Glutamate Food ELISA Kit (FCE-3700) - Test ELISA per rilevazione di glutammato in campioni alimentari Cat. # LFD052 - Generon
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Glutamate Food ELISA Kit (FCE-3700) Test ELISA per rilevazione di glutammato in campioni alimentari Cat. # LFD052 Manuale d’uso – Glutamate Food ELISA Kit - Rev. 0 – 06/06/2019 1
1 – Descrizione del kit
Il Kit è un saggio immunoenzimatico competitivo per l’analisi quantitativa di L-glutammato in campioni alimentari.
Dopo la derivatizzazione il glutammato viene quantitativamente determinato con il metodo ELISA.
Il kit utilizza il formato della micropiastra in cui l’antigene è immobilizzato sulla base dei micropozzetti. Gli standard, i controlli e i
campioni derivatizzati insieme all’analita legato alla fase solida competono per un numero fisso di siti di legame dell’antisiero.
Quando il sistema è in equilibrio, l’antigene libero e il complesso antigene-antisiero libero vengono rimossi attraverso una fase di
lavaggio. L’anticorpo legato alla fase solida è rilevato con un anti IgG di coniglio coniugato alla perossidasi. La reazione tra substrato
TMB e perossidasi viene monitorata a 450 nm. La quantificazione dei campioni a contaminazione sconosciuta si ottiene dal confronto
con campioni a concentrazione nota.
2 – Contenuto del kit e Conservazione
Conservare i reagenti a 2 – 8 °C fino alla data di scadenza. Non usare i componenti dopo la data di scadenza indicata sulle
etichette. Non mescolare componenti provenienti da lotti di kit diversi in un unico test.
Componenti del kit Quantità Conservazione
Piastra di reazione 1 x 96-pozzetti
Strip con glutammato 12 x 8-pozzetti
A (0 ppm, 0 μmol/l) 4 ml
B (0.6 ppm, 4.08 μmol/l) 4 ml
C (2 ppm, 13.6 μmol/l) 4 ml
glutammato
D (6 ppm, 40.8 μmol/l) 4 ml
Standard di
E (20 ppm, 136 μmol/l) 4 ml
F (60 ppm, 408 μmol/l) 4 ml
Controllo 1 4 ml
Controllo 2 4 ml
2 – 8 °C
Soluzione di lavaggio 50X 20 ml
Soluzione di stop (contiene 0.25 M H2SO4) 12 ml
Substrato TMB 12 ml
Anticorpo per glutammato (da coniglio) 6 ml
Buffer di reazione 20 ml
Reagente equalizzatore 1 liofilizzato
Reagente D 4 ml
Buffer Q 20 ml
Enzima coniugato (IgG anti-coniglio coniugate alla
12 ml
perossidasi)
Nota: Glutammato (ppm) x 6.8 = Glutammato (μmol/l)
3 – Caratteristiche del saggio
Sostanza Cross-reattività (%)
Glutammato 100
Glutammina < 0.01
Specificità analitica (cross- Aspartato 0.09
reattività) Glicina < 0.01
Alanina < 0.01
Acido 5-aminovalerico < 0.01
LOD (limite di rilevazione)
0.3 μg/ml Segnale medio (standard zero) – 2SD
Precisione
Intra-saggio, n=10 Inter-saggio, n=5
Campione Range (μg/ml) CV (%) Range (μg/ml) CV (%)
1 97 ± 2.5 2.6 98 ± 4.9 5
Campione Range (%) di Recupero dopo spiking Media (%) di Recupero dopo spiking
Zuppa 97 - 102 100
Manuale d’uso – Glutamate Food ELISA Kit - Rev. 0 – 06/06/2019 25 – Materiali richiesti non forniti nel kit
• Lettore di piastre (450 nm)
• Pipette e puntali
• Tubi
• Carta assorbente
• Acqua distillata
• Vortex
• Agitatore a 600 rpm e ampiezza di 3 mm
• Lavatore di piastre (opzionale)
6 – Avvertenze e Precauzioni
Affidabilità dei risultati: per assicurare una valutazione affidabile dei risultati del test, il saggio deve essere condotto secondo le
indicazioni riportate nel manuale e in accordo con le regole e linee guida correnti (ad esempio GLP, etc.). Prestare particolare
attenzione ai controlli per valutare precisione e correttezza dell’esecuzione del test; i risultati di questi controlli devono essere
all’interno del range normale. In caso di discrepanze significative tra le caratteristiche pre-set di questo test e i risultati effettivi,
contattare il produttore del kit per ulteriori istruzioni.
