CONTEGGIO AEROBICO IN PIASTRA - A 30 C: METODO DI SEMINA SPIRALE IN PIASTRA
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METODO NAZIONALE STANDARD
CONTEGGIO AEROBICO IN PIASTRA
A 30°C: METODO DI SEMINA
SPIRALE IN PIASTRA
F 11
Emesso da Standards Unit,Unit, Evaluations and Standards Laboratory
Specialist and Reference Microbiology Division
CONTEGGIO AEROBICO IN PIASTRA A 30°C: METODO DI SEMINA SPIRALE IN PIASTRA
Revisione no: 1.4 Data di revisione: 03.05.05 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory a cura del Groppo F,
W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. PagIna 1 di 10
Riferimento no: F 11i1.4
Questa POS deve essere usata congiuntamente alle altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: standards@hpa.org.ukSTATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD
I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida,
promuovono l’adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle
informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza
sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente
nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la
microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno
tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un
punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo.
I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove
le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il
consenso della maggior parte degli stessi.
I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono
membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L’inclusione del logo di una organizzazione
nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di
queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni
personali non rispecchiano necessariamente quelle dell’organizzazione di cui sono membri. L’elenco attuale delle
organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite e-mail all’indirizzo standards@hpa.org.uk.
Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali
o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee
allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno.
Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health
Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell’accuratezza o
dell’utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall’uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo
documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in
questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se
si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al
documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza.
La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa
confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla
HPA possono essere ottenute al sito www.hpa.org.uk
La HPA è un’organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa
prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di
garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza1.
Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web www.evaluations-standards.org.uk. Contributi allo sviluppo dei
documenti possono essere forniti contattando l’indirizzo standards@hpa.org.uk.
Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si
modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager, la bibliografia non sarà
aggiornata
Per cortesiaautomaticamente.
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Riferimento suggerito per questo documento:
Health Protection Agency (2004). Aerobic plate count at 30°C : spiral plate method. National Standard Method F 11
Emissione 1. http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf_sops.asp.
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Revisione no: 1.4 Data di revisione: 03.05.05 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, a cura del Gruppo F,
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STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD ................................................................................…………..….. 2
INDICE ……………………………………………………………………………………………………………………..…. 3
PROCEDURA DI MODIFICA ………………….. ……………………….……………………….……………………….... 4
SCOPO …………………………………………………………………………..………………………………………………………………… 5
INFORMAZIONE DI BASE ………………………………………………………………………………………………………………………. 5
1.0 PRINCIPIO ……………………………………………………….……………………………………………………… 6
2.0 DEFINIZIONI …………………………………….…………………………………………….………………………… 6
3.0 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ………………………..……..………………………………………....... 6
4.0 ATTREZZATURA …………………………………………….………………………………………………………... 6
.
5.0 TERRENI DI COLTURA ……………………………………….……………………………………………………..... 6
6.0 PROCEDIMENTO ………………………….…………………………….………………………………………..…... 7
6.1 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE E DILUIZIONI ………………..…………………………………………………………………………. 7
6.2 SEMINA ED INCUBAZIONE…………………………..……………………..………………………………………………………………….. 7
6.3 CONTEGGIO DELLE COLONIE …I……………………………………………………………………………………………………………. 7
7.0 CALCOLO DEI RISULTATI …………………………………………………….…………………………………… 8
8.0 ESPRESSIONE DEI RISULTATI …………………….…………………..…………………………………………. 8
ALLEGATO: DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA DI ESECUZIONE DI UN
CONTEGGIO AEROBICO IN PIASTRA A 30°C: METODO DI SEMINA A SPIRALE ……… ……………………… 9
BIBLIOGRAFIA ………………………………………………………………………………………………………………. 10
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Documento di riferimento F 11
controllato
Titolo del documento controllato Procedura Operativa Standard per il conteggio aerobico in piastra a
30°C: metodo di semina a spirale
Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa
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Numero/ Scartata Emissione interessate
Data no.
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2 Stato del Revisionato
Documento
4 Pagina della Ridisegnata
procedura di
modifica
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Revisione no: 1.4 Data di revisione: 03.05.05 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, a cura del Gruppo F,
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AEROBICO IN PIASTRA A 30°C: METODO DI SEMINA A SPIRALE
INTRODUZIONE
Scopo
Il presente metodo per la determinazione della CAP CBT a 30°C è applicabile a tutte le matrici alimentari.
