Le discipline post-genomiche e la diagnostica molecolare
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Le discipline post-genomiche e la diagnostica molecolare
1953: nasce la biologia molecolare James Watson e Francis Crick scoprono la struttura del DNA
1953 Si scopre la struttura del DNA: 2 catene polinucleotidiche disposte a doppia
elica [Watson (USA) e Crick (UK)]
Il modello a doppia elica di Crick e Watson
suggerisce un meccanismo di replicazione
OLD OLD
NEW NEW
OLD NEW OLD NEW
Perpetuazione
dell’Informazione
A T A T
G C G C
T A T A
C G C G
Replicazione
Il “Dogma Centrale” della Biologia
1957 Francis Crick e George Gamov (USA)
descrivono il
Il "Dogma centrale"
In tutti i viventi l’informazione fluisce
dal DNA all’RNA (trascrizione)
e dall’RNA alle proteine (traduzione)
La trascrizione e la traduzione sono i processi tramite i quali la cellula legge, ovvero esprime, le sue istruzioni genetiche, ovvero i suoi geni. Dallo stesso gene si possono trarre molte copie identiche di RNA e una stessa molecola di RNA può dirigere la sintesi di molte molecole identiche di proteina.
Dato che solitamente in una cellula esistono solo una copia o due di ogni gene, queste amplificazioni successive le permettono di produrre la quantità necessaria di una proteina molto più rapidamente che se il DNA stesso agisse direttamente da stampo per la sintesi proteica. Inoltre ogni gene può essere trascritto e tradotto con efficienza diversa e questo dà modo alla cellula di avere grandi quantità di certe proteine e modeste quantità di altre. Infine una cellula può modificare (cioè regolare) l’espressione di ciascuno dei suoi geni a seconda delle esigenze del momento (controllo dell’espressione genica).
Un gene
Una proteina
N.B. Flusso dell’informazione lineare e incontrovertibile
2001 Gli scienziati del progetto internazionale “Humane Genome Project” hanno sequenziato l’intero genoma umano
1996 Viene decifrata per la prima volta la sequenza di
un genoma eucariotico: il lievito Saccharomyces
Cerevisiae
1998 Per la prima volta viene decifrato il
genoma di un animale: quello del verme
Caenorhabditis elegansSaccharomyces cerevisiae: 6000 geni
Caenorhabditis elegans: 19.000 geni
Homo sapiens: 25.000 geni (3.2 Mbp)2001 Human Genome Project e Celera Genomics
ottengono la mappatura completa del GENOMA
UMANO
Il numero di geni non correla con la complessità
degli organismi superiori, che sembra piuttosto
essere associata alla varietà dei meccanismi di
regolazione e ai processi di maturazione e
modificazione che i prodotti genici subisconoGenoma umano (~3200 Mbp) DNA genico (~25%) DNA intergenico (~75%) •Codificante (esoni) (
GENOMA (DNA)
Nell’uomo circa 25.000- PROTEOMA (proteine)
30.000 geni conservano le Nell’uomo circa 1.000.000
informazioni di proteine svolgono
specifiche funzioni
Incremento di
2-5 volte per
splicing
alternativo
Incremento di 5-10
volte per modifiche
post-traduzionali
TRASCRITTOMA (mRNA)
Nell’uomo circa 100.000
trascritti “trasferiscono” le
informazioniFigure 7-21 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010)
Modificazioni post-traduzionali •Acetilazione, metilazione •Fosforilazione •Glicosilazione (enzimatica) •Glicazione (non enzimatica) •Cleavage •Ubiquitinazione
CODICE DI REGOLAZIONE DELLA PROTEINA
(PTMs, post translational modifications)
Modificazioni covalenti controllano il destino ed il
comportamento delle proteineLa Genomica ha fornito una quantità spettacolare di dati, ma la maggior parte di questi dati rimane non interpretabile al livello attuale delle conoscenze. Molte ricerche si sono indirizzate allo studio della “totalità” di proteine codificate dal genoma in condizioni spazio-specifiche e tempo-specifiche (Proteomica).
