DALLA RICERCA DI BASE ALLO SVILUPPO DI TERAPIE INNOVATIVE PER LE MALATTIE GENETICHE.
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DALLA RICERCA DI BASE ALLO SVILUPPO DI TERAPIE
INNOVATIVE PER LE MALATTIE GENETICHE.
Prof. Mirko Pinotti
Dip. Scienze della Vita e Biotecnologie
Università di Ferrara
Stati Generali della Ricerca, Piacenza, 1 giugno 2019
In ogni cellula
c’è una libreria
chiamata
DNA
Il DNA (genoma) è una grande biblioteca
distrofina
SMN1
Fattore VIII coagulazione
Le nostre cellule spendono molta energia per impedire danni al DNA ……MA TALVOLTA……….
MUTAZIONI GENICHE ALLA BASE DI PATOLOGIE Normale Mutazione Malattie possono essere dovute a: - difetti in un solo gene (monogeniche) - difetti di più geni
Malattie Ereditarie
Presenti alla nascita e dovute a mutazioni sul DNA (genoma) trasmesse
dai genitori
Anemia mediterranea Distrofia muscolare Fibrosi Cistica
o talassemia di Duchenne
Le malattie ereditarie sono più di 8.000, numerose delle quali sono
rare e poco studiate (malattie orfane)
Ma come fa la cellula ad utilizzare
una mole così grande di informazioni?
3 miliardi di lettere (basi)LA CELLULA COME UNA FABBRICA
UFFICIO PRODUZIONE
PROGETTI
Progetto
riassunto per
la produzione
RNA messaggero Sintesi Proteica
DNA (C’è l’informazione essenziale) (Viene letto il messaggio e
(archivio, grande enciclopedia) sintetizzato il prodotto-proteina
1 grande libro (GENE) per ogni prodotto
1 grande libro (GENE) per ogni prodotto
Mirko Pinotti PersonaleESONE ESONE ESONE Gene (libro grande)
Corretto processamento
Messaggero (riassunto)
Proteina
funzionale
Produzione
Normale funzione fisiologica
Mirko Pinotti Personale+ + - + + +- -
+
Gene (libro grande)
Corretto processamento
Messaggero (riassunto)
Proteina
funzionale
Produzione
Normale funzione fisiologica
Mirko Pinotti PersonaleMutazioni che interferiscono con il +
riconoscimento dell’esone -
* Gene (libro grande)
Messaggero (riassunto)
Proteina alterata
Non funzionale
Produzione
Mirko Pinotti PersonaleLa ricerca è fantasia…. che vi verrebbe in mente di fare? ESONE SALTATO ESONE INCLUSO
La ricerca è fantasia….
che vi verrebbe in mente di fare?
Potenzio
elementi positivi
U1snRNA (+)
(-)
Silenziatori
Interferisco con
elementi negativi
(tolgo il freno)Mutazioni che
interferiscono con il
riconoscimento dell’esone
+ U1snRNA migliorato che
forza inclusione esone
mutato
* *
Corretto processamento
Proteina alterata Proteina
Non funzionale funzionale
Mirko Pinotti PersonaleMa per veicolarlo in vivo???
I Virus come cavallo di troia
n o»
«sa
e ne
G
Vettore virale come veicolo
Del gene terapeutico
Mirko Pinotti PersonaleDallo studio dei microbiologi gli strumenti per la terapia
genica: i vettori virali
Lhretibeau et al, Blood Reviews 2015
AAVAPPROCCI DI TERAPIA GENICA:
EX-VIVO vs IN VIVODifetto ereditario di FVII
TF FVII
causato da mutazione di splicing
FIX FVIII
FVII TF
FX
FV
TROMBINA
Coagulo EmorragiaUna U1 «intelligente» è capace di ripristinare
processamento e produzione della proteina
mancante nel modello animale
hFVII mRNA (RT-PCR) hFVII protein (HI)
pAAV-FVIIwt
pAAV-FVIIwt pAAV-FVII+5A
+
bp M pAAV-U1+5a
h7F h8R
300 a
2 n
200
100
a
1
80 1
n
2
pAAV-FVII+5A
% total hFVII
60
pAAV-U1+5a
40
+
20
0
n= 4 mice/group 1 2 3
Molar ratio U1+5a/FVII+5A=1,5
Balestra et al, JTH 2014ATROFIA MUSCOLARE
SPINALE (SMA)
Causata da mutationi/delezioni
nel gene SMN1 (Survival
motor neuron 1) gene.
