HOLOTYPE HLA 96/7 - CONFIGURAZIONE A/B/C & CE V2 - Amazon AWS
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HOLOTYPE HLA 96/7 –
CONFIGURAZIONE
A/B/C & CE V2
(REF: H32.1, H34.1, H38)
ISTRUZIONI D’USO
Per uso diagnostico in vitro
VERSIONE PROTOCOLLO V3.0.1
VERSIONE DOCUMENTO 01
11/03/2020
Preparazione del DNA per analisi di
2797 sequenziamento su Illumina® MiSeq e MiniSeq
Indice
INTRODUZIONE ..................................................................................................................... 7
INFORMAZIONI SUL PRODUTTORE......................................................................................... 7
SIGNIFICATO DEI SIMBOLI ...................................................................................................... 8
CONTENUTO DEL KIT HOLOTYPE HLA-96/7 – CONFIGURAZIONE A/B/C & CE V2 (REF:H32.1,
REF:H34.1 E REF:H38) ............................................................................................................ 9
SCATOLA COMPONENTI PRIMER .......................................................................................................... 9
SCATOLA COMPONENTI REAGENTI PER PREPARAZIONE LIBRERIE ................................................................. 9
PIASTRA A 96 POZZETTI CON ADATTATORI .......................................................................................... 10
WORKBOOK EXCEL ........................................................................................................................ 10
SOFTWARE – OMIXON HLA TWIN .................................................................................................... 10
TRASPORTO E CONSERVAZIONE........................................................................................... 11
AVVERTENZE E PRECAUZIONI .............................................................................................. 11
LIMITAZIONI D’USO DEL PRODOTTO ................................................................................................... 11
LIMITAZIONI NOTE DEL PRODOTTO .................................................................................................... 11
INFORMAZIONI PER LA SICUREZZA ...................................................................................... 12
PARAMETRI DI PRESTAZIONE............................................................................................... 12
ASSISTENZA TECNICA ........................................................................................................... 12
Supporto telefonico ............................................................................................................. 12
APPARECCHIATURE, REAGENTI E FORNITURE ....................................................................... 13
RACCOMANDAZIONI TECNICHE E SULLE APPARECCHIATURE ..................................................................... 13
RACCOMANDAZIONI SUI REAGENTI ASSOCIATI ...................................................................................... 13
Capacità Kit Reagenti MiSeq ............................................................................................... 14
Capacità Kit Reagenti MiniSeq ............................................................................................ 14
ATTREZZATURE CONSIGLIATE............................................................................................................ 14
AVVISO LEGALE ................................................................................................................... 15
DESTINAZIONE D’USO.......................................................................................................... 16
NOTA IMPORTANTE PRIMA DI INIZIARE ............................................................................... 16
RACCOMANDAZIONE CIRCA L’ESTRAZIONE DI DNA GENOMICO ............................................................... 16
TERMOCICLATORI VALIDATI .............................................................................................................. 17
PRINCIPIO DEL METODO ...................................................................................................... 17
SOMMARIO DELLE FASI ....................................................................................................... 18
GLOSSARIO/DEFINIZIONI ..................................................................................................... 19
FASE 0 – NORMALIZZAZIONE DEL DNA GENOMICO .............................................................. 20
Omixon Holotype HLA 96/7 – Configurazione A/B/C & CE v2 Istruzioni d’uso. Per uso diagnostico in vitro.
Copyright© 2020, Omixon Biocomputing Ltd. Proprietario e riservato
Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 2 │ 58FASE 1 – PREPARAZIONE MASTER MIX PER AMPLIFICAZIONE HLA ........................................ 21
ELENCO REAGENTI ......................................................................................................................... 21
PROTOCOLLO ................................................................................................................................ 21
Master mix: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 e DQA1 .................................................................... 22
Master mix: HLA-DQB1 serie 3 ............................................................................................ 22
FASE 2 – AMPLIFICAZIONE HLA CLASSE I E II ......................................................................... 23
ELENCO REAGENTI ......................................................................................................................... 23
PROTOCOLLO ................................................................................................................................ 23
Amplificazione classe I (HLA-A, B e C).................................................................................. 24
Amplificazione classe II (HLA-DRB1, DPB1, DQA1 e DQB1) ................................................. 24
Dimensioni previste ampliconi............................................................................................. 24
FASE 3 – QUANTIFICAZIONE E NORMALIZZAZIONE AMPLICONI (PER PIASTRE CON
CAPACITÀ DI 200 µL)............................................................................................................ 25
ELENCO REAGENTI ......................................................................................................................... 25
PROTOCOLLO ................................................................................................................................ 25
FASE 4 – COMBINAZIONE E PURIFICAZIONE DEGLI AMPLICONI ............................................. 27
ELENCO REAGENTI ......................................................................................................................... 27
PROTOCOLLO ................................................................................................................................ 27
FASE 5 – PREPARAZIONE LIBRERIA ....................................................................................... 30
ELENCO REAGENTI ......................................................................................................................... 30
PROTOCOLLO ................................................................................................................................ 30
Master mix frammentazione ............................................................................................... 31
Programma frammentazione .............................................................................................. 31
Master mix riparazione estremità ....................................................................................... 32
Programma riparazione estremità ...................................................................................... 32
Master mix ligazione ........................................................................................................... 33
Programma ligazione .......................................................................................................... 33
Combinazione della libreria ................................................................................................. 34
FASE 6 – SCELTA DELLE DIMENSIONI DELLA LIBRERIA UTILIZZANDO LE BIGLIE....................... 35
ELENCO REAGENTI ......................................................................................................................... 35
PROTOCOLLO ................................................................................................................................ 35
FASE 7 – QUANTIFICAZIONE DELLA LIBRERIA CON UNO STRUMENTO PER QPCR ................... 39
ELENCO REAGENTI ......................................................................................................................... 39
PROTOCOLLO ................................................................................................................................ 39
Primer mix qPCR .................................................................................................................. 39
Master mix qPCR ................................................................................................................. 40
FASE 8 – SEQUENZIAMENTO SU ILLUMINA MISEQ ............................................................... 42
ELENCO REAGENTI ......................................................................................................................... 42
Omixon Holotype HLA 96/7 – Configurazione A/B/C & CE v2 Istruzioni d’uso. Per uso diagnostico in vitro.