Reclami: in caso di reclami, inviare al produttore una relazione scritta contenente tutti i dati relativi al modo in cui è stato condotto il
test, i risultati ottenuti e una copia del rapporto di prova originale. Si prega di contattare il produttore per ottenere un modulo di
reclamo e restituirlo completamente compilato al produttore.
Garanzia: questo kit è stato prodotto secondo gli ultimi sviluppi tecnologici e sottoposto a severi controlli interni ed esterni per il
controllo di qualità. Eventuali alterazioni del kit o della procedura di test, nonché l'utilizzo di reagenti diversi possono avere un'influenza
negativa sui risultati del test e pertanto non sono coperti da garanzia. Il produttore non è responsabile per i danni subiti durante il
trasporto.
Smaltimento: le sostanze residue e/o tutti i restanti prodotti chimici, reagenti e soluzioni pronte all'uso sono rifiuti speciali. Lo
smaltimento è soggetto alle leggi e ai regolamenti della federazione e dei paesi. Sulla rimozione di rifiuti speciali far riferimento alle
autorità responsabili o alle imprese di smaltimento. Lo smaltimento del kit deve essere effettuato secondo le norme ufficiali nazionali.
La base legale per lo smaltimento di rifiuti speciali è il ciclo economico e la legge sui rifiuti.
Le schede di sicurezza appropriate dei singoli prodotti sono disponibili sulla homepage. Le schede di sicurezza corrispondono allo
standard: ISO 11014-1.
Interferenze: Non mescolare reagenti di lotti diversi. Considerare condizioni di trasporto e conservazione differenti. Maneggiare in
maniera impropria il kit o deviazioni dal protocollo possono influenzare i risultati. Non utilizzare componenti del kit dopo la data di
scadenza. Evitare contaminazione microbiologica dei reagenti e dell’acqua. Considerare i tempi di incubazione e le indicazioni per
i lavaggi.
Precauzioni: Non pipettare con la bocca ed evitare il contatto dei reagenti con la pelle. Non fumare, mangiare o bere in aree dove
vengono maneggiati reagenti e campioni. Indossare sempre guanti protettivi e lavare bene le mani il prima possibile dopo aver finito
il lavoro. Evitare di spruzzare sostanze. Evitare il contatto dei reagenti con la pelle. Utilizzare indumenti di protezione e guanti. Utilizzare
pipette calibrate per ottenere risultati ottimali.
7 – Preparazione delle soluzioni e dei reagenti
Portare campioni e reagenti a temperatura ambiente (20 – 25°C) prima dell’uso.
• Preparare i reagenti di cui si necessita appena prima dell’esecuzione del test.
• Si consiglia di eseguire il test in duplicato.
• Mescolare tutti i reagenti invertendoli e agitandoli delicatamente prima dell’uso. Preparare solo i volumi necessari all’analisi
che si sta per eseguire. Non rimettere i reagenti nei contenitori originali. Si consiglia di utilizzare contenitori monouso per la
preparazione dei reagenti al fine di minimizzare il rischio di contaminazione.
Soluzione di lavaggio 1X: mescolare 1 volume di soluzione di lavaggio 50X con 49 volumi di acqua distillata (per
preparare tutta la soluzione diluire i 20 ml di soluzione concentrata in 1 l di acqua distillata e conservare a 2 – 8
°C per massimo 6 mesi).
Reagente equalizzatore: ricostituire il reagente equalizzatore con 12.5 ml di Buffer di reazione.
Il reagente equalizzatore che non deve essere utilizzato subito deve essere conservato in aliquote a -20°C e deve
essere scongelato solo una volta.
Manuale d’uso – Glutamate Food ELISA Kit - Rev. 0 – 06/06/2019 38 – Preparazione del campione
Portare campioni e reagenti a temperatura ambiente prima dell’uso.
Il seguente protocollo si riferisce alla preparazione di campioni di zuppa. Per altri tipi di campioni alimentari contattare il fornitore
per richiedere un protocollo di preparazione del campione.
1. Pesare 2 g di campione
2. Aggiungere 100 ml di acqua distillata pre-riscaldata a 70 – 80°C
3. Risospendere e incubare per 10 minuti
4. Lasciar raffreddare a temperatura ambiente
5. Aggiungere acqua distillata fino a raggiungere un volume finale di 250 ml.
6. Filtrare su filtro di carta
7. Diluire il filtrato 1:25 con acqua distillata (ad esempio 100 μl di campione + 2.4 ml di acqua distillata)
FATTORE DI DILUIZIONE: 25.
