BIOTECNOLOGIE ALIMENTARI - UNIBA
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02/03/2021 Orientamento Consapevole Biotecnologie Alimentari Dott.ssa Maria Calasso Ricercatrice in Microbiologia degli Alimenti 02 marzo 2021 Seminario online-piattaforma Teams Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti – Università di Bari 1
02/03/2021 Cosa sono le biotecnologie? Uso di cellule o di enzimi di origine microbica, animale o vegetale, per ottenere la sintesi, la degradazione o la trasformazione di materie prime Le Biotecnologie possono essere definite in molti modi... L’applicazione di organismi, di sistemi o di processi biologici alla produzione industriale di beni e servizi. Una tecnologia che sfrutta fenomeni biologici per copiare o per costruire vari tipi di sostanze utili. L’applicazione di principi tecnico-scientifici alla trasformazione di sostanze operata da agenti biologici, al fine di produrre beni e servizi. 2
02/03/2021 La biotecnologia: una sfida interdisciplinare L’ Organizzazione mondiale per la cooperazione allo sviluppo economico (OCSE) e la UE indicano le biotecnologie tra le tecnologie più promettenti dell’immediato futuro che potranno contribuire a migliorare la qualità della vita e dell’ambiente. 3
02/03/2021 E' un treno da non perdere, quello delle biotecnologie…(ANSA.it) Nel settore delle biotecnologie agroalimentari l’Italia può contare su condizioni assolutamente uniche e competitive, per varietà di microclimi e biodiversità. Di qui la molteplicità dei filoni di ricerca che spaziano dal • miglioramento genetico di specifiche varietà vegetali, • al controllo dell’origine e della qualità degli alimenti, • all’estrazione di sostanze bioattive limitatamente disponibili in natura. • Per non dire dell’autentica galassia di nicchie di mercato, alternative alle grandi coltivazioni, sul cui sviluppo le imprese multinazionali si stanno già concentrando. 4
02/03/2021 Le biotecnologie rappresentano una risorsa importante per affrontare le sfide per la sicurezza alimentare e per una nutrizione adeguata dal punto di vista qualitativo e nutrizionale a livello globale. 10 billion people by 2050 5
02/03/2021 Cosa sono le biotecnologie? Tradizionali Avanzate Insieme di tecniche convenzionali o Insieme di metodi di modificazione utilizzate da secoli per produrre genetica birra, vino, pane ed altri alimenti o Sviluppi innovativi dei processi biotecnologici tradizionali Applicando le biotecnologie è possibile costruire “fabbriche biologiche” che possono produrre, a basso costo e su larga scala, sostanze di interesse Ambiente Farmaci e Bio-polimeri e vaccini Alimenti Agricoltura Cosmetici e zootecnia Tessuti 7
02/03/2021 Biotecnologie tradizionali in ambito alimentare • Nei processi biotecnologici la trasformazione della materia è realizzata da microrganismi viventi o dagli enzimi da essi estratti. • Utilizzano le proprietà dei microrganismi per la fermentazione di cibi e bevande Alimenti fermentati LAB (Lactic Acid Bacteria) 9
02/03/2021 Microbiologia Branca della biologia che studia la struttura e le funzioni dei microrganismi, cioè di tutti quegli organismi unicellulari, pluricellulari o acellulari, non visibili ad occhio nudo: batteri, alcuni tipi di funghi, lieviti, alghe, protozoi, virus e i prioni 10
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02/03/2021 Quali microrganismi negli alimenti? Le caratteristiche chimico-fisiche degli alimenti sono tali da permettere la colonizzazione e lo sviluppo di un gran numero di microrganismi Non tutti i microrganismi presenti negli alimenti hanno lo stesso impatto nella loro produzione, conservazione e consumo Quali microrganismi negli alimenti? 1. ALTERANTI E PATOGENI Responsabili di infezioni ed intossicazioni alimentari Raramente causano percettibili alterazioni delle caratteristiche organolettiche... 2. INDIFFERENTI 3. UTILI o PROtecnologici 12
02/03/2021 Alimento e funzioni . . . . 1. Funzione fisiologica: soddisfare la fame rispondere alle esigenze nutrizionali 2. Funzione sociale: promuovere l’unità familiare fornire ospitalità fonte di amicizie 3. Funzione religiosa: significato simbolico 4. Funzione psicologica: esprimere una condizione di prestigio conferire sicurezza personale esprimere emozioni allentare le tensioni e condizioni di stress “anestetico” 5. Funzione politica: strumento di protesta 6. Funzione artistica: soggetto per esprimere la creatività (arte, cucina, fotografia) Alimenti fermentati 13
