allevamento
Qualità dell’allevatore/fornitore
Sesso
Stato biologico Età
Peso corporeo
Qualità dell’allevatore/fornitore
Stato di salute Livello di qualità costante
Barriere igieniche
Qualità del fornitore
Nutrizione Composizione costante (lotto)
Composizioni “fisse” vs “basso costo”
Qualità dell’acquaFonti di variabilità
Tipo
Stabulazione Lettiera
Numero di animali per gabbia
Locale Ventilazione
Temperatura
Umidità
Illuminazione
Rumore
Altri animali
Effetti secondari della Ammoniaca, anidride carbonica
stabulazione Composti aromatici
Arricchimento
Competenza
Personale Adeguatezza del numero
Effetto week-endFonti di variabilità
Mezzo di trasporto
Trasporto Gabbie di trasporto
Cibo durante il trasporto
Stesso giorno
Conduzione Stessa ora del giorno
dell’esperimento Evitare lo stress
Sequenza degli animali so'o procedura, in
parGcolare se stressante
Validità della tecnica
Livello di competenza
Quanto la misura è legata alla cara'erisGca
Disegno Come è stato affrontato il problema della variabilità
sperimentale Quanto è robusta la tecnica di campionamento
Quanto è preciso il sistema di misura
Come si stoccano i campioni
Come si valida una interpretazione soggeIvaFonti di variabilità
genotipo ambiente primario
dalla fecondazione alla maturità
fenotipo ambiente secondario
condizioni pre-esperimento
dramatipo ambiente terziario
trattamenti sperimentali
RISULTATI DELL’ESPERIMENTOLe linee guida possono aiutare a fronteggiare la variabilità ma la crisi della riproducibilità esiste nonostante le molte linee guida su come devono essere riportati gli studi prodotte negli ultimi 20 anni • Öbrink & Waller, 1996 • Jane Smith et al., 1997 • Öbrink & Rehbinder, Laboratory Animals 2000 • ARRIVE Guidelines, 2010 (Kilkenny et al., NC3Rs) • Gold Standard Publication Checklist, 2010 (SYRCLE) • Institute for Laboratory Animal Research, NRC, 2011 • Instructions to authors, in many journals e.g. Nature’s Reporting Checklist • ……. • PREPARE Guidelines, 2018 (Smith et al, NORECOPA)
…non c’è niente di nuovo….. basta conoscere la regola delle
3Rs……che ora è anche base per la Direttiva 2010/63/EU
Replacement
Reduction
Refinement
Russell, W.M.S. and Burch, R.L., (1959). The Principles of
Humane Experimental Technique, Methuen, London.Come sono state sviluppate le linee guida ARRIVE?
Le linee guida ARRIVE sono state proposte in seguito ad un ampio lavoro di revisione sistematica di
pubblicazioni scientifiche basate su animali sperimentali nel campo tossicologico (Kilkenny et al.,
2009).
3 aree principali in cui erano necessarie azioni di miglioramento
• Il DISEGNO SPERIMENTALE in quanto 88% dei lavori non riportavano la randomizzazione o il sistema
di blinding (86%) necessario alla riduzione del bias nella scelta degli animali e nella misurazione dei
risultati
• L’ANALISI STATISTICA in quanto solo il 70% dei lavori includeva una corretta analisi statistica
• Le modalità’ di PRESENTAZIONE DELLO STUDIO in quanto solamente il 59% includeva componenti
fondamentali del metodo scientifico quali: ipotesi, numero degli animali e loro caratteristicheSono poi state pubblicate nel 2010 Kilkenny C, et al. (2010) Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biol 8(6): e1000412.
ARRIVE guidelines Animal Research: Repor1ng of In Vivo Experiments
Da chi sono supportate le linee guida ARRIVE? Riviste, agenzie di finanziamento pubblico e privato e società scientifiche
Quali aspetti coprono le linee guida ARRIVE?
Quali strumenti sono disponibili sul sito NC3Rs?
Checklist
Che può essere usata mentre si prepara il manoscritto per essere sicuri di
includere tutti gli aspetti delle linee guida ARRIVE
Esempi
Esempi ben compilati per ogni punto della checklist derivanti da
pubblicazioni scientifiche
Webinar
Che più o meno vi dice quello che vi ho detto io…..
www.nc3rs.org.uk/ARRIVEIn cosa si trasforma tutto ciò?
Quali benefici sono derivati dall’applicazione delle linee guida ARRIVE?
