METODI CHIMICI DI FISSAZIONE - people@unipi

METODI CHIMICI
DI FISSAZIONE

LA FISSAZIONE DELLE PROTEINE
¢ le principali responsabili delle
  caratteristiche morfologiche e
  funzionali della sostanza vivente
  sono le proteine
¢ la fissazione comporta la
  denaturazione delle proteine
¢ è ottenuta proprio grazie alla
  loro denaturazione
¢ la fissazione delle proteine
  comporta, in grado più o meno
  elevato, la fissazione di altri tipi
  di molecole che si trovano:
    —   legate chimicamente alle proteine che
        vengono fissate
    —   trattenute all’interno delle maglie del
        gel proteico determinato dalla
        fissazione medesima

DENATURAZIONE DELLE PROTEINE
¢   Consiste nella trasformazione della disposizione spaziale della catena
    polipeptidica (o delle catene, se più di una) dalla disposizione tipica della
    proteina nativa (quella presente in vivo) verso una più disordinata

¢   Ne consegue la modificazione delle proprietà chimiche, fisiche e biologiche
    della proteina e in particolare una diminuzione della solubilità

¢   le proteine denaturate possono:
    —   flocculare (una flocculazione irreversibile si definisce coagulazione)
    —   formare un gel dello stesso volume della soluzione originaria
¢   la fissazione di cellule e tessuti deve comunque avvenire con la minima
    alterazione possibile della struttura delle proteine, sia primaria sia di
    ordine superiore

DENATURAZIONE
DELLE PROTEINE

REQUISITI DELLA FISSAZIONE CON METODI CHIMICI

 I requisiti per effettuare una buona fissazione sono
 1)Precocità
   —   Il tessuto va fissato il prima possibile dopo il prelievo
       dall’organismo
   —   se si tratta di materiale autoptico, il prima possibile dopo il
       decesso dell’individuo
   —   il requisito della precocità è particolarmente significativo
       per studi di microscopia elettronica
   —   la resistenza di un tessuto alle alterazioni post-mortali
       varia da tessuto a tessuto
       ¢   è anche in funzione di:
           ¢   stato funzionale
           ¢   eventuale patologia

REQUISITI DELLA FISSAZIONE CON METODI CHIMICI

 ¢   2) Piccole dimensioni del frammento da fissare
     —   gli agenti fissativi penetrano nel tessuto dalla superficie
         verso l’interno
     —   I frammenti grossi si fissano male nel loro interno

 ¢   3) Idoneo mezzo di fissazione
     —   a seconda del tipo di studi che si intendono eseguire
     —   spesso è necessario l’impiego di metodi fissativi differenti
         su frammenti dello stesso materiale biologico
 ¢   4) abbondanza del mezzo fissativo
     —   nel caso di agenti fissativi chimici in soluzione

CLASSIFICAZIONE DEI FISSATIVI CHIMICI
¢I fissativi chimici si possono suddividere
 in:
 —   1) fissativi primari
 —   2) fissativi secondari

1) fissativi primari
 —   sono quelli che assicurano da soli una efficace
     conservazione delle cellule e dei tessuti,
     rispettandone l’architettura generale e la struttura,
     in quanto agiscono sulle proteine tissutali

2) FISSATIVI SECONDARI O ACCESSORI
  —   da soli non sono in grado di fissare il
      tessuto nel suo complesso per la scarsa o nulla
      azione sulle proteine,
  —   utili, talora indispensabili, per fissare altre
      componenti macromolecolari della sostanza
      vivente, che non sono conservate efficacemente
      dai fissativi primari
  —   si devono usare insieme a quelli primari, mai
      da soli
  —   esempi
      ¢ per microscopia ottica: il cloruro ed il bromuro di
        etilpiridinio
      ¢ per microscopia elettronica, oltre ai precedenti il
        blu alcian 8GX o il rosso rutenio (non impiegati per il
        microscopio ottico perché sono dotati di colore proprio
        e quindi interferiscono con successive reazioni di
        colorazione)

CLASSIFICAZIONE DEI FISSATIVI PRIMARI
¢I  fissativi primari si suddividono in:
   — coagulanti (precipitazione grossolana
     di ovoalbumina)
   — non coagulanti (fine precipitazione)
¢ La distinzione dipende dall’effetto che i
  fissativi producono su soluzioni di
  ovalbumina
¢ Questa classificazione è del tutto empirica e
  non si riferisce all’effetto dei fissativi sui
  tessuti (la fissazione di un tessuto biologico
  comporta sempre un grado variabile di
  coagulazione, cioè una insolubilizzazione
  irreversibile delle proteine tissutali)

¢I   fissativi primari coagulanti sono:

 —   etanolo, metanolo, acetone, cloroformio,
     bicloruro di mercurio, acido picrico, triossido
     di cromo, acido cromico, acido tricloroacetico