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 3 │ 58Capacità Kit Reagenti MiSeq ............................................................................................... 42
PROTOCOLLO ................................................................................................................................ 42
FASE 9 – ANALISI DATI DI SEQUENZIAMENTO HLA................................................................ 44
PROTOCOLLO AUTOMATIZZATO ........................................................................................................ 44
PROTOCOLLO SERVER MANUALE ....................................................................................................... 44
PROTOCOLLO DESKTOP MANUALE ..................................................................................................... 44
FIGURE SUPPLEMENTARI ..................................................................................................... 46
ESEMPIO DI SCHEMA PER PIASTRA AMPLICONI, PIASTRA AMPLIFICAZIONE, PIASTRA DILUIZIONE, PIASTRA
QUANTIFICAZIONE AMPLICONI (PER UN LOCUS INDIVIDUALE) E PIASTRA REAZIONE .................................. 46
ESEMPIO DI PIASTRA QUANTIFICAZIONE STANDARD ............................................................................... 46
ESEMPIO DI PIASTRA PER QUANTIFICAZIONE LIBRERIA CON QPCR KAPA ................................................... 47
APPENDICE 1: SCELTA DELLE DIMENSIONI DELLA LIBRERIA UTILIZZANDO PIPPIN PREP ......... 48
ELENCO REAGENTI ......................................................................................................................... 48
PROTOCOLLO ................................................................................................................................ 48
Purificazione della libreria ................................................................................................... 48
Scelta delle dimensioni della libreria ................................................................................... 50
PROGRAMMAZIONE PIPPIN PREP ...................................................................................................... 50
ESECUZIONE DI UNA CORSA SU PIPPIN PREP ........................................................................................ 50
APPENDICE 2: QUANTIFICAZIONE E NORMALIZZAZIONE AMPLICONI (PER PIASTRE CON
CAPACITÀ DI 100 µL)............................................................................................................ 53
ELENCO REAGENTI ......................................................................................................................... 53
PROTOCOLLO ................................................................................................................................ 53
APPENDICE 3: QUANTIFICAZIONE LIBRERIE CON UN COLORANTE FLUORESCENTE
INTERCALANTE NEL DSDNA ................................................................................................. 55
ELENCO REAGENTI ......................................................................................................................... 55
PROTOCOLLO ................................................................................................................................ 55
APPENDICE 4: SEQUENZIAMENTO SU ILLUMINA MINISEQ .................................................... 57
ELENCO REAGENTI ......................................................................................................................... 57
Capacità Kit Reagenti MiniSeq ............................................................................................ 57
PROTOCOLLO ................................................................................................................................ 57
Omixon Holotype HLA 96/7 – Configurazione A/B/C & CE v2 Istruzioni d’uso. Per uso diagnostico in vitro.
Copyright© 2020, Omixon Biocomputing Ltd. Proprietario e riservato
Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 4 │ 58Cronologia revisioni – Note e aggiornamenti importanti
Versione Versione Data Autore Sommario delle Autorizzata
protocollo documento modifiche da
3.0.1 V01 11/12/2019 Tünde Prima versione, bozza, Gergely
Vágó aggiornata con le Tölgyesi
metriche di prestazione
Omixon Holotype HLA 96/7 – Configurazione A/B/C & CE v2 Istruzioni d’uso. Per uso diagnostico in vitro.
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 5 │ 58Liberatoria Omixon ha compiuto il massimo sforzo per garantire l’accuratezza delle presenti Istruzioni d'uso (IFU). Tuttavia Omixon esclude qualsiasi responsabilità per eventuali imprecisioni od omissioni. Le informazioni nelle presenti IFU sono soggette a modifiche senza preavviso. Omixon non si assume alcuna responsabilità per eventuali imprecisioni che potrebbero essere contenute nelle presenti IFU. Omixon si riserva il diritto di apportare miglioramenti alle presenti IFU e/o ai prodotti qui descritti in qualsiasi momento senza preavviso. Qualora nel presente manuale si rilevassero informazioni non corrette, ingannevoli o incomplete, vi saremo grati per qualsiasi commento e suggerimento. Vogliate inviarceli all’indirizzo support@omixon.com. Omixon Holotype HLA 96/7 – Configurazione A/B/C & CE v2 Istruzioni d’uso. Per uso diagnostico in vitro. Copyright© 2020, Omixon Biocomputing Ltd. Proprietario e riservato Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 6 │ 58
Introduzione Queste Istruzioni d’uso (IFU) descrivono l’utilizzo dei seguenti prodotti con il protocollo v3.0.1 (con reagenti Promega LR-PCR per l’amplificazione): Tipo di prodotto Numero di riferimento Holotype HLA 96/7 – Configurazione A & CE v2 H32.1 Holotype HLA 96/7 – Configurazione B & CE v2 H34.1 Holotype HLA 96/7 – Configurazione C & CE v2 H38 Informazioni sul produttore Ragione sociale: Omixon Biocomputing Ltd Indirizzo: Fehérvári út 50-52 Città: Budapest Codice postale: H-1117 Paese: Ungheria Omixon Holotype HLA 96/7 – Configurazione A/B/C & CE v2 Istruzioni d’uso. Per uso diagnostico in vitro. Copyright© 2020, Omixon Biocomputing Ltd. Proprietario e riservato Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 7 │ 58
Significato dei simboli
LOTTO/Numero lotto
Numero di riferimento/catalogo
Consultare le Istruzioni d’uso
www.omixon.com
Contiene reagente per numero N di test
96
Fabbricante. La data indicata insieme al simbolo si
riferisce alla data di produzione
Temperatura di conservazione raccomandata
Data di scadenza
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Replacement Component Contiene un ricambio
Identifica l’organismo notificato responsabile della valutazione di
2797 conformità