2016
Reichlin TS, et al. (2016). PLoS ONE 11(12): e0165999.Le linee guida ARRIVE sono note a meno della metà dei partecipanti (43.7%); tra coloro che non hanno mai sentito parlare delle linee guida più della metà (51%) ha il suo ultimo lavoro pubblicato su una rivista che supporta le linee guida stesse Reichlin TS, et al. (2016). PLoS ONE 11(12): e0165999.
2018 Leung V, et al. (2018) PLoS ONE 13(5): e0197882.
Fig 1. Flow diagram of paper selec3on process.
Fig 2. Bar graph of papers fully reporting individual items from the ARRIVE checklist. Leung V, et al. (2018) PLoS ONE 13(5): e0197882.
Fig 3. Radar plot of ARRIVE checklist sub-items associated with bias reported in ARRIVE suppor3ng (SUPP)
and non-suppor3ng (nonSUPP) journals in 2015.
Leung V, et al. (2018) PLoS ONE 13(5): e0197882.Table 2. Overall reporting quality in journals supporting (SUPP) and not supporting (nonSUPP) the
ARRIVE guidelines for 2009 and 2015.
Leung V, et al. (2018) PLoS ONE 13(5): e0197882.Introducing ARRIVE 2019
• La priori1zzazione degli items di
ARRIVE
• La preparazione di un
documento di Spiegazione ed
Elaborazione
• La revision di alcuni items
specifici per assicurare
l’applicabilità delle linee guida a
studi in vivo sia di 1po
esplora1vo che confirmatorio.https://www.nc3rs.org.uk
Posizione di NORECOPA
Stiamo perdendo tempo a discutere sulla qualità della serratura della porta della stalla da
cui il cavallo è già fuggito?
BMJ 2018;360:k760 doi: 10.1136/bmj.k760 (Published 22 February 2018) Page 1 of 1
Letters
LETTERS
IMPROVING ANIMAL RESEARCH
Improving animal research: PREPARE before you
ARRIVE
1 2
Adrian J Smith secretary , R Eddie Clutton director , Elliot Lilley senior scientific officer , Kristine
4
E Aa Hansen assistant professor , Trond Brattelid research adviser
5
3
PREPARE before you ARRIVE
1
Norecopa, c/o Norwegian Veterinary Institute, PO Box 750, Sentrum, 0106 Oslo, Norway; 2Wellcome Trust Critical Care Laboratory for Large
Animals, Roslin Institute, Easter Bush EH25 9RG, UK; 3Research Animals Department, Science Group, RSPCA, Wilberforce Way, Southwater,
Horsham RH13 9RS, UK; 4Section of Experimental Biomedicine, Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine,
Norwegian University of Life Sciences, PO Box 8146 Dep, 0033 Oslo, Norway; 5Division for Research Management and External Funding, Western
Norway University of Applied Sciences, 5020 Bergen, Norway
Despite widespread journal endorsement of reporting guidelines, We hope that the debate on poor reproducibility will rotate
the poor reproducibility of preclinical research is increasingly towards planning of animal experiments. Otherwise, we are in
under debate.1-4 Ritskes-Hoitinga and Wever cite preregistration, danger of wasting time discussing the quality of the lock on the
systematic reviews, and better reporting as major tools for door of the stable, from which the horse has already bolted.
raising standards of animal research.5
An elephant in the room has been ignored for too long—better Competing interests: We have read and understood BMJ policy on
reporting does not improve the quality of an experiment that declaration of interests and declare the following interests: We are the
has already been performed. A good sales pitch may attract unpaid authors of the PREPARE guidelines. AS is the paid Secretary
more customers, but a product does not improve until its and employee of Norecopa. The other authors hold paid positions at
constituents and manufacturing conditions are upgraded. other institutions and promote PREPARE where appropriate when they
Systematic improvement of animal research must begin with lecture.
better planning. Full response at: http://www.bmj.com/content/360/bmj.j4935/rr-0.
With this in mind, we have constructed a set of planning
1 Enserink M. Sloppy reporting on animal studies proves hard to change. Science
guidelines called PREPARE,6 based on our experiences over 2017;357:1337-8.. 10.1126/science.357.6358.1337 28963232
the past 30 years in designing and supervising animal 2 Baker M. 1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature 2016;533:452-4..
10.1038/533452a 27225100
experiments. The guidelines contain, of course, many of the 3 Skibba R. Swiss survey highlights potential flaws in animal studies. Nature 2016,
elements in reporting guidelines like ARRIVE.7 But, 10.1038/nature.2016.21093.