Si definisce proteoma il/i complemento/i proteico/i
tempo- e cellulo-specifico di un genoma
(incluse tutte le isoforme da splicing e le modificazioni
post-traduzionali)
Genoma
Tipo cellulare/tissutale
Farmaci
Stato metabolico Condizioni patologiche
Proteomi
Condizioni sperimentali
Stress
Stadio di sviluppo
Interazioni Età
Ritmi circadianiGli approcci proteomici
Proteomica classica
Mappaggio e identificazione proteine (costruzione di Data Base
proteici specie-specifici e tessuto-specifici)
Proteomica differenziale
Identificazione di cambiamenti di espressione mediante confronto dei
profili proteici (Protein Profiling o Protein Signature) di campioni
rispetto a controlli sperimentali:
✓ trattato vs controllo
✓ mutante vs wild-type
✓ patologico vs normale
Proteomica funzionale
Studio di possibili interazioni, modificazioni post-traduzionali e
funzioni di un sub-set discreto di proteine (sub-proteomi) al fine di
comprendere gli eventi molecolari alla base di un fenotipo
fisiologico/patologico:
➢ compartimentalizzazione cellulare
➢ complessi multiproteici
➢ vie di trasduzione del segnaleSi definisce proteoma il complemento tempo- e cellulo-specifico del genoma. Il proteoma comprende tutte le proteine espresse nello stesso momento in una cellula, incluse tutte le isoforme da splicing alternativo e le modificazioni post- traduzionali. Mentre il genoma è costante per una data cellula ed identico per tutte le cellule di un organismo, e non cambia molto all’interno della specie, il proteoma è molto dinamico nel tempo e in risposta a fattori esterni, e differisce in maniera sostanziale tra i diversi tipi cellulari.
Il “Dogma Centrale” della Biologia
Un gene
Una proteina
Un genoma
Molteplici proteomiDAI GENOMI ALLE FUNZIONI:
Biochimica e Biologia Molecolare
Scienza dell’Informazione (Bioinformatica)
---ATGTTGAAGTTCAAGTATGGTGTGCGGAAC--- GENOMA
---AUGUUGAAGUUCAAGUAUGGUGUGCGGAAC---
RNA
--MLKFKYGVRNPPEA-- PROTEINAIl sequenziamento di nuova generazione permette anche
di sequenziare gli RNA -> TRASCRITTOMAGenoma
Insieme delle informazioni genetiche che caratterizzano un organismo.
Controllo trascrizionale
Trascrittoma
Insieme dei trascritti (codificanti e non)
SEQUENZIAMENTO DELL’RNA
prodotti da una determinata popolazione
cellulare. Per ogni tipo cellulare diverso
sono espressi all’incirca 10000 geni
diversi.
Controllo post-trascrizionale
Proteoma SPETTROMETRIA DI MASSA
Insieme delle proteine prodotte da una
determinata popolazione cellulare.……comincia a delinearsi un sistema di strati molecolari portatori d’informazione, che incorporano e superano il meccanismo gerarchico “trascrizione- traduzione”, che mostrano capacità di retroazione (feedback), e che richiedono approcci sistemici di interpretazione.
Strati molecolari portatori di informazione
DNA genico
DNA intergenico
(non codificante, con funzioni di regolazione)
Splicing alternativo
RNA
(modificazione di alcune Editing
informazioni) Interference
Proteine
(codifica di alcune informazioni, es. Prioni)mRNA interference
mRNA silencing mRNA interference
PrPc PrPSc Cambiamenti conformazionali anomali possono determinare l’aggregazione delle proteine a dare aggregati insolubili (es fibre amiloidi)
La concentrazione
finale di ogni proteina
dipende dall’efficienza
di ciascuna delle fasi
implicate nella sua
produzioneMultigenicità L’espressione di una singola proteina dipende da più geni: • Fattori di trascrizione • Enhancers in trans • Sequenze di controllo • Cromatina • Metilazione del DNA • Proteine regolatrici • Modificazioni post-traduzionali • Chaperonine • Trasporto e secrezione • Degradazione
Pleiotropia Un singolo gene influenza il destino di più proteine La trascrizione e la traduzione del gene avvengono attraverso il coinvolgimento di proteine che a loro volta influenzano la trascrizione e la traduzione di altri geni
Il suffisso greco “ome” sta per “completo, tutto”
descrive l’analisi globale
Genomica
Proteomica Trascrittomica
Metabolomica
Lipidomica Glicomica
Studio dei fenomeni biologici con metodologie globaliDiscipline omiche
Il suffisso greco “ome” sta per “completo, tutto”
Studio dei fenomeni biologici con metodologie globali
Approccio metodologico di tipo sistemicoLa BIOLOGIA dei SISTEMI o “Interattomica” tenta di far luce sulle modalità attraverso le quali un messaggio lineare contenuto nelle molecole di DNA produce una forma tridimensionale che rappresenta un fenotipo
..... the Interactome Biologia dei Sistemi (Systems Biology)
Interaction network of differentially expressed proteins according with STRING v10 database with reliability score higher than 0.4. FGG, Fibrinogen gamma chain; FGB, Fibrinogen beta chain; C1R, C3 and C4-B, complement subcomponents; AAT, alpha- 1-antitrypsin; VTN, vitronectin; CD5L, CD5 antigen-like.