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 8 │ 58Contenuto del kit Holotype HLA-96/7 – Configurazione A/B/C & CE v2 (REF:H32.1, REF:H34.1 e REF:H38) Questa sezione descrive il contenuto delle varie configurazioni disponibili del prodotto Holotype HLA 96/7: Tipo di prodotto N. RIF. Reaz. Holotype HLA 96/7 – Configurazione A & CE v2 H32.1 96 Holotype HLA 96/7 – Configurazione B & CE v2 H34.1 96 Holotype HLA 96/7 – Configurazione C & CE v2 H38 96 Notare che la scatola componenti primer e la scatola componenti reagenti per preparazione librerie sono uguali per tutte le configurazioni del prodotto. Il componente piastra adattatori indicizzati a 96 pozzetti è diverso nelle varie configurazioni per quanto concerne la sequenza degli indici. Controllare la sezione “Piastra adattatori con indice a 96 pozzetti” per ulteriori informazioni. Scatola componenti primer Il componente primer contiene soluzioni di primer specifici pronte all’uso per l’amplificazione mirata tramite Long Range PCR dei geni HLA A, B, C, DPB1, DQA1, DQB1 e DRB1. In aggiunta, essa contiene due tipi di additivi per PCR (Enhancer 1 e Enhancer 2). Primer mix N. RIF. Reaz. Vol./prov. N. prov. Codif. colore HLA-A P012 96 220 µL 1 Giallo HLA-B P022 96 220 µL 1 Rosso HLA-C P032 96 220 µL 1 Arancio HLA-DRB1 P042 96 220 µL 1 Verde HLA-DQB1 (serie 3) P122 96 220 µL 1 Blu HLA-DQA1 P072 96 220 µL 1 Marrone HLA-DPB1 P082 96 220 µL 1 Viola Enhancer 1 E01 96 1100 µL 1 Trasparente Enhancer 2 E02 96 300 µL 1 Trasparente Scatola componenti reagenti per preparazione librerie La scatola componenti preparazione librerie fornisce reagenti per la preparazione di librerie (frammentazione, riparazione blunt-end e adenilazione delle estremità degli ampliconi, ligazione di sequenze di adattatori indicizzati) a partire dagli ampliconi HLA. Omixon Holotype HLA 96/7 – Configurazione A/B/C & CE v2 Istruzioni d’uso. Per uso diagnostico in vitro. Copyright© 2020, Omixon Biocomputing Ltd. Proprietario e riservato Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 9 │ 58
Reagente N. RIF. Reaz. Vol./prov. N. prov. Codif. colore
Enz. framment. (A) R11 96 278 µL 1 Giallo
Tampone Ffamment. (B) R21 96 278 µL 1 Rosso
Enz. Riparaz. Estrem. (C) R31 96 162 µL 1 Verde
Tamp. Riparaz. Estr. (D) R41 96 324 µL 1 Arancio
Enz. ligazione (E) R51 96 324 µL 1 Blu
Tamp. ligazione (F) R61 96 1800 µL 2 Nero
Piastra a 96 pozzetti con adattatori
Il componente “piastra a 96 pozzetti con adattatori indicizzati” contiene adattatori indicizzati per
NGS pronti all’uso (oligonucleotidi di DNA a doppio filamento) in minimo 5 µL di soluzione per
generare singole librerie per NGS. Questa piastra a 96 pozzetti con adattatori indicizzati contiene
un numero di adattatori indicizzati sufficiente a generare 96 librerie NGS indipendenti e la
successiva identificazione dei campioni.
Versione kit Reagente N. RIF. Reaz. Vol/pozzetto N. di
Piastre
H32.1 Piastra adattatori A (i1-96) N1 96 ≥5 µL 1
H34.1 Piastra adattatori B (i97-192) N2 96 ≥5 µL 1
H38 Piastra adattatori C (i193-288) N3 96 ≥5 µL 1
Workbook Excel
Per facilitare il protocollo Holotype HLA 96/7 viene fornito un Workbook Excel completo di calcoli
del volume, layout piastre, tracciabilità dei reagenti e delle apparecchiature, registrazione dati e
generazione del foglio campioni per MiSeq e MiniSeq per tutte le configurazioni supportate delle
piastre adattatori (A, B e C). La versione del Workbook compatibile con questo Manuale
dell’utilizzatore è la v3.0.1. Se non ne avete una copia, contattate support@omixon.com.
Software – Omixon HLA Twin
Contattate sales@omixon.com per la licenza Omixon HLA Twin associata con il vostro acquisto
del kit Holotype HLA 96/7.
Nota importante:
Si raccomanda l’impiego combinato dei tre componenti del kit Holotype HLA 96/7 con il software
Omixon HLA Twin per un processo diagnostico in vitro integrale. Consultate la Sezione Avvertenze
e precauzioni circa le limitazioni d’uso del prodotto.
Sono disponibili componenti di ricambio previa apposita richiesta da parte dell’utilizzatore.
Omixon fornisce le confezioni complete di tutti i componenti, non flaconi singoli. Per maggiori
informazioni contattate sales@omixon.com.
Omixon Holotype HLA 96/7 – Configurazione A/B/C & CE v2 Istruzioni d’uso. Per uso diagnostico in vitro.
Copyright© 2020, Omixon Biocomputing Ltd. Proprietario e riservato
Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 10 │ 58Trasporto e conservazione Il prodotto viene spedito in scatole d’imballo di polistirolo con ghiaccio secco e all’arrivo dovrà essere conservato tra -15 e -20 °C. Siete pregati di validare il vostro processo di controllo e monitoraggio della temperatura dei congelatori e di effettuare interventi di manutenzione regolari. Se conservati tra -15 e -20 °C, i kit non aperti sono stabili fino alla data di scadenza (indicata sull’etichetta del kit). Dopo l’apertura, si raccomandano max. quattro (4) cicli di congelamento/scongelamento per garantire la stabilità del prodotto. Se conservati tra -15 e -20 °C, i kit aperti sono stabili fino a 3 mesi. Avvertenze e precauzioni Limitazioni d’uso del prodotto Per garantire prestazioni ottimali, usate il kit Holotype HLA 96/7 e il software Omixon HLA Twin per la tipizzazione dell’HLA mediante NGS con i componenti, i reagenti e le attrezzature raccomandati nella sezione “Apparecchiature e reagenti”. L’impiego di componenti e reagenti diversi da quelli specificati nella sezione “Apparecchiature e reagenti” va verificato e validato dall’utilizzatore. Non ricostituire né diluire i reagenti in volumi diversi da quelli descritti nelle presenti IFU. Non utilizzare volumi dei reagenti minori di quelli specificati. In caso contrario, potranno verificarsi degli errori di prestazione. Omixon non può fornire alcun supporto per eventuali problemi risultanti dal mancato rispetto delle fasi previste nel protocollo descritto nelle presenti IFU. In caso di danni visibili ai suoi componenti, non utilizzare il prodotto (flaconi o piastra danneggiati, tappi allentati, ecc.). Limitazioni note del prodotto Consultare il documento “Product Known Limitations Guide” (Limitazioni note del prodotto) circa le ambiguità e le limitazioni del software note del prodotto Holotype HLA. Il documento è distribuita insieme alle IFU ed è anche disponibile sul sito web Omixon nella sezione MyHolotype/Support and Services/HLA Twin Instructions for Use, oppure può essere richiesta all’indirizzo support@omixon.com. Omixon Holotype HLA 96/7 – Configurazione A/B/C & CE v2 Istruzioni d’uso. Per uso diagnostico in vitro. Copyright© 2020, Omixon Biocomputing Ltd. Proprietario e riservato Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 11 │ 58
Informazioni per la sicurezza
Prima di iniziare, leggere le sezioni “Informazioni per la sicurezza” e “Note importanti” circa
reagenti o kit specificati in “Apparecchiature, reagenti e forniture”.