02/03/2021 Fermentazione La trasformazione degli alimenti per via fermentativa è il più antico processo biotecnologico utilizzato per la conservazione di alimenti e bevande nel quale l’attività microbica svolge il ruolo chiave Fermentazione 14
02/03/2021 Fermentazione La fermentazione è utilizzata dall’uomo da almeno 10.000 anni La parola è antica, deriva dal latino fermentum, dalla radice del verbo fervere che significa muoversi, bollire. Nasce dall’osservazione di quanto succede in modo chiaramente visibile durante il processo: il pane lievita, si gonfia e si espande, il vino (o la birra) bolle! Fermentazione Studi di Pasteur sul vino in un’illustrazione dell’epoca 15
02/03/2021 Fermentazione del mosto d’uva in vivo La trasformazione di mosto in vino è un fenomeno biologico dal nome di fermentazione alcolica Gli zuccheri contenuti nel mosto vengono trasformati in alcol Etilico e in CO2 (anidride carbonica) a causa dell’azione dei lieviti (funghi microscopici unicellulari) chiamati saccaromiceti che si trovano sulla buccia dell’uva Punti salienti della storia della Fermentazione del mosto d’uva Nelle tombe degli antichi Egizi già si trovano raffigurazioni nell’atto di pigiare l’uva Dall’Asia Minore la coltivazione della “Vitis vinifera” si diffuse in tutti i paesi affacciati sul mediterraneo 16
02/03/2021 Punti salienti della storia della Fermentazione del mosto d’uva Mosaico d'epoca romana con la torchiatura dell'uva, Israele Furono i Greci i primi veri maestri nella coltivazione e vinificazione, producevano vini molto alcolici, dolci I greci portarono in Italia (colonia greca) le loro abitudini, compreso quella di coltivare la vite e produrre del vino. Gli antichi romani migliorarono la qualità del vino, introducendo: l’invecchiamento, la potatura, la scelta di vitigni che meglio si adattavano alla tipologia del terreno Fermentazione del mosto d’uva in vivo Saccharomyces cerevisiae 17
02/03/2021 Microrganismi di interesse nei processi fermentativi LATTOBACILLI LIEVITI MUFFE LATTOBACILLI Caratteristiche generali • forma bastoncellare o coccica. • Gram positivi • catalasi negativi • anaerobi facoltativi • fermentano gli zuccheri • esigenze nutrizionali complesse • esistono oltre 100 specie •distribuiti in natura in differenti habitat • pH ottimale di crescita:: - acidofili - acidurici • temperatura di crescita 18
02/03/2021 LIEVITI Caratteristiche generali • funghi unicellulari • riproduzione per gemmazione o scissione • aerobi e microaerofili • in anaerobiosi fermentazione • catalasi positivi • mesofiti • generi e specie di interesse nel settore alimentare: - Saccharomyces, - Debaryomyces, - Kluyveromyces, - Hansenula fermentazione alimenti alterazione alimenti MUFFE Caratteristiche generali • funghi multicellulari • struttura vegetativa detta micelio • grande interesse nel settore alimentare alterazione alimenti patogene per l’uomo fermentazione alimenti -insaccati carnei formaggi Penicillium camemberti, P. roqueforti, P. nalgiovense. 19
02/03/2021 Fermentazione cibi e bevande - esempi di processi trasformativi utili Produzione pane, birra, vino, formaggi, molte bevande alcoliche; produzione industriale di etanolo, acetone, glicerina, butanolo, acido citrico, antibiotici, amminoacidi, vitamine, steroidi… Batteri lattici Lieviti 20
02/03/2021 Biotecnologie alimentari Settore Lattiero-caseario 21
02/03/2021 Tradizione pugliese Canestrato pugliese Caciocavallo silano Burrata Cacioricotta Giuncata Manteca Mozzarella Ricotta marzotica (fiordilatte) Leccese Caciocavallo podolico Ricotta Scamorza Caprino dauno Microbiota filo-caseario Microbiota Starter primari Starter secondari avventizia Batteri lattici non-starter (NSLAB) 22
02/03/2021 Problematiche del settore 1. Appiattimento organolettico dei formaggi tipici causato dalla perdita della biodiversità microbica, dovuta all’eccessivo uso di starter commerciali 2. Ottenimento di produzioni tipiche con una qualità standardizzata nel tempo (difficoltà nell’ottenere riconoscimento di mercato) Studio delle relazioni causa-effetto tra fattori ambientali e microbiota del latte vaccino e dei formaggi Gobbetti et al. "Trends in Food Science & Technology 78 (2018): 244-254. 23