¢I   fissativi primari non coagulanti sono:

 —   formaldeide, glutaraldeide, acroleina,
     tetrossido di osmio (impropriamente chiamato
     anche acido osmico), bicromato di potassio,
     permanganato di potassio,
     dietilpirocarbonato, parabenzochinone, acido
     acetico

MECCANISMI DI AZIONE DEI
FISSATIVI CHIMICI PRIMARI
i principali effetti dei fissativi chimici primari sulla sostanza vivente:

1) modificazione delle caratteristiche del solvente
    —   alcoli, acetone e cloroformio, si sostituiscono all’acqua
    —   acidi, modificano il pH di soluzioni acquose
2) reazioni chimiche con le proteine (possibile formazione di
   legami chimici senza formazione di ponti intermolecolari)
    —   esempio: tetrossido di osmio che è un forte ossidante
3) reazioni chimiche con le proteine (con formazione di ponti
   intermolecolari)
    —   Esempio: aldeidi che sono capaci di reagire contemporaneamente con
        gruppi reattivi di due diverse catene peptidiche
¢   singoli agenti fissativi possono agire attraverso più
    meccanismi
¢   la migliore conservazione dell’architettura
    generale e della fine struttura dei tessuti e delle
    cellule è fornita da agenti che formano ponti
    intermolecolari

ARTEFATTI
¢ in tutti i casi, si deve tener conto dei possibili
  artefatti determinati durante la fissazione
¢ sono tutte quelle modificazioni dei caratteri
  morfologici ed istochimici, rispetto allo stato
  vivente, che insorgono durante la preparazione
  del tessuto per l’osservazione microscopica
¢ devono essere minimi

¢ non sono mai eliminabili completamente e se ne
  deve tenere conto nell’interpretazione dei
  risultati

ARTEFATTI DA FISSAZIONE
I principali  artefatti che possono insorgere durante la
      fissazione sono i seguenti:

1)    coartazione dei tessuti, con possibili distacchi tra
      tessuti di diversa consistenza e con diverso contenuto
      in acqua
2)    rigonfiamento di tutto il tessuto o di alcune sue parti
3)    indurimento del tessuto
4)    estrazione di sostanze solubili negli agenti fissativi
5)    spostamento di sostanze all’interno del preparato
      (esempio tipico le cosiddette immagini di fuga del
      glicogeno, apprezzabili nei preparati fissati con
      etanolo)
6)    blocco di gruppi chimici, per reazione con gli agenti
      fissativi
7)    introduzione di gruppi chimici estranei al tessuto e
      presenti negli agenti fissativi
8)    smascheramento di gruppi chimici del tessuto che
      sono impegnati in legami chimici da cui vengono
      liberati ad opera degli agenti fissativi

ARTEFATTI DA FISSAZIONE

 ¢ gli artefatti si producono nell’intervallo di
   tempo che intercorre tra l’arrivo dell’agente
   fissativo in una porzione del preparato e la sua
   completa fissazione
 ¢ in questo intervallo si hanno alterazioni delle
   proprietà delle cellule e dei tessuti prima che si
   completi la insolubilizzazione delle proteine
   tissutali
 ¢ una volta che l’insolubilizzazione è completa, gli
   artefatti compaiono solo in piccola misura e in
   casi limitati

ESEMPI DI FISSATIVI CHIMICI PRIMARI
ETANOLO,     METANOLO   ACETONE         CLOROFORMIO
 CH3CH2OH,     CH3OH     CH3-CO-CH3        CHCl3

 ¢ agiscono sostituendosi al solvente fisiologico,
   l’acqua;
 ¢ denaturano la maggior parte delle proteine, con
   esclusione delle nucleoproteine
 ¢ si impiegano per ricerche immunoistochimiche
   nonostante la loro azione drastica sulle proteine,
 ¢ si usano di solito per tempi brevi (10-15 min) e a
   freddo (4°C)
 ¢ Alcoli, acetone e cloroformio sciolgono la maggior
   parte dei lipidi;
 ¢ provocano notevole indurimento e coartazione dei
   tessuti

BICLORURO DI MERCURIO
¢ il bicloruro di mercurio (sublimato corrosivo: HgCl2)
¢ agisce stabilendo legami con le proteine;
    —   lo lone HgCl+ reagisce con gruppi sulfidrilici (tioli: —
        SH), carbossilici (—COOH), idrossilici (—OH) delle
        proteine e con i gruppi fosfato degli acidi nucleici

¢ il bicloruro di mercurio è un discreto ossidante;
¢ provoca coartazione e indurimento dei tessuti di
  grado molto modesto
¢ il bicloruro di mercurio forma spesso dei precipitati
  aghiformi nei tessuti che vengono rimossi mediante
  trattamento con soluzione di iodio e ioduro di
  potassio (soluzione iodoiodurata)