Quando si lavora con sostanze chimiche, indossare sempre camici, guanti monouso e occhiali
protettivi adatti. Per maggiori informazioni, consultare le schede di sicurezza (SDS) reperibili
presso i rispettivi fornitori.
Una panoramica dei componenti chimici dei reagenti del prodotto può essere desunta dagli SDS
del kit Holotype HLA 96/7, disponibili su richiesta.
I componenti del prodotto vanno smaltiti come rifiuti medici generici.
Parametri di prestazione
Principali parametri di prestazione analitica stabiliti in base alla validazione del prodotto.
HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DRB1 HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1
Sensibilità 99,4% 98,99% 98,79% 96,77% 95,16% 96,57% 97,38%
Specificità 99,99% 99,99% 99,97% 99,95% 99,9% 99,85% 99,87%
Precisione 99,4% 98,99% 98,79% 96,77% 95,16% 96,57% 97,38%
Accuratezza 99,98% 99,98% 99,95% 99,91% 99,8% 99,71% 99,75%
Principali parametri di prestazione clinica stabiliti in base alla validazione del prodotto.
HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DRB1 HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1
Sensibilità 99,29% 98,83% 98,58% 97,17% 97,88% 98,58% 99,53%
Specificità 99,98% 99,98% 99,95% 99,94% 99,95% 99,93% 99,98%
Precisione 99,29% 98,83% 98,58% 97,17% 97,88% 98,58% 99,53%
Accuratezza 99,96% 99,97% 99,90% 99,89% 99,90% 99,87% 99,96%
Assistenza tecnica
Per assistenza generale su questo protocollo contattate support@omixon.com
Supporto telefonico
+1 (617) 500-0790
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 12 │ 58Apparecchiature, reagenti e forniture
Raccomandazioni tecniche e sulle apparecchiature
▪ Termociclatore con blocco a 96 pozzetti
▪ Fluorimetro per piastre (o qualsiasi strumento in grado di rilevare fluorescenza da piastra
a 96 pozzetti, da utilizzare in combinazione con il sistema Promega QuantiFluor dsDNA)
▪ Pippin Prep (Cat# PIP0001) o Blue Pippin (Cat# BLU0001) della SAGE Science
▪ Strumento per qPCR con formato per piastre a 96 o 384 pozzetti
▪ Fluorimetro Qubit (n. cat. Q33216, Thermo Fisher Scientific) (opzionale)
▪ Illumina MiSeq (n. cat. SY-410-1003) o MiniSeq (n. cat. SY-420-100)
▪ PC 64-bit con min. 4 core e 16 GB di RAM
▪ Spazio di archiviazione dati a lungo termine (circa 2 TB di dati per MiSeq/MiniSeq all’anno)
Raccomandazioni sui reagenti associati
▪ Master mix Promega GoTaq 2X Long PCR (n. cat. M402A)
▪ Ogni campione richiede 49 µL di master mix Promega GoTaq per 7 loci
▪ QuantiFluor dsDNA System della Promega (n. cat. E2670)
▪ Biglie Agencourt AMPure XP della Beckman Coulter (n. cat. A63880, A63881 o A63882)
▪ Ogni sequenziamento Holotype HLA richiede un massimo di 3440 µL di biglie AMpure
XP
▪ Il n. cat. A63880 contiene 5 mL di biglie AMPure XP
▪ Il n. cat. A63881 contiene 60 mL di biglie AMPure XP
▪ Il n. cat. A63882 contiene 450 mL di biglie AMPure XP
▪ Cassetta gel, 1,5% di agarosio, senza colorante con standard interno (Marker K/R2), per
Pippin Prep/Blue Pippin (n. cat. CDF1510 per Pippin Prep e BDF1510 per Blue Pippin)
(opzionale)
▪ Kit per Quantificazione Libreria – Illumina/Universal della KAPA Biosystems (n. cat. KK4824)
▪ Kit per Saggi Qubit dsDNA BR (n. cat. Q32850 o Q32853) (opzionale)
▪ Il n. cat. Q32850 contiene 100 saggi
▪ Il n. cat. Q32853 contiene 500 saggi
▪ 1 X Tris-EDTA (pH 8,0)
▪ Tween 20 Etanolo puro per uso in biologia molecolare (alcol anidro)
▪ Acqua per uso in biologia molecolare (priva di DNasi e RNasi)
▪ Idrossido di sodio 10N
▪ Kit Reagenti MiSeq o Kit Reagenti MiniSeq della Illumina
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 13 │ 58Capacità Kit Reagenti MiSeq
Kit reagenti Tempo Campioni
Illumina MiSeq Ore 96/7
Std 500 Cycle
~39 96
(MS-102-2003)
Std 300 Cycle
~24 96
(MS-102-2002)
Micro 300 Cycle
~19 24
(MS-103-1002)
Nano 500 Cycle
~28 12
(MS-103-1003)
Nano 300 Cycle
~17 6
(MS-103-1001)
Capacità Kit Reagenti MiniSeq
Tempo Campioni
Kit reagenti Illumina MiniSeq
Ore 96/7
High throughput 300 Cycles
~24 96
(FC-420-1003)
Attrezzature consigliate
▪ Provette per microcentrifuga da 1,5 mL
▪ Provette low-bind per microcentrifuga da 1,5 mL (raccomandata Eppendorf DNA LoBind n.
cat. 0030108051)
▪ Provette low-bind per microcentrifuga da 2,0 mL (raccomandata Eppendorf DNA LoBind n.
cat. 0030108078)
▪ Provette a parete sottile da 0,5 mL per lo strumento Qubit (raccomandate Qubit Assay
tubes Cat# Q32856)
▪ Pipette a volume regolabile (capacità 1,0 – 1000 µL)
▪ Pipette 8 canali a volume regolabile (capacità 1,0 – 100 µL)
▪ Piastre a 96 pozzetti compatibili con il termociclatore
▪ Piastre ottiche a 96 pozzetti compatibili con il fluorimetro per piastre o con lo strumento
per qPCR
▪ Pellicole sigillanti per piastre compatibili con i termociclatori (testate per long range PCR)
▪ Pellicole sigillanti per piastre ottiche compatibili con lo strumento per qPCR
▪ Supporto magnetico per provette da microcentrifuga da 2 mL
▪ Rack refrigeranti a 96 pozzetti (2 pezzi)
▪ Provette coniche da 50 mL
▪ Reservoir da 50 mL
Omixon Holotype HLA 96/7 – Configurazione A/B/C & CE v2 Istruzioni d’uso. Per uso diagnostico in vitro.