Conoscenza di base
Il Conteggio Aerobico in Piastra (CAP) La carica batterica totale (CBT), o conta totale degli elementi vitali, è un
indicatore per i diversi livelli di contaminazione microbica degli alimenti. Le linee guida microbiologiche del PHLS
specificano i livelli accettabili per la (CBT) per alcuni alimenti pronti al consumo1. Nel caso in cui le linee guida non
siano disponibili per un particolare prodotto, la determinazione del la (CBT) è ancora utile in quanto fornisce
un’indicazione generica dei livelli di contaminazione. Il metodo utilizza un piastratore a spirale come descritto nel BS
4285 : Allegato A 19842 e nella Practical Food Microbiology3.
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Revisione no: 1.4 Data di revisione: 03.05.05 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, a cura del Gruppo F,
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Email: standards@hpa.org.uk1.0 PRINCIPIO
Definiti volumi di diluizioni 10-1 del campione da saggiare e quelle successive ritenute appropriate sono seminate per
la conta aerobica su piastra (CAP) (CBT) con un piastratore a spirale. Le piastre sono incubate a 30°C per 48 ore ed il
conteggio è riferito al numero di ufc per grammo.
2.0 DEFINIZIONI
Per gli obiettivi di questo metodo, la CAP (CBT) è definito come il numero totale di unità formanti colonie (ufc), per
grammo o mL di batteri, lieviti e funghi che si sviluppano in aerobiosi nelle condizioni specificate per la prova.
3.0 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA
Applicare le normali precauzioni del laboratorio di microbiologia.
4.0 ATTREZZATURA
Normale attrezzatura di laboratorio ed aggiungere:
x Bilancia in grado di pesare fino a 0.1 g
x Diluitore gravimetrico (opzionale)
x Stomacher
x Piastratore a spirale
x Vortex
x Termostato 30°C ± 1°C
x Contatore di colonie (opzionale)
x Buste per Stomacher (sterili)
x Pipettatori e relativi puntali sterili in grado di erogare fino a 10 mL e 1 mL di volume (opzionale)
x Pipette (sterili con rilascio totale) 10 mL e 1 mL graduate in volumi di 0.1 mL (opzionale)
x Spatolei (sterili,a perdere)
x Pipette sottili a punta
x Beaker da utilizzare con piastratore a spirale
5.0 TERRENI DI COLTURA
Si possono utilizzare terreni disidratati pronti all’uso disponibili in commercio con formulazione equivalente. Seguire le
indicazioni della ditta produttrice.
Diluente peptone salino (consente il maggior recupero di microrganismi) (DPS)
Peptone 1.0 g
Cloruro di sodio 8.5 g
Acqua 1L
pH 7.0 r0.2 a 25°C
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Email: standards@hpa.org.ukAcqua peptonata tamponata (APT)
Peptone 10.0 g
Cloruro di sodio 5.0 g
Sodio fosfato monoacido 9.0 g
Potassio fosfato biacido 1.5 g
Acqua 1L
pH 7.2 r0.2 a 25°C
Piastre di agar per conteggio
Estratto di lievito 2.5 g
Triptone 5.0 g
Glucosio 1.0 g
Agar 12.0 g
Acqua 1L
pH 7.2 r0.2 a 25°C
6.0 PROCEDIMENTO
6.1 Preparazione del campione e diluizioni
Seguendo le procedure descritte nel Metodo Standard F 2 – Preparazione dei Campioni e delle Diluizioni, preparare
un omogeneizzato a 10-1 in diluente peptone salino (DPS) o in acqua peptonata tamponata (APT). Quando sono attesi
conteggi maggiori preparare le successive diluizioni in DPS, ma per la maggior parte delle richieste potranno essere
sufficienti quelle a 10-1 e 10-3.
6.2 Semina ed incubazione
Partendo dalla diluizione più alta, trasferire ciascuna diluizione in un diverso beaker sterile monouso utilizzando un
dispensatore a punta sottile ed allungata per evitare che particelle alimentari blocchino la punta del piastratore a
spirale.
Partendo dalla diluizione più alta, utilizzare un piastratore a spirale2, 3 per inoculare 50 µL di ciascuna diluizione sulla
superficie di una piastra per il CBT. Lasciare le piastre sul banco di lavoro per circa 15 minuti per consentire
l’assorbimento dell’inoculo nell’agar. Capovolgere le piastre ed inserirle termostato a 30°C per 48 ± 2 ore.