4 Avey MT, Moher D, Sullivan KJ, etal. Canadian Critical Care Translational Biology Group.
importantly, PREPARE emphasises additional matters that can
The devil is in the details: incomplete reporting in preclinical animal research. PLoS One
have dramatic effects on the scientific validity of the research, 2016;11:e0166733. 10.1371/journal.pone.0166733 27855228
as well as on health and safety and animal welfare. 5 Ritskes-Hoitinga M, Wever K. Improving the conduct, reporting, and appraisal of animal
research. BMJ 2018;360:j4935. 10.1136/bmj.j4935 29321149
www.pixcove.com
PREPARE contains a checklist, which serves as a reminder of 6 Smith AJ, Clutton RE, Lilley E, Hansen KEA, Brattelid T. PREPARE: guidelines for planning
animal research and testing. Lab Anim 2017;23677217724823.28771074
items that should be tackled before the study, much in the same 7 Kilkenny C, Browne WJ, Cuthill IC, Emerson M, Altman DG. Improving bioscience research
way that pilots, however experienced, work their way through reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol
2010;8:e1000412.. 10.1371/journal.pbio.1000412 20613859
a checklist before take-off. We have constructed a website that
expands on the checklist, with links to more specific guidelines Published by the BMJ Publishing Group Limited. For permission to use (where not already
granted under a licence) please go to http://group.bmj.com/group/rights-licensing/
on each topic (https://norecopa.no/PREPARE). permissions
adrian.smith@norecopa.no
For personal use only: See rights and reprints http://www.bmj.com/permissions Subscribe: http://www.bmj.com/subscribeA cosa deve servire una checklist? • Ridurre il rischio di dimenticare di effettuare attività fondamentali • Assicurare che le verifiche vengano effettuate nella corretta sequenza • Incoraggiare la cooperazione e il controllo crociato tra i diversi partecipanti alle attività
…come fanno i piloti che usano le checklists,
anche sui voli di linea che fanno continuamente...
……e lo fanno prima di partire……...Così nascono le line guida PREPARE
sponsored by the UniversiGes FederaGon for Animal Welfare (UFAW), UK
Published in the April 2018 issue of Laboratory AnimalsTesto di due pagine, disponibile in 20 lingue ad oggi
PREPARE
The PREPARE Guidelines Checklist
Planning Research and Experimental Procedures on Animals: Recommendations for Excellence The ARRIVE Guidelines Checklist
Adrian J. Smitha, R. Eddie Cluttonb, Elliot Lilleyc, Kristine E. Aa. Hansend & Trond Brattelide
a
Norecopa, c/o Norwegian Veterinary Institute, P.O. Box 750 Sentrum, 0106 Oslo, Norway; Royal (Dick) School of Veterinary Studies, Easter Bush,
b
Animal Research: Reporting In Vivo Experiments
1 2 3 4 5
Midlothian, EH25 9RG, U.K.; cResearch Animals Department, Science Group, RSPCA, Wilberforce Way, Southwater, Horsham, West Sussex, RH13 9RS, U.K.; Carol Kilkenny , William J Browne , Innes C Cuthill , Michael Emerson and Douglas G Altman
1
d
Section of Experimental Biomedicine, Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research, London, UK, 2School of Veterinary
Sciences, P.O. Box 8146 Dep., 0033 Oslo, Norway; eDivision for Research Management and External Funding, Western Norway University of Applied Science, University of Bristol, Bristol, UK, 3School of Biological Sciences, University of Bristol, Bristol, UK, 4National Heart and Lung
Sciences, 5020 Bergen, Norway. Institute, Imperial College London, UK, 5Centre for Statistics in Medicine, University of Oxford, Oxford, UK.
PREPARE1 consists of planning guidelines which are complementary to reporting guidelines such as ARRIVE2. Section/
PREPARE covers the three broad areas which determine the quality of the preparation for animal studies: ITEM RECOMMENDATION Paragraph
1. Formulation of the study Title 1 Provide as accurate and concise a description of the content of the article
2. Dialogue between scientists and the animal facility as possible.
3. Quality control of the components in the study
Abstract 2 Provide an accurate summary of the background, research objectives,
The topics will not always be addressed in the order in which they are presented here, and some topics overlap. The PREPARE including details of the species or strain of animal used, key methods,
checklist can be adapted to meet special needs, such as field studies. PREPARE includes guidance on the management of animal principal findings and conclusions of the study.
facilities, since in-house experiments are dependent upon their quality. The full version of the guidelines is available on the Norecopa
website, with links to global resources, at https://norecopa.no/PREPARE. INTRODUCTION
The PREPARE guidelines are a dynamic set which will evolve as more species- and situation-specific guidelines are produced, Background 3 a. Include sufficient scientific background (including relevant references to
and as best practice within Laboratory Animal Science progresses. previous work) to understand the motivation and context for the study,
and explain the experimental approach and rationale.