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 14 │ 58Avviso legale Le IFU relative a Holotype HLA 96/7 e il rispettivo contenuto sono di proprietà di Omixon Biocomputing Limited (“Omixon”), e sono destinati unicamente all'uso del prodotto o prodotti ivi descritti da parte del cliente come previsto dal contratto e a nessun altro scopo. Il presente documento e il suo contenuto non dovranno essere utilizzati né distribuiti per nessun altro scopo né divulgati, descritti o riprodotti in altro modo senza il consenso scritto di Omixon. Con il presente documento, Omixon non trasferisce alcuna licenza di sfruttamento del suo brevetto, marchio, copyright, né alcun diritto tutelato dalla legge o diritti simili di terze parti. L’utilizzo di Omixon Holotype o di Monotype HLA (inclusi il software e i saggi) è regolato dai Termini e condizioni dei prodotti Omixon (www.omixon.com/supply-agreement/), che fanno riferimento alla Omixon HLA Twin EULA (www.omixon.com/hla-twin-eula/). L’utilizzo del solo software Omixon HLA Twin è regolato dalla Omixon HLA Twin EULA (www.omixon.com/hla-twin-eula/). L’utilizzo del solo software Omixon HLA Explore è regolato dalla Omixon HLA Explore EULA (www.omixon.com/hla-explore-eula/). Le istruzioni fornite nel presente documento devono essere osservate scrupolosamente ed esplicitamente da personale qualificato e opportunamente addestrato per garantire l'uso corretto e sicuro dei prodotti qui descritti. Prima di utilizzare tali prodotti, il presente documento deve essere letto e compreso in tutte le sue parti. QUALORA IL DOCUMENTO NON VENGA LETTO INTEGRALMENTE E OSSERVATO ESPLICITAMENTE, TUTTE LE ISTRUZIONI IN ESSO CONTENUTE POSSONO COMPORTARE DANNEGGIAMENTO DEI PRODOTTI, LESIONI ALLE PERSONE, INCLUSI UTILIZZATORI O TERZE PERSONE, E DANNI AD ALTRE PROPRIETÀ. OMIXON NON SI ASSUME ALCUNA RESPONSABILITÀ DERIVANTE DA UN USO IMPROPRIO DEI PRODOTTI DESCRITTI QUI (INCLUSE LORO PARTI O SOFTWARE) O DA QUALSIASI USO DI ESSI NON PREVISTO DALLE AUTORIZZAZIONI E PERMESSI SCRITTI ED ESPLICITI CONCESSI DA OMIXON IN RELAZIONE ALL'ACQUISIZIONE DI TALI PRODOTTI DA PARTE DEL CLIENTE. PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO © 2019 Omixon Biocomputing Ltd. Tutti i diritti riservati. Omixon Holotype HLA 96/7 – Configurazione A/B/C & CE v2 Istruzioni d’uso. Per uso diagnostico in vitro. Copyright© 2020, Omixon Biocomputing Ltd. Proprietario e riservato Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 15 │ 58
Destinazione d’uso I prodotti Holotype HLA 96/7 – Configurazione A & CE v2, Configurazione B & CE v2 e Configurazione C & CE v2 (designati “Holotype HLA”) sono reagenti per test diagnostici in vitro progettati per essere utilizzati in combinazione con il software IVD certificato CE Omixon HLA Twin per l'identificazione e la definizione degli antigeni leucocitari umani (HLA) di classe I e II e per la tipizzazione HLA con l’impiego delle piattaforme di sequenziamento di nuova generazione (Next Generation Sequencing, NGS) Illumina® MiSeq e MiniSeq. Holotype HLA fornisce informazioni sull’istocompatibilità umana dei loci HLA di classe I (A, B e C) e II (DPB1, DQA1, DQB1 e DRB1) impiegando DNA genomico umano. Il software Omixon HLA Twin™ incluso nel prodotto Holotype HLA serve a interpretare e conciliare i dati di sequenziamento generati sui sistemi Illumina MiSeq e MiniSeq, consentendo una precisa tipizzazione HLA a livello allelico in un solo passaggio, con percentuale di ambiguità molto bassa al 2° campo. Il prodotto Holotype HLA è previsto per uso diagnostico in vitro da parte di operatori sanitari, come tecnici di laboratorio e medici, preparati nel campo della tipizzazione HLA in laboratori diagnostici accreditati EFI o ASHI o in grado di lavorare in accordo con le specifiche EFI o ASHI. Nota importante prima di iniziare Raccomandazione circa l’estrazione di DNA genomico Il DNA genomico umano dovrà essere isolato dal sangue periferico, dai globuli bianchi o dalla saliva utilizzando kit commerciali per la preparazione del DNA ben collaudati che garantiscano la coerenza della preparazione. Indipendentemente dall'approccio, per avere risultati solidi è necessario che la concentrazione e la purezza siano determinate in modo accurato. Il DNA dev'essere privo di contaminanti che possano successivamente influenzarne l’amplificazione, la preparazione delle librerie e le fasi di sequenziamento (es. alcol, sali, tensioattivi, formaldeide ed eparina). Il sangue non va raccolto in provette eparinizzate e non si dovranno utilizzare campioni di sangue provenienti da pazienti in terapia con eparina né campioni lipemici o emolizzati. Il DNA genomico estratto può essere usato immediatamente se disciolto in acqua priva di nucleasi, o conservato per lunghi periodi a -20 °C o a temperature inferiori. Si consiglia l’uso di acqua per la preparazione del gDNA, poiché l’EDTA nel buffer TE può inibire le reazioni della PCR long-range. Per ridurre la degradazione vanno evitati cicli ripetuti di gelo-disgelo. Al fine di ottenere 100-150 ng di DNA genomico di partenza per ogni amplificazione mediante PCR, è altamente raccomandata una concentrazione pari a 20-30 ng/µL di DNA. È raccomandato l’impiego di un metodo di quantificazione mediante fluorescenza al fine di determinare la concentrazione di gDNA. Sono altamente raccomandati valori del rapporto di assorbanza di 260 nm/280 nm e 260 nm/230 nm pari a 1,7–2. Omixon Holotype HLA 96/7 – Configurazione A/B/C & CE v2 Istruzioni d’uso. Per uso diagnostico in vitro. Copyright© 2020, Omixon Biocomputing Ltd. Proprietario e riservato Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 16 │ 58
Per l’amplificazione di HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 e HLA-DQB1, sono
richiesti 500-960 ng di gDNA per ogni campione.