SMN1
exon 6 exon 7 exon 8
pre-mRNA
mRNA
Protein
Modified from Burghes et al. Nat.Rev. Neuroscience 2009Terapia genica sostitutiva per
la SMA (2.1 milioni ad iniezione)
Tuttavia sto
inserendo un
gene nuovo
N1
SM
Vettore virale come veicolo
Del gene terapeutico
Mirko Pinotti PersonalePossiamo «inventare» altre
strategie?
Magari agendo sullo «splicing»
come mostrato prima?SMA: l’evoluzione ci ha fornito
una via terapeutica alternativa
Causata da mutationi/delezioni Nel genoma umano sono presenti una o più
nel gene SMN1 (Survival copie di uno pseudogene (SMN2) che è quasi
motor neuron 1) gene. identico a SMN1 con l’eccezione di una
mutazione che causa salto dell’esone 7
SMN1 SMN2
exon 6 exon 7 exon 8
pre-mRNA
mRNA
Exon 7 skipping
Protein
Modified from Burghes et al. Nat.Rev. Neuroscience 2009ATROFIA MUSCOLARE
SPINALE (SMA)
Causata da Nel genoma umano sono presenti una o più
copie di uno pseudogene (SMN2) che è quasi E se correggessi
mutationi/delezioni nel gene
SMN1 (Survival motor neuron
1)
identico a SMN1 con l’eccezione di una
mutazione che causa salto dell’esone 7
processamento di
SMN2) ?
SMN1 SMN2 SMN2
exon 6 exon 7 exon 8
pre-mRNA T
mRNA
Exon 7 skipping
Protein
Modified from Burghes et al. Nat.Rev. Neuroscience 2009(-)
Silenziatori
Interferisco con
elementi negativi
(tolgo il freno)Oppure togliendo «un freno» ovvero mascherando un elemento inibitore
Sebbene corregga la funzione
del gene endogeno, la
molecola deve essere
somministrata più volte per
iniezione intratecalePossiamo invece combinare i vantaggi di questi due approcci ovvero -una iniezione sola -correggendo il meccanismo endogeno?
Potenzio elementi positivi U1snRNA (+)
ATROFIA MUSCOLARE
SPINALE (SMA)
Causata da Nel genoma umano sono presenti una o più
copie di uno pseudogene (SMN2) che è quasi Engineered
mutationi/delezioni nel gene
SMN1 (Survival motor neuron
1)
identico a SMN1 con l’eccezione di una
mutazione che causa salto dell’esone 7
U1snRNA
(ExSpeU1) ?
SMN1 SMN2 SMN2
exon 6 exon 7 exon 8
pre-mRNA T
mRNA
Exon 7 skipping
Protein
Modified from Burghes et al. Nat.Rev. Neuroscience 2009L’iniezione di AAV9-
ExSpeU1 ripristina
l’inclusione di SMN2 nei
vari tessuti del topo
SMA
Dal Mas et al. Am J Hum Genet 2015Una sola iniezione di AAV-ExSpeU1
aumenta marcatamente la sopravvivenza
(da una media di 10 gg a 219 gg!!)
normali
Donadon et al. Nucleic Acids research 2019Una sola iniezione di AAV-ExSpeU1 aumenta
marcatamente la funzionalità neuromuscolare
Hanging test Rotarod test
Normali Topi SMA trattati
Donadon et al. Nucleic Acids research 2019Brevetto
(EU, USA,
China, etc)
«Molecule of human U1snRNA, gene encoding a molecule of modified human
U1snRNA, expression vector including the gene, and use in gene therapy”
Big-pharma
(negotiation)Collaborative Network
F. Pagani
ICGEB, Trieste
University of Pennsylvania International Centre for
CHOP Genetic Engineering and
Philadelphia, PA, USA Biotechnology –
Trieste -Italy
Genethon
Paris - FranceMa possiamo addirittura ovviare alla esigenza dell’uso di virus?
H2020 European Project «ENDOSCAPE, a clinically applicable non-viral gene delivery technology »
Perché dopo essere venuti alla luce
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