9 – Derivatizzazione
1. Trasferire 25 μl di standard, controlli e campioni diluiti in pozzetti diversi della piastra di reazione
2. Aggiungere 50 μl di reagente equalizzatore in ogni pozzetto
3. Mescolare brevemente
4. Aggiungere 10 μl di Reagente D in ogni pozzetto
5. Incubare per 90 minuti a temperatura ambiente (20 – 25°C) agitando a circa 600 rpm con un agitatore
6. Aggiungere 100 μl di Buffer Q in ogni pozzetto
7. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (20 – 25°C) agitando a circa 600 rpm con un agitatore
10 – Esecuzione del test ELISA
1. Trasferire 25 μl di standard, controlli e campioni derivatizzati in pozzetti diversi della piastra con glutammato
2. Aggiungere 50 μl di antisiero per glutammato in tutti i pozzetti
3. Chiudere la piastra
4. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti agitando a circa 600 rpm con un agitatore
5. Svuotare la piastra
6. Fare 3 lavaggi con 300 μl di soluzione di lavaggio 1X per ogni pozzetto, svuotando la piastra e battendola su carta assorbente
per una volta
7. Battere la piastra più volte su carta assorbente per eliminare completamente la soluzione di lavaggio
8. IMMEDIATAMENTE, aggiungere 100 μl di enzima coniugato in ogni pozzetto
9. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti agitando a circa 600 rpm con un agitatore
10. Svuotare la piastra
11. Fare 3 lavaggi con 300 μl di soluzione di lavaggio 1X per ogni pozzetto, svuotando la piastra e battendola su carta assorbente
per una volta
12. Battere la piastra più volte su carta assorbente per eliminare completamente la soluzione di lavaggio
13. IMMEDIATAMENTE, aggiungere 100 μl di substrato in ogni pozzetto
14. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 ± 2 minuti agitando a circa 600 rpm con un agitatore oppure, se non si
dispone di un agitatore, incubare a temperatura ambiente per 15 ± 2 minuti (evitare l’esposizione alla luce diretta)
15. Aggiungere 100 μl di soluzione di stop e agitare per assicurare una distribuzione omogenea della soluzione
16. Leggere la piastra il prima possibile e comunque entro 10 minuti con un lettore di piastre a 450 nm e con una lunghezza d’onda
di riferimento tra 620 nm e 650 nm.
Manuale d’uso – Glutamate Food ELISA Kit - Rev. 0 – 06/06/2019 411 – Calcolo dei risultati
• Costruire una curva standard mettendo in grafico la media delle assorbanze di ciascuno
standard utilizzato (asse-y) rispetto alla concentrazione (asse-x) in scala logaritmica. Eseguire
un fitting a regressione non lineare (ad esempio spline, 4-parametri, akima).
• A lato un esempio di curva standard. Questa curva NON deve essere utilizzata per i calcoli.
• Utilizzando i valori delle assorbanze di ogni campione e la curva costruita, determinare il valore
da moltiplicare per il fattore di diluizione impiegato nella fase di preparazione del campione
per calcolare la concentrazione di istamina in ppb nel campione. Il valore è 25 nel caso dei
campioni di zuppa.
• Si raccomanda l’utilizzo di campioni di controllo a concentrazione normale ed elevata. I
controlli dovrebbero ricadere nei livelli di confidenza stabiliti e indicati nel CQ.
• Il legame tra anticorpo ed enzima coniugato e l’attività dell’enzima dipendono dalla
temperatura e i coefficienti di estinzione possono variare se non si utilizza un termostato. Più elevata è la temperatura, maggiori
saranno i coefficienti, i quali dipendono anche dal tempo di incubazione. La temperatura ottimale per eseguire il saggio è tra
20 e 25°C.
• In caso di overflow, leggere le assorbanze entro 10 minuti a 405 nm.
12 – Dichiarazione di non responsabilità
Generon S.p.A. non si assume responsabilità di alcun tipo, esplicite o implicite, eccetto garantire che i materiali di cui i propri prodotti
si compongono sono di qualità standard. In caso di materiale difettoso, Generon S.p.A. si impegna a fornire un prodotto sostitutivo.
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direttamente o indirettamente dall’uso di questo prodotto.
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