Termociclatori validati
I prodotti Holotype HLA 96/7 – Configurazione A/B/C & CE v2 sono stati validati con i seguenti
termociclatori: Termociclatore ABI 9700 GeneAmp e ABI Veriti a 96 pozzetti. La velocità di rampa
è impostata a Max su entrambe le macchine.
Principio del metodo
Per molti anni, la comunità HLA ha lavorato allo sviluppo di un metodo per caratterizzare con
precisione l'elevato polimorfismo dei geni HLA e dei loro prodotti. L'avvento della PCR, combinata
con altre tecnologie (sequenziamento di Sanger, SSOP, SSP, Luminex), ha consentito di migliorare
significativamente il rilevamento di polimorfismi HLA, sebbene con diverse limitazioni che
impediscono di caratterizzare esaurientemente i geni HLA. Le tecnologie sviluppate nel corso
degli ultimi anni, designate collettivamente sequenziamento di nuova generazione (NGS), hanno
offerto nuove opportunità che consentono la caratterizzazione completa dei geni HLA in modalità
aploide. L'NGS ha due caratteristiche importanti: 1) il sequenziamento clonale di frammenti di
DNA, e 2) la produttività elevatissima. L'NGS consente di stabilire la fase dei polimorfismi,
eliminando così tutte le ambiguità, e consente la tipizzazione HLA al 3° o 4° campo senza test
reflex, in tal modo introducendo un approccio potenzialmente risolutivo al problema della
tipizzazione HLA. Il protocollo qui descritto sfrutta questa tecnologia e combina l’amplificazione
mediante long-range PCR di geni HLA con il sequenziamento sulle piattaforme Illumina MiSeq o
MiniSeq. Più in particolare, i geni HLA A, B, C, DQA1 e DQB1 vengono amplificati per l'intera
lunghezza codificante, incluse le UTR delle estremità 5’ e 3’, mentre il gene DRB1 viene
amplificato dall'introne 1 all'introne 4 e il gene DPB1 viene amplificato dall'introne 1 alla regione
UTR 3’. Gli ampliconi vengono quindi processati attraverso una serie di fasi:
1. frammentazione degli ampliconi a una dimensione appropriata per il sequenziamento sulla
piattaforma Illumina,
2. riparazione blunt-end e adenilazione delle estremità degli ampliconi frammentati
3. ligazione di sequenze adattatrici che vengono usate nell'intero processo sul MiSeq o sul
MiniSeq per catturare, amplificare e sequenziare il DNA. Gli adattatori includono anche un
indice costituito da una breve sequenza, univoca per ciascun adattatore, che identifica il
materiale di partenza della libreria (campione/locus).
Dopo la combinazione delle librerie indicizzate in un unico pool, la selezione dimensionale e la
quantificazione, il campione viene caricato sul MiSeq o sul MiniSeq per il sequenziamento.
L'intero processo richiede meno di 48 ore, a seconda della scelta del tipo di cella a flusso della
piattaforma Illumina. I dati generati sono analizzati con due algoritmi diversi in HLA Twin™
(www.omixon.com). L’uso di due algoritmi indipendenti in HLA Twin fornisce il più elevato livello
di affidabilità, affinché i risultati della genotipizzazione HLA possano essere riportati
immediatamente senza ulteriori verifiche. I campioni con genotipizzazioni dubbie o ambigue
vengono contrassegnati dal software per essere analizzati manualmente.
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 17 │ 58Sommario delle Fasi
PREPARAZIONE DEL GDNA AMPLIFICAZIONE
PREPARAZIONE MASTER MIX HLA CLASSE I E II
TEMPO NECESSARIO: 1 h 20 min, TEMPO NECESSARIO: 1 h 30 min,
TEMPO TOTALE: 1 h 20 min TEMPO TOTALE: 7 h 30 min
NORMALIZZAZIONE E
QUANTIFICAZIONE AMPLICONI PREPARAZIONE LIBRERIA
TEMPO NECESSARIO: 1 h 50 min, TEMPO NECESSARIO: 1 h 20 min,
TEMPO TOTALE: 1 h 50 min TEMPO TOTALE: 2 h 35 min
SCELTA DELLE DIMENSIONI QUANTIFICAZIONE LIBRERIA
DELLA LIBRERIA
TEMPO NECESSARIO: 1 h 20 min, TEMPO NECESSARIO: 0 h 15 min,
TEMPO TOTALE: 1 h 20 min TEMPO TOTALE: 1 h 15 min
SEQUENZIAMENTO SU ANALISI DATI
ILLUMINA MISEQ DI SEQUENZIAMENTO HLA
TEMPO NECESSARIO: 0 h 20 min, TEMPO NECESSARIO: 0 h,
TEMPO TOTALE: 23 h TEMPO TOTALE: 6 h
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 18 │ 58Glossario/Definizioni
▪ Piastra ampliconi – Nome alternativo della piastra di amplificazione.
▪ Piastra quantificazione ampliconi – piastra a 96 pozzetti compatibile con il fluorimetro per
piastre in cui gli ampliconi diluiti vengono quantificati.
▪ Piastra amplificazione – Piastra a 96 pozzetti per PCR usata per amplificare i loci HLA.
▪ Pool di ampliconi purificati – Piastra contenente tutti gli ampliconi combinati dopo la
purificazione basata sulle biglie.
▪ Libreria campioni – Una libreria preparata combinando in pool tutti i loci HLA per un dato
campione
▪ Piastra di reazione – Piastra in cui vengono condotte le successive reazioni di frammentazione,
riparazione blunt-end/adenilazione e ligazione degli adattatori indicizzati alle librerie
campioni
▪ Piastra reagenti – Serve per dosare i vari reagenti usati per preparare le librerie dei
campioni.
▪ Libreria finale – Libreria che include tutte le librerie campioni pronte per essere sequenziate
in una singola corsa su MiSeq o su MiniSeq.
▪ Piastra quantificazione standard – Piastra a 96 pozzetti compatibile con il fluorimetro per
piastre o con una macchina per qPCR in cui vengono posti gli standard di DNA per
consentire la quantificazione degli ampliconi.