ACIDO PICRICO
¢   L’acido picrico (trinitrofenolo) presenta in superficie
    numerosi atomi di ossigeno elettronegativi
¢   altera le cariche superficiali delle proteine con
    conseguente formazione di aggregati gelificati
    delle proteine alterate
¢   l’acido picrico può anche formare ponti
    intermolecolari tra proteine fibrose
¢   l’acido picrico non ha effetti diretti sui lipidi, che
    non sono né estratti, nè insolubilizzati nei confronti
    dei successivi trattamenti con solventi dei lipidi
¢   conserva il glicogeno grazie alla sua azione sulle
    proteine con le quali il glicogeno può essere associato
    (formano un reticolo tridimensionale all’atto della
    fissazione)
¢   è scarsamente penetrante e provoca fortissima
    coartazione dei tessuti, ma non indurimento
¢   si usa in soluzione satura acquosa (circa 1,4%) o
    alcolica
¢   cristallizzato idrato può essere conservato senza
    precauzioni particolari (è in tal caso di colore giallo)
¢   cristallizzato anidro (di colore bianco) è
    esplosivo

FORMALDEIDE
¢   la formaldeide (HCHO) è il fissativo più frequentemente impiegato
    nelle ricerche istochimiche, da solo o in associazione ad altri
¢   è in grado di legarsi con legami covalenti con numerosi gruppi
    chimici contenenti un atomo di idrogeno reattivo:
           R-H + HCHO à R-CH2OH
¢   la formaldeide è usata alla concentrazione di circa il 4%, a pH tra
    7,3 e 7,4, a temperatura ambiente o a 4°C, alla pressione
    atmosferica
¢   in queste condizioni, la formaldeide reagisce soprattutto con anelli
    aromatici e con gruppi aminici (—NH2 )
¢   una volta legatasi ad una proteina, la formaldeide può reagire con
    un idrogeno reattivo di una seconda molecola formando ponti
    intermolecolari
¢   la formaldeide reagisce con le strutture biologiche in modo
    relativamente lento; è discretamente penetrante
¢   la formaldeide conserva la maggior parte dei lipidi (li rende
    insolubili nei confronti dei solventi)
¢   conserva solo parzialmente il glicogeno
¢   determina indurimento dei tessuti

¢ la formaldeide si trova in
  commercio come formolo o formalina:
   — soluzione di formaldeide (un gas in
     condizioni normali) in acqua, alla
     concentrazione di circa 36—40%
     (peso/volume), stabilizzata con circa il 10%
     di metanolo
¢ la formalina del commercio è usata in
  concentrazione del 10% (corrispondente a
  circa il 4% di formaldeide in soluzione),
¢ per lo più viene usata in soluzione tamponata
  oppure con l’aggiunta di cloruro di calcio, per
  ottenere una migliore stabilizzazione dei
  lipidi
¢ un lungo soggiorno dei frammenti di tessuto
  in formalina provoca indurimento

PARAFORMALDEIDE

¢ la formaldeide può essere anche ottenuta, pura,
  da un suo polimero, la paraformaldeide (polvere
  bianca)
¢ per preparare una soluzione di formaldeide si
  scioglie la paraformaldeide in acqua alla
  concentrazione desiderata,
¢ Si scalda l’acqua a 60°C e si aggiungono alcune
  gocce di soda (Na0H, 1N)
¢ la formaldeide ottenuta dalla paraformaldeide si
  usa anche per studi di microscopia elettronica,
¢ la formalina non può essere usata per la
  microscopia elettronica a causa della presenza del
  metanolo nella soluzione

GLUTARALDEIDE
 ¢   La glutaraldeide (CHO—(CH2)3-CHO) ha meccanismo di
     azione simile alla formaldeide
 ¢   A differenza della formaldeide, l’aldeide glutarica o
     glutaraldeide introduce gruppi aldeidici liberi nei tessuti
 ¢   La glutaraldeide è molto meno penetrante della
     formaldeide, ma garantisce la fissazione dei fosfolipidi e
     degli sfingolipidi e, almeno parzialmente, di tutti gli altri
     lipidi
 ¢   E’ usata per microscopia elettronica, a concentrazioni
     comprese tra il 2% e il 6%;
 ¢   in commercio si trova in soluzione acquosa, in confezioni
     ermetiche in atmosfera di azoto per evitare processi di
     ossidazione e conseguente polimerizzazione ad opera
     dell’ossigeno atmosferico; va conservata al buio
 ¢   La glutaraldeide è dotata di fluorescenza primaria