Topic Recommendation b. Explain how and why the animal species and model being used can
address the scientific objectives and, where appropriate, the study’s
(A) Formulation of the study relevance to human biology.
Objectives 4 Clearly describe the primary and any secondary objectives of the study, or
1. Literature Form a clear hypothesis, with primary and secondary outcomes.
specific hypotheses being tested.
searches Consider the use of systematic reviews.
METHODS
Decide upon databases and information specialists to be consulted, and construct search terms.
Assess the relevance of the species to be used, its biology and suitability to answer the experimental Ethical statement 5 Indicate the nature of the ethical review permissions, relevant licences (e.g.
Animal [Scientific Procedures] Act 1986), and national or institutional
questions with the least suffering, and its welfare needs. guidelines for the care and use of animals, that cover the research.
Assess the reproducibility and translatability of the project.
Study design 6 For each experiment, give brief details of the study design including:
2. Legal issues Consider how the research is affected by relevant legislation for animal research and other areas, e.g. a. The number of experimental and control groups.
animal transport, occupational health and safety. b. Any steps taken to minimise the effects of subjective bias when
allocating animals to treatment (e.g. randomisation procedure) and when
Locate relevant guidance documents (e.g. EU guidance on project evaluation). assessing results (e.g. if done, describe who was blinded and when).
c. The experimental unit (e.g. a single animal, group or cage of animals).
3. Ethical issues, Construct a lay summary. A time-line diagram or flow chart can be useful to illustrate how complex
Harm-Benefit In dialogue with ethics committees, consider whether statements about this type of research have study designs were carried out.
Assessment and already been produced. Experimental 7 For each experiment and each experimental group, including controls,
humane endpoints Address the 3Rs (Replacement, Reduction, Refinement) and the 3Ss (Good Science, Good Sense, procedures provide precise details of all procedures carried out. For example:
a. How (e.g. drug formulation and dose, site and route of administration,
Good Sensibilities). anaesthesia and analgesia used [including monitoring], surgical
Consider pre-registration and the publication of negative results. procedure, method of euthanasia). Provide details of any specialist
equipment used, including supplier(s).
Perform a Harm-Benefit Assessment and justify any likely animal harm.
b. When (e.g. time of day).
Discuss the learning objectives, if the animal use is for educational or training purposes.
c. Where (e.g. home cage, laboratory, water maze).
Allocate a severity classification to the project. d. Why (e.g. rationale for choice of specific anaesthetic, route of
Define objective, easily measurable and unequivocal humane endpoints. administration, drug dose used).
Discuss the justification, if any, for death as an end-point. Experimental 8 a. Provide details of the animals used, including species, strain, sex,
animals developmental stage (e.g. mean or median age plus age range) and
4. Experimental Consider pilot studies, statistical power and significance levels. weight (e.g. mean or median weight plus weight range).
design and Define the experimental unit and decide upon animal numbers. b. Provide further relevant information such as the source of animals,
international strain nomenclature, genetic modification status (e.g.
statistical analysis Choose methods of randomisation, prevent observer bias, and decide upon inclusion knock-out or transgenic), genotype, health/immune status, drug or test
and exclusion criteria. naïve, previous procedures, etc.
The ARRIVE guidelines. Originally published in PLoS Biology, June 20101
Intende essere complementare ad ARRIVEPREPARE (Planning Research
and Experimental Procedures before
on Animals: Recommendations
for Excellence)
ARRIVE
bls.gov/ooh/images/3077.jpg
dreamstime.com
Se il pane non viene bene…..bisogna cambiare gli ingredienGThe elephants in the room...