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 19 │ 58Fase 0 – Normalizzazione del DNA genomico
Durata: ~20 minuti
Fare riferimento al Workbook: scheda “Preparazione del gDNA”
Isolare il gDNA dal sangue periferico, dai globuli bianchi o dalla saliva. Il gDNA deve essere dissolto
in acqua o buffer a basso TE, poiché l’EDTA nel buffer ad alto TE può inibire le reazioni della PCR
long-range, e la concentrazione raccomandata è 20-30 ng/µL. È altamente raccomandato
l’impiego di un metodo di quantificazione mediante fluorescenza al fine di determinare la
concentrazione di gDNA.
La sua qualità, valutata mediante spettrofotometria, deve essere:
1. Rapporto di assorbanza 260 nm/280 nm tra 1,7 e 1,9.
2. Rapporto di assorbanza 260 nm/230 nm pari o superiore a 1,7.
3. Degradazione minima. Il DNA vecchio o sottoposto a ripetuti cicli di congelamento e
scongelamento presenta una degradazione maggiore.
Per l’amplificazione di HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 e HLA-DQB1, sono
richiesti 500-960 ng di gDNA per ogni campione.
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 20 │ 58Fase 1 – Preparazione master mix per amplificazione
HLA
Durata: ~15 minuti
Fare riferimento al Workbook: scheda “Preparazione PCR”
Lo scopo di questa fase è preparare master mix locus-specifiche per amplificare individualmente
ognuno dei locus HLA desiderati. I loci amplificati per mezzo di questo protocollo sono HLA-A,
HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 e HLA-DQB1.
Elenco reagenti
Componente Conservazione Provenienza
Primer mix HLA-A -20 °C Omixon
Primer mix HLA-B -20 °C Omixon
Primer mix HLA-C -20 °C Omixon
Primer mix HLA-DRB1 -20 °C Omixon
Primer mix HLA-DPB1 -20 °C Omixon
Primer mix HLA-DQA1 -20 °C Omixon
Primer mix HLA-DQB1 (serie 3) -20 °C Omixon
Enhancer 1 -20 °C Omixon
Master mix Promega GoTaq 2X Long PCR -20 °C Promega
H2O per uso in biologia molecolare Temperatura ambiente Utilizzatore
Protocollo
1.1 – Prelevare tutte le miscele di primer, l’Enhancer 1 e le master mix Promega GoTaq 2X Long
PCR dal luogo di conservazione e lasciare scongelare a temperatura ambiente.
Nota: La Taq polimerasi nella master mix Promega GoTaq 2X Long PCR è un enzima
con avviamento a caldo, pertanto non è necessario tenere la master mix su ghiaccio.
1.2 – Agitare mediante vortex tutte le miscele di primer e le master mix Promega GoTaq 2X
PCR per 5 secondi, quindi centrifugare per 5 secondi (centrifuga breve). – Preparare una
master mix per ciascuna primer mix secondo le tabelle riportate di seguito (per meno di 96
campioni, utilizzare il Workbook Excel per calcolare i volumi):
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 21 │ 58Master mix: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 e DQA1
Reagente Volume/campione/ Volume/96
locus campioni/locus
H2O per uso in biologia molecolare 7,5 µL 750 µL
Master mix Promega GoTaq 2X PCR 7 µL 700 µL
Primer mix 1,5 µL 150 µL
Volume totale 16 µL 1600 µL
Master mix: HLA-DQB1 serie 3
Reagente Volume/campione/ Volume/96
locus campioni/locus
H2O per uso in biologia molecolare 5,5 µL 550 µL
Master mix Promega GoTaq 2X PCR 7 µL 700 µL
Enhancer 1 2 µL 200 µL
Primer mix 1,5 µL 150 µL
Volume totale 16 µL 1600 µL
1.3 – Agitare mediante vortex ciascuna master mix per 5 secondi e centrifugare per 5 secondi
(centrifuga breve).
1.4 – Diluire tutti i gDNA fino a una concentrazione di 20-30 ng/µL (il volume minimo è 32 µL
per campione).
Nota: Holotype HLA include reagenti sufficienti per 96 reazioni più un volume
addizionale per compensare perdite di pipettamento e amplificazioni fallite.
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 22 │ 58Fase 2 – Amplificazione HLA classe I e II
Durata: ~6 ore e 30 minuti
Fare riferimento al Workbook: scheda “Mappe piastre”
Lo scopo della Fase 2 è amplificare i loci HLA. Le amplificazioni di HLA classe I e classe II sono state
ottimizzate utilizzando due set distinti di condizioni PCR. Una volta completate le reazioni di PCR,
l’amplificazione viene verificata mediante elettroforesi su gel di agarosio (opzionale).
Suggerimento – Benché l’elettroforesi su gel di agarosio sia raccomandata, non è
necessaria per completare con successo il protocollo Holotype HLA. Nella fase di
quantificazione degli ampliconi (Fase 3), qualsiasi concentrazione superiore a
50 ng/µL è considerata un’amplificazione riuscita. L’elettroforesi su gel di agarosio
rappresenta una fase importante di controllo della qualità e non deve essere omessa
se non si ha sufficiente esperienza con il protocollo completo Holotype HLA.
Elenco reagenti
Componente Conservazione Provenienza
Master mix HLA-A -20 °C Fase 1
Master mix HLA-B -20 °C Fase 1
Master mix HLA-C -20 °C Fase 1
Master mix HLA-DRB1 -20 °C Fase 1
Master mix HLA-DPB1 -20 °C Fase 1
Master mix HLA-DQA1 -20 °C Fase 1
Master mix HLA-DQB1 (serie 3) -20 °C Fase 1
gDNA 4 °C Utilizzatore
Protocollo
2.1 – Aggiungere aliquote di 16 µL di ciascuna master mix nelle singole posizioni delle piastre
PCR a 96 pozzetti.
Nota: Le amplificazioni di classe I e classe II sono state ottimizzate utilizzando due
programmi di PCR differenti, quindi le master mix di classe I e classe II non dovranno
essere poste nella stessa piastra.
2.2 – Aggiungere 4 µL di ciascun gDNA diluito nel pozzetto appropriato delle piastre preparate
nella fase precedente. Miscelare mediante pipettamento.
2.3 – Sigillare la piastra con una pellicola termica e ispezionare visivamente ciascun pozzetto.
Centrifugare tutte le piastre per amplificazione in una centrifuga per 5 secondi (centrifuga
breve).