Le discipline “omiche” sono attualmente possibili grazie: - all’enorme sviluppo degli approcci tecnologici; - all’apporto di discipline come la matematica e la bioinformatica, che permettono di gestire un numero enorme di dati.
La conoscenza dei sistemi complessi è difficile da semplificare e soprattutto da ordinare in percorsi lineari. La spiegazione del sistema complesso deve basarsi non solo sulla descrizione delle caratteristiche dei componenti, ma anche sullo studio del sistema integro, comprendente la complessa rete delle interrelazioni e retroazioni.
Riduzionismo e visione sistemica devono quindi coesistere. La loro coesistenza metodologica risolve il problema delle cosiddette “PROPRIETA’ EMERGENTI”, cioè la comparsa di proprietà nel sistema complesso di livello superiore non prevedibili dalla conoscenza delle proprietà degli elementi di livello inferiore.
..... the Interactome
“proprietà emergenti”
Systems BiologyUnravelling molecular pathways……
Signalome
“proprietà emergenti”Epigenetics refers to persistent and heritable alterations in genome information that do NOT involve changes in DNA sequence SAME GENOME – MANY EPIGENOMES
Epigenetics has been defined as the Heritable modification of gene function without changes in the DNA sequence DNA (methylation) and histone modification (methylation, acetylation, phosphorylation, ubiquitination and O-GlcNAcylation), and changes in the chromatin structure Hanover JA, Krause MW & Love DC (2012) Bittersweet memories: linking metabolism to epigenetics through O-GlcNAcylation. Nat Rev Mol Cell Biol 13 , 312–321.
Epigenetics
Environmental Influences on Epigenome
Modified from Aspects Med., 2013
Drugs Environmental
Maternal Care Stress Diet Microbiota Exercise Smoking of abuse Pathogens Weather Toxins
Conception,Translational Research
Tissue analysisProspettive delle GENOMICA:
1. Ricerca di mutazioni
– Analisi di sequenza di geni malattia
– Mutazioni germinali e malattie genetiche
– Mutazioni somatiche e cancro
2. Analisi dell’espressione genica
– Firme molecolari di espressione genica associate a determinate patologie
– Valore diagnostico dei profili di espressione genica
– Riclassificazione delle malattie neoplastiche in base alle firme molecolari
3. Analisi della variabilità genetica
– Permette di determinare l’influenza del background genetico nelle malattie
multifattoriali
– E di identificare genotipi suscettibili a determinate patologie
4. Analisi funzionale
– Definizione di funzioni biologiche, regolazione e meccanismo d’azione di
migliaiia di geni sequenziati ma non caratterizzati
– Comprensione molecolare delle modalità di sviluppo e progressione del cancro e
di altre malattie
– Identificazione di nuovi bersagli molecolari per farmaci “intelligenti”Medicina personalizzata e medicina di precisione
• Si basa sulla comprensione molecolare delle cause delle malattie per
sviluppare approcci terapeutici mirati al meccanismo e non al sintomo (i
cosiddetti farmaci intelligenti)
• Si pone inoltre l’obiettivo di tenere conto della variabilità individuale dei geni,
dell'ambiente e dello stile di vita di ogni persona nello sviluppare strategie
preventive e terapeutiche ottimizzate per l’individuo.
• È in contrasto con un approccio di taglia unica, in cui le strategie di trattamento
e prevenzione della malattia sono sviluppate per la persona media.
• Fa parte della medicina di precisione anche il concetto di medicina di genere,
che ha l'obiettivo di comprendere i meccanismi attraverso i quali le differenze
legate al genere agiscono sullo stato di salute e sull'insorgenza e il decorso di
molte malattie, nonché sui risultati delle terapie.
• Sebbene il termine "medicina di precisione" sia relativamente nuovo, il
concetto è stato parte dell'assistenza sanitaria per molti anni. Ad esempio, la
determinazione del gruppo sanguigno per le trasfusioni.Cosa intendiamo per farmaci “intelligenti”?
Farmaco Fattore di crescita
Recettore per fattore di crescita
proteine
citoplasmatiche
Farmaco
Farmaco
Proteine coinvolte Proteine nucleari
nella duplicazione (fattori di trascrizione)
cellulareGWAS (Genome Wide Association Studies)
Diagnostica Molecolare
Old Way
Patient’s tissue
sample Pathology
Proteomics
Proteins
New Way
Mass spectrometry Proteomic image
Next generation sequencing:
Genomics
Patient’s
tissue sample or blood
sample
DNA RNA Microarray imageDiagnostica Molecolare
Old Way
Patient’s tissue
sample Pathology
Proteomics
Proteins
New Way
Mass spectrometry Proteomic image
Next generation sequencing:
Genomics
Patient’s
tissue sample or blood
sample
DNA RNA Microarray imagePuoi anche leggere