TETROSSIDO DI OSMIO
  ¢   Il tetrossido di osmio (OsO4) è in grado di reagire con
      numerosi gruppi chimici, comportandosi da energico
      ossidante;
  ¢   reagisce con gruppi alcolici ( =CHOH) con eteri (R—0—
      R’), con gruppi aldeidici (—CHO) e chetonici (=CO)
  ¢   Reagisce con gruppi sulfidrilici (—SH) e disolfuro (—S—
      S—) con gruppi aminici (—NH2) determinando una
      deaminazione ossidativa, con gruppi guanidinici,
      imidazolici e pirrolici, con i doppi legami dei lipidi
  ¢   Reagisce solo se questi gruppi sono presenti in molecole
      a lunga catena carboniosa,
  ¢   Reagisce molto lentamente anche con idrocarburi saturi
  ¢   Il tetrossido d’osmio è poco penetrante, per cui
      frammenti di tessuto non devono superare 1 mm di
      spessore;
  ¢   provoca una modica coartazione ed un notevole
      indurimento dei tessuti

¢ Il tetrossido d’osmio reagisce anche con i
  lipidi,
¢ si scioglie in essi e può così reagire con i
  loro gruppi reattivi, venendo ridotto a
  biossido di osmio (OsO2 nero)
¢ Il biossido di osmio si comporta come un
  colloide carico negativamente che è
  attratto da forze elettrostatiche verso il
  polo idrofilo dei fosfolipidi;
¢ questo fenomeno può spiegare, almeno in
  parte, la distribuzione dell’osmio nelle
  membrane cellulari

ACIDO ACETICO

¢ L’acido acetico (CH3-COOH) determina una
  acidificazione del solvente fisiologico ed
  esercita così la sua azione fissativa
¢ E’ usato in miscele fissative per microscopia
  ottica
¢ Dopo fissazione in miscele contenenti acido
  acetico si devono passare i tessuti direttamente
  in alcool a 80° per evitare un rigonfiamento
  eccessivo dei tessuti in generale e delle fibre
  collagene in particolare

MISCELE FISSATIVE
Liquido di Zenker.
¢ Era un fissativo consigliato in passato come il più
  idoneo per eseguire comuni preparati di qualsiasi
  organo e di embrioni.
    —   Sublimato corrosivo               gr 5
    —   Liquido di Mùller                 ml 100
    —   Si scioglie a caldo.
    —   Prima dell’uso si aggiunge acido acetico 5 %.
¢ Durata della fissazione 24 ore; per pezzi piccoli
  bastano 6-10 ore.
¢ Si lava in acqua corrente per 24 ore, poi si passa
  nell’alcool iodato come per i pezzi fissati in
  sublimato.

ESECUZIONE DELLA FISSAZIONE CON AGENTI CHIMICI

La fissazione con agenti chimici può essere
effettuata mediante:
¢ esposizione a vapori del fissativo
  (soprattutto formaldeide) nel caso di
  sottili sezioni di tessuto o cellule isolate
¢ Più comunemente, la fissazione con
  agenti chimici si esegue mediante
  soluzioni fissative che possono contenere:
   — un solo agente fissativo sciolto in
     acqua o in soluzioni saline
   — più fissativi miscelati tra loro o
     sciolti in acqua o in soluzioni saline

PROPRIETÀ E IMPIEGO DELLE MISCELE
FISSATIVE
¢   queste miscele oltre agli agenti fissativi
    contengono sali minerali e talora saccarosio, per
    regolare la solubilità dei fissativi, il pH, la
    pressione osmotica e la forza ionica
¢ Le    soluzioni fissative possono essere
    impiegate:
     — Per immersione dei frammenti da
       fissare (fissazione per immersione),
     — perfondendo l’albero circolatorio di un
       organo o di un intero, piccolo animale
       (fissazione per perfusione)

PROPRIETÀ E IMPIEGO DELLE MISCELE
FISSATIVE

¢ Le miscele fissative devono tener conto della
  compatibilità reciproca tra i fissativi impiegati:
¢ alcuni fissativi possono essere mescolati tra loro solo
  al momento dell’uso, perché col tempo reagiscono
  l’uno con l’altro, inattivandosi
¢ Le miscele fissative si propongono di:
    — compensare i difetti dei singoli agenti impiegati
    — ottenere una fissazione completa ed adeguata sotto il
      profilo morfologico e chimico

MISCELE FISSATIVE
      Liquido di Bouin.
      •E’ uno dei fissativi più usati per le preparazioni
      istologiche di routine.
      •Essendo molto penetrante serve per fissare pezzi di
      organi anche voluminosi e permette l’uso di quasi tutti i
      metodi di colorazione.
      •Si presta per allestire tanto preparati di insieme quanto
      citologici.

      Soluzione satura acquosa di:
      acido picrico                           ml      15
      Formalina                               ml      5
      Acido acetico glaciale                  ml      1

      Si mescolano le parti al momento dell’uso.
      Durata della fissazione: secondo la grossezza dei pezzi
      da 12 a 48 ore.