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 23 │ 582.4 – Posizionare le piastre per amplificazione nel termociclatore ed avviare i programmi per
amplificazione di classe I e classe II come indicato nelle tabelle riportate sotto:
Amplificazione classe I (HLA-A, B e C)
Numero di cicli Temperatura Tempo
1 95 °C 2 minuti
95 °C 15 secondi
40 65 °C 30 secondi
68 °C 4 minuti
1 68 °C 10 minuti
1 4 °C ∞
Amplificazione classe II (HLA-DRB1, DPB1, DQA1 e DQB1)
Numero di cicli Temperatura Tempo
1 95 °C 2 minuti
95 °C 15 secondi
40 65 °C 30 secondi
68 °C 8 minuti
1 68 °C 10 minuti
1 4 °C ∞
Nota: Verificare il buon esito dell'amplificazione facendo correre 2 µL di ciascun
amplicone in un gel di agarosio standard al 2% a 250 V per 30 minuti. (Opzionale)
Dimensioni previste ampliconi
Locus HLA Dimensioni previste ampliconi (kb)
HLA-A, B e C ~3
HLA-DRB1 ~4,3
HLA-DPB1 ~6,6
HLA-DQA1 ~5,5
HLA-DQB (serie 3) ~6,5
È possibile interrompere la metodica in modo sicuro in questa fase. Gli ampliconi
possono essere conservati a 4 °C per una notte o a -20 °C fino a 3 mesi.
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 24 │ 58Fase 3 – Quantificazione e normalizzazione ampliconi
(per piastre con capacità di 200 µL)
Durata: ~40 minuti
Fare riferimento al Workbook: scheda “Quantificazione ampliconi”
Si raccomanda di eseguire la quantificazione e normalizzazione ampliconi per garantire la
precisione della quantità di materiale di partenza nelle fase di preparazione della libreria. La
concentrazione degli ampliconi viene misurata utilizzando il sistema QuantiFluor dsDNA, che
contiene un colorante fluorescente in grado di legarsi al DNA ed uno standard di DNA per la
quantificazione precisa di piccole quantità di DNA a doppio filamento (dsDNA). Per istruzioni su
come effettuare la quantificazione di ampliconi utilizzando uno strumento per qPCR consultare
l'Appendice 2.
Elenco reagenti
Componente Conservazione Provenienza
Piastra amplificazione classe I 4 °C Fase 2
Piastra amplificazione classe II 4 °C Fase 2
Standard di Lambda DNA (100 ng/µL) 4 °C Promega
Colorante QuantiFluor dsDNA (200×) 4 °C Promega
Tampone TE 20× (pH 7,5) 4 °C Promega
H2O per uso in biologia molecolare 20 °C – 25 °C Utilizzatore
Protocollo
3.1 – Preparare gli standard di DNA mediante diluizione seriale dello standard di Lambda DNA
(100 ng/µL) fornito nel kit QuantiFluor secondo la tabella di diluizione riportata sotto:
Etichetta sulla DNA di Vol. di DNA Vol. di TE 1x Conc. finale (ng/µL)
provetta partenza (µL) (µL)
Standard 1 Lambda DNA 7,5 µL 492,5 µL 1,5 ng/µL
Standard 2 Standard 1 250 µL 250 µL 0,75 ng/µL
Standard 3 Standard 2 250 µL 250 µL 0,38 ng/µL
Standard 4 Standard 3 250 µL 250 µL 0,19 ng/µL
Standard 5 Standard 4 250 µL 250 µL 0,09 ng/µL
Standard 6 Standard 5 250 µL 250 µL 0,05 ng/µL
Bianco Bianco 0 µL 250 µL 0 ng/µL
3.2 – Preparare le piastre per quantificazione ampliconi (vedere figure supplementari).
Aggiungere aliquote di 99 µL di tampone TE 1× a ciascun pozzetto della piastra ottica a 96
pozzetti per il numero totale di ampliconi da quantificare.
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 25 │ 583.3 – Aggiungere 1 µL di amplicone di ciascun pozzetto delle piastre ampliconi ai pozzetti
corrispondenti delle piastre per quantificazione ampliconi. Miscelare mediante
pipettamento.
3.4 – Preparare una soluzione di lavoro di QuantiFluor Dye 1× utilizzando la formula seguente:
0,5 µL di QuantiFluor Dye (200X) + 99,5 µL di tampone TE 1×. Preparare sufficiente
QuantiFluor Dye 1× affinché ciascun campione (di tutti quelli nelle piastre ampliconi) e
standard (in totale 14) riceva un'aliquota pari a 100 µL.
3.5 – Preparare una piastra per quantificazione standard e piastre per quantificazione
ampliconi. Aggiungere aliquote di 100 µL di soluzione di lavoro di QuantiFluor Dye 1× nelle
varie posizioni delle piastre ottiche a 96 pozzetti che si useranno come piastra
quantificazione standard e alle piastre quantificazione ampliconi preparate nella fase 3.2.
3.6 – Utilizzando gli standard preparati sopra, aggiungere 100 µL di ciascuno standard, in
duplicato, a pozzetti individuali nella piastra quantificazione standard (totale 14 pozzetti).
Miscelare mediante pipettamento.
3.7 – Miscelare agitando accuratamente mediante vortex (per 5 secondi) e centrifugare
(centrifuga breve).
3.8 – Effettuare la lettura della piastra quantificazione standard e delle piastre quantificazione
ampliconi sul fluorimetro o sulla macchina per qPCR. Sulla macchina per qPCR, utilizzare il
seguente programma (potrebbe essere necessario modificare le impostazioni a seconda
del produttore della macchina per qPCR):
Numero di cicli Temperatura Tempo
1 25 °C 10 secondi
25 °C 15 secondi
2 25 °C 30 secondi (acquisizione dati)
3.9 – Calcolare la concentrazione di DNA nelle piastre quantificazione ampliconi utilizzando i
valori di RFU generati dal fluorimetro per piastre o dalla macchina per qPCR. Fare
riferimento alla tabella diluizione nel workbook fornito per assistenza nei calcoli.
3.10 – Diluire il DNA nelle piastre ampliconi con H2O per uso in biologia molecolare in modo che
la concentrazione finale di DNA sia approssimativamente nell’intervallo 50-120 ng/µL.
▪ Se la concentrazione di DNA è 180 ng/µL o maggiore: aggiungere 20 µL di H2O
▪ Se la concentrazione di DNA è 115-180 ng/µL: aggiungere 10 µL di H2O
▪ Se la concentrazione di DNA è minore di 115 ng/µL: non aggiungere H 2O
È possibile interrompere la metodica in modo sicuro in questa fase. Gli ampliconi
possono essere conservati a 4 °C per una notte o a -20 °C fino a 3 mesi.
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Versione protocollo: v3.0.1; versione documento: v01 Pagina 26 │ 58Puoi anche leggere
