Cell Culture Laboratories Organisation 03.03.2020
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Cell Culture Laboratories
Organisation
03.03.2020
1. Sterile handing
2. Preparation
3. Wash up
4. Incubation Cell culture laboratory
5. Sterilisation
6. Storage
Al momento di aprire un nuovo laboratorio di colture cellulari, sarebbe opportuno:
- allestire stanze facili da pulire
- avere un sistema di filtrazione dell’aria
- avere stanze (posto) separate per le colture cellulari, la preparazione di medium/soluzioni e materiale
biologico,
- la lavanderia e l’area per la sterilizzazione
- non avere i laboratori di microbiologia, stabulari e stalle vicini al laboratorio di colture cellulari
Cold Hot
Sterile glassware
room
Liquids, Plastic
room
Aseptic Area Microscope
room
Nitrogen
Room Quarantine
room
corridor
storage
Prep Ovens and Wash up
Area autoclave Area
Area Sterile
Area del laboratorio dove si effettuano unicamente le colture cellulari; non deve esserci
traffico e altri fattori che possano favorire le contaminazioni. In questa area è consigliabile
avere piani di lavoro di colore chiaro per favorire l’osservazione delle colture (ed eventuali
contaminazioni o cambi di pH), avere una cappa a flusso laminare e uno spazio provvisto
di cell counter e microscopio invertito.
I
*
Area di Quarantena/Contenimento:
* area aseptica separata dal laboratorio per le colture cellulari dove si lavora con linee
cellulari e biopsie appena arrivate nel laboratorio. Prima di introdurle nell’area
aseptica è necessario verificare che il nuovo materiale biologico sia privo di alcuna
contaminazione.
I Area per incubatori
le incubazioni dovrebbero essere portate avanti in incubatori distinti o in una stanza a
temperatura controllata. Se vengono utilizzati più di due incubatori è conveniente
avere una stanza calda provvista di un apposito riscaldamento, un sistema di
circolazione dell’aria, un termostato, un temperature recorder.
Aseptic Techniques - Controlled environment (Traffic, air flow) - Sterile media and reagents - Avoid aerial contamination of solutions - Avoid manual contamination of equipment - Avoid repeated opening of bottles - Swab all bottle tops & necks with 70% ethanol - UV irradiation before and after - Only use disposable equipment once - Flame all bottle necks & pipette by passing very quickly through the hottest part of the flame - Avoiding placing caps & pipettes down on the bench; practice holding bottle tops with the little finger - Work either left to right or vice versa, so that all material goes to one side, once finished - Clean up spills immediately & always leave the work place neat & tidy
HOW TO WORK in Steril conditions?
https://www.youtube.com/watch?v=P4dTbKVDIZ4
Please watch it
Aseptic Techniques - Lab coat (only in lab) - Gloves - Tip DOES not touch anything than medium/reagent - Holding off the tube
Attrezzature di laboratorio
https://www.youtube.com/watch?v=CA5fVLK5zAE Please watch it
Laminar Incubatore Centrifuga
Microscopio pH metro Osmometro
Attrezzature di laboratorio
- Laminar cabinet (Vertical are preferable)
- Incubation facilities
- Temperature of 25-30°C for insect & 37°C for mammalian cells,
- CO2 2-5% & 95% air at 99% relative humidity.
- To prevent cell death incubators set to cut out at approx. 38.5 C
- Refrigerators: Liquid media kept at 4°C, enzymes (e.g. trypsin) & media components (e.g.
glutamine & serum) at -20 C
- Microscope: An inverted microscope with 10x to 100x magnification
Laminar-Flow Hood - Cappa a floss laminare Most tissue culture work is done in a laminar flow hood. The major advantage of this is that the working environment is protected from dust and contamination by a constant, stable flow of filtered air passing over the work surface. There are two types: - Horizontal: gives the most stable airflow and best sterile protection to the culture and reagents - Vertical: gives more protection to the operators
Classes of Cell Culture Hoods
Class I
Class I cell culture hoods offer significant levels of protection to
laboratory personnel and to the environment when used with good
microbiological techniques, but they do not provide cultures
protection from contamination. They are similar in design and air flow
characteristics to chemical fume hoods.
Class II
Class II cell culture hoods are designed for work involving dangerous
materials, and they also provide an aseptic environment necessary for
cell culture experiments. A Class II biosafety cabinet should be used for
handling potentially hazardous materials (e.g., primate-derived cultures,
virally infected cultures, radioisotopes, carcinogenic or toxic
reagents).
Class III
Class III biosafety cabinets are gas-tight, and they provide the highest
attainable level of protection to personnel and the environment. A
Class III biosafety cabinet is required for work involving known human
pathogens and other very hazardous materials.CO2 Incubator Some vessels, e.g., Petri dishes or multi-well plates, require a controlled atmosphere with high humidity and elevated CO2 tension. Incubator provide the appropriate enviroment for cell growth. Should: - be large enough - have controlled temperature - CO2 and eventual O2 gas - be easy cleanable - Not corrosion - be clean et least once/ two months There are two types: - dry incubator (cheaper): cells needs to be cultured in closed flasks to avoid evaporation - humid incubators (more expensive): allow superior control of culture conditions
Centrifuga Le sospensioni cellulari necessitano di essere centrifugate per: - Rimuovere reagenti - Splittare le cellule - “Pull down” liquids - for cells growing in suspension
Inverted Microscope A morphological change is often the first sign of deterioration in a culture and the characteristic pattern of microbiological infection is easily recognized. Often is connected with good quality optic photo/movie system. Fluorescent optic to observe fluorescence in cells. Permette di osservare le cellule in coltura: - Morfologia delle cellule - Verificare eventuale contamination - Confluenza - Eventuali contaminazioni
OTHERs
Bilancia
Water Purification System - Purified water is required for rinsing
glassware, dissolving powdered media, and diluting concentrates.
Bilancia
La bilancia di precisione è necessaria per pesare le diverse componenti di
medium/soluzioni.
Il pH metro permette di verificare e/o correggere il pH di medium/
soluzioni
L’osmometro permette di verificare “l’osmolarità”, una importante
proprietà fisica dei medium per colture cellulariOTHERs Sostituisce la pasteur + tettarella. Permette una maggiore accuratezze e riproducibilità. Le pipette sono generalmente provviste di filtri per ridurre la possibilità di contaminazioni Strumenti non sterili ma utilizzati con puntali sterili con/senza filtro. Permettono di utilizzare volumi piccoli < 1 ml. Cell counter (automatico) o camera di Burcher
OTHERs - storage Frigorifero (+4°C) Freezer (-20 e -80°C) Bidone Azoto
Attrezzature per lavare e sterilizzare materiali/
soluzioni
Lavandino Stufa
Lavandino Stuffa Autoclave
Autoclave
Lavastoviglie
LavastovigieMaterials used for cells culture
Questions?
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