reddit.com
... il più grande di tutti è l'inadeguata attenzione
ai dettagli durante la pianificazione degli studi
sugli animali, compresa la collaborazione con
la struttura di stabulazione degli animali sin dal
primo giorno di pianificazione del progettoQualche elefante... • Limitata ricerca bibliografica • Mancanza degli humane endpoints • Disegno dello studio debole, inclusa la scelta delle procedure • Distribuzione del lavoro e dei costi non razionale tra i ricercatori e l’animal facility • Valuazione insufficiente delle competenze della facility e delle infrastrutture • Poco o nessun interesse al trasporto e all’acclimatazione • Poca attenzione posta ai rischi per la salute • Mancanza di procedure standard SOP • Poca o nessuna discussione sul destino degli animali dopo la sperimentazione
Struttura di PREPARE Planning Research and Experimental Procedures
on Animals: Recommendations for Excellence
PREPARE copre 15 argomenti:
Formulation of the study
1. Literature searches
2. Legal issues
3. Ethical issues, harm-benefit assessment and humane endpoints
4. Experimental design and statistical analysis
Dialogue between scientists and the animal facility
5. Objectives and timescale, funding and division of labour
6. Facility evaluation
7. Education and training
8. Health risks, waste disposal and decontamination NON inclusi in ARRIVE
Methods
9. Test substances and procedures
10.Experimental animals
11.Quarantine and health monitoring
12.Housing and husbandry
13.Experimental procedures
14.Humane killing, release, reuse or rehoming
15.NecropsyFormulazione dello studio
ü.
ü.
ü.
ü. ü.
ü.Formulazione dello studio
Dialogo tra ricercatori ed esperti dell’utilizzo di animali nella ricerca
Contratto tra l’animal facility e il Gruppo di ricerca
Age, weight, stage of life cycle on arrival
Pre-treatment (surgical or medical) from supplier
La divisione del lavoro e delle responsabilità con una chiara identificazione di tutte le fasi
Quality (e.g. SPF, germ-free, gnotobiotic, conventional)
dell’esperimento assicurandosi che tutti i parametri siano registrati.
Acclimation time before the start of the experiment
Time and duration of fasting (with/without water and bedding)
Animal Researcher Not
facility applicable Environment:
Animal: Type of housing: barrier/conventional
Arrival date Temperature (mean ± variation)
Species Light schedule
Strain/stock and substrain Relative humidity (mean ± variation)
Supplier (full name and address) or bred on the premises Number of air changes in the animal room/cabinet per hour
Number and sex Environmental enrichment
Age, weight, stage of life cycle on arrival Housing:
Pre-treatment (surgical or medical) from supplier Free-range, shelf, cabinet, isolator
Quality (e.g. SPF, germ-free, gnotobiotic, conventional) Cage type and size
Acclimation time before the start of the experiment Number and method of distribution of animals per cage
Time and duration of fasting (with/without water and bedding)
Environment: Page 2 of 4
https://norecopa.no/prepare/5-objectives-and-timescale-funding-and-division-of-
Type of housing: barrier/conventional
labour/division-of-labour-costs-and-responsibility
Temperature (mean ± variation)
Light schedule
Relative humidity (mean ± variation)https://norecopa.no/prepare/6-facility-evaluation/master-plan-and-sops
A simple but effective Master Plan
Consultare il personale dello stabulario fin dal giorno 1 perché…. • hanno diritto di sapere e così saranno motivati • conoscono le possibilità (e le limitazioni) dello stabulario • spesso hanno una serie importante di competenze pratiche e sono capaci di pensiero laterale • conoscono più di ogni altro gli animali • certamente gli animali li conoscono molto bene! • la mancanza di coinvolgimento crea ansia, depressione e opposizione alla ricerca con gli animali inoltre limita la creatività che potrebbe migliorare gli esperimenti
Controllo di qualità delle componenti dello studio
Controllo di qualità delle componenti dello studio
Un esempio: i.v. di un isotopo radioattivo
norecopa.no/PREPARE procedureswithcare.org.uk/intravenous-injection-in-the-mouseLa 4 R: Responsibility
PREPARE non deve essere considerata semplicemente «un’altra checklist» a cui
dimostrare di essersi attenuti.
E’ un supporto per ricordare ai ricercatori tutti quei punti che possono diventare anche
significativamente rilevanti nel loro disegno sperimentale. Allo stesso modo in cui in
pilota provetto valuta ogni punto della sua checklist prima di ogni volo.
La maggior parte dei punti non dovrà poi essere riportata nel lavoro perché
probabilmente non è rilevante per lo specifico contesto, ma la loro valutazione è
fondamentale per il successo dell’esperimento e il rispetto del benessere animale.
https://vimeo.com/358069203Monica Forni
DIMEVET
monica.forni@unibo.it
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