Nota:
Se l’intervallo di conteggio è compreso fra 20 e 2x103 /g sarà necessario seminare un appropriato volume
della diluizione 10-1 su piastra per CAP come descritto nello Standard Method F10.
Esaminare le piastre il più presto possibile dopo la rimozione dal termostato. Se ciò non è possibile conservare a 4°C
per non più di 24 ore.
6.3 Conteggio delle colonie
Contare il numero di colonie sulle piastre manualmente avvalendosi di un dispositivo a griglia o utilizzando un
contatore automatico di colonie.
Se si esegue il conteggio manuale, posizionare la piastra al di sopra della griglia di conteggio. Scegliere qualsiasi area
e conteggiare le colonie dalla parte periferica verso il centro fino ad un numero di 20. Proseguire il conteggio delle
restanti colonie nell’area contenente le precedenti venti colonie. Per le colonie presenti sulla linea di delimitazione
Contare solo quelle sulla parte più esterna di un solo lato dell’area.
Registrare questo conteggio con il numero definito in ciascuna delle suddivisioni dell’area. Contare un’area simile sulla
parte opposta della piastra e registrare il conteggio. Se il conteggio sulla piastra intera è ritenuto inferiore a 160
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Email: standards@hpa.org.ukufc eseguire il conteggio totale delle colonie presenti sulla piastra.
7.0 CALCOLO DEI RESULTATI
I conteggi dovrebbero essere eseguiti, quando possibile, utilizzando diluizioni che hanno dato sviluppo a 20 o più
colonie per piastra.
Calcolare il numero per mL di diluizione seminata addizionando i conteggi delle due aeree e dividendo il totale per la
quantità di volume del segmento conteggiato. In modo alternativo, usufruire delle tabelle fornite dal produttore.
Per ottenere il CBT per g o mL moltiplicare il conteggio per il fattore di diluizione.
Nota:
Per campioni che sviluppano meno di 20 colonie per piastra i limiti di confidenza saranno ampi.
8.0 ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Se non vi è stata nessuna crescita dalla diluizione10-1 refertare come:
Inferiore a 2.0 x 102ufc/g o mL
Se sono rilevate colonie con conteggi con una cifra prima e dopo il punto decimale come:
a x 10b ufc/g or mL
Dove a è un numero mai inferiore a 1.0 o superiore a 9.9 e b rappresenta e b rappresenta l’appropriata potenza di
dieci. Arrotondare i conteggi al numero superiore se l’ultima cifra è 5 o maggiore ed abbassare se l’ultima cifra è 4 od
inferiore
ad esempio
11.300 ufc/g è refertato come 1.1 x 104 ufc/g
235.000/g è refertato come 2.4 x 105 ufc/g
Quando si referta un CAP CBT,, dovrebbero essere segnalate le condizioni della prova, quali la temperatura a 30°per
48 ore.
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Email: standards@hpa.org.ukAllegato: DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA OPERATIVA
STANDARD PER IL CONTEGGIO A 30°C: metodo di semina a spirale
Preparare una diluizione del campione alla diluizione 10-1
Omogeneizzare con stomacher
Se richiesto preparare diluizioni successive in DPS
A partire dalla diluizione maggiore utilizzare un piastratore a spirale seminando 50 µL di
di ciascuna diluizione sulla piastra di agar per il conteggio
Incubare a 30°C per 48 ore
Contare le colonie
Calcolare il numero della CBT per grammo o mL
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Email: standards@hpa.org.ukBIBLIOGRAFIA
1
PHLS. Microbiological guidelines for some ready-to-eat foods at the point of sale: an expert
opinion from the Public Health Laboratory Service (PHLS). PHLS Microbiology Digest 1996;
13: 41-43
2
British Standards Institution. BS 4285 Microbiological examination for dairy purposes. Section
2.3.
Enumeration of micro organisms by surface plate technique for colony count. Appendix A.
Colony count technique using the spiral plate apparatus. London : BSI, 1984
3
Roberts D, Hooper W, Greenwood M.(Eds) Practical Food Microbiology, London : PHLS,
1995
CONTEGGIO AEROBICO IN PIASTRA A 30°C: METODO DI SEMINA SPIRALE IN PIASTRA
Revisione no: 1.4 Data di revisione: 03.05.05 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, a cura del Gruppo F,
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