02/03/2021 Studio delle relazioni causa-effetto tra fattori ambientali e microbiota del latte vaccino e dei formaggi Quesito scientifico E’ possibile produrre la tradizionale Mozzarella pugliese con caratteristiche di tipicità? 24
02/03/2021 Uso di un siero-innesto selezionato per la produzione di mozzarella tradizionale pugliese Isolamento e identificazione dei microrganismi del sieroinnesto Selezione dei batteri lattici in base alle principali proprietà tecnologiche Produzione di un sieroinnesto con i batteri lattici selezionati Prove di caseificazione e panel test Siero fermento 25
02/03/2021 Quesito scientifico E’ possibile produrre formaggio a ridotto contenuto di grasso? 26
02/03/2021 Quesito scientifico I formaggi possono essere veicolo di microrganismi probiotici? Formaggi probiotici - equilibrio microbico intestinale - attività antimicrobica - attività antipertensiva - produzione di GABA, CLA … 27
02/03/2021 Quesito scientifico E’ possibile estendere in maniera considerevole la conservabilità dei prodotti lattiero caseari “freschi” senza il ricorso a sostanze chimiche? 28
02/03/2021 Quesito scientifico E’ possibile condizionare e/o accelerare la stagionatura di un formaggio tramite l’impiego di diversi microrganismi ? 29
02/03/2021 LATTE PASTORIZZAZIONE 71°C x 15 sec. Raffreddamento a 37°C STARTER: S. thermophilus L. delbrueckii subsp. lactis CALDAIA Latte 37°C Incubazione 30 min. Lact. lactis attenuato CAGLIO LATTE LIQUIDO Starter + enzima CAGLIATA ROTTURA / FORMATURA SALATURA Salamoia 37NaCl wt/Vol CONDIZIONAMENTO T° Ambiente per 12h INOCULO MICRORGANISMI IN SUPERFICIE MATURAZIONE Settore prodotti lievitati da forno 30
02/03/2021 Prodotti lievitati da forno: Agenti lievitanti Lievito di birra Lievitanti chimici (es. acido tartarico, bicarbonato di sodio) Lievito naturale Prodotti lievitati da forno: Lievito naturale LIEVITO NATURALE: impasto a base di acqua e farina contenente batteri lattici e lieviti. Complesso ecosistema biologico - Più di 50 specie di LAB (appartenenti al genere Lactobacillus) - Più di 20 specie di lieviti (appartenenti ai generi Saccharomyces, Candida) 31
02/03/2021 Selezione di batteri lattici del lievito naturale da impiegare nella produzione di pane VANTAGGI DERIVANTI DALL’USO DI LIEVITO NATURALE RISPETTO AL LIEVITO DI BIRRA Migliore aroma e sapore Migliore struttura Maggiore conservabilità Maggiore digeribilità Esigenze dell’industria dei prodotti lievitati da forno Standardizzare l’impiego del lievito naturale Migliorare e standardizzare gli aspetti organolettici dei prodotti lievitati da forno Aumentarne la conservabilità 32
02/03/2021 Quesito scientifico E’ possibile migliorare le caratteristiche sensoriali e strutturali del pane di frumento, tramite l’impiego di diversi microrganismi ? Estratti citoplasmatici Lactobacillus sanfranciscensis A4 Estratti citoplasmatici Estratti citoplasmatici Debaryomyces hansenii DSMZ-70590 Hafnia alvei ATCC-51815 33
02/03/2021 Lactobacillus Impasto Controllo Sanfranciscensis Hafnia alvei Debaryomyces hansenii 37,20% ± 1,9 19,71% ± 1,00 18,32% ± 1,00 20,12 % ± 1,5 Quesito scientifico E’ possibile mangiare un alimento comune (es. Pasta) e apportare benefici al nostro microbiota intestinale? 34
02/03/2021 Quesito scientifico E’ possibile estendere in maniera considerevole la conservabilità dei prodotti lievitati da forno a “lunga conservazione” senza il ricorso a sostanze chimiche? 35
02/03/2021 CONSERVABILITA’ DEI PRODOTTI LIEVITATI DA FORNO Agenti fungini maggiormente responsabili del deterioramento: Eurotium, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Monilia, Mucor, Rhizopus - off-flavors - micotossine - allergeni EFFETTI POSITIVI DEL LIEVITO NATURALE BATTERI LATTICI Sintesi di COMPOSTI ACIDIFICAZIONE, ANTIMICROBICI PROTEOLISI e EPS Prevenzione della contaminazione Ritardo del raffermimento microbica 36
02/03/2021 Screening su matrici vegetali A B Inhibitory activity on Penicillium roqueforti DPPMAF1 by water-soluble extracts A from various vegetable species, as determined by agar diffusion assay. Botanical name Part of the plant pH of the extracts Inhibitory activity Cucurbita pepo fruit 6.35 - Phaseolus vulgaris beans, seeds 6.07 - Phaseolus vulgaris cv. Pinto seeds 6.36 ++++ Vigna unguiculata seeds 6.50 +++ Pisum sativum seeds 6.94 - Vicia faba seeds 6.49 - Brassica oleracea cv. Botrytis cauliflaura bloom 6.31 - Spinacia oleracea leaves 6.83 - Asparagus officinalis bloom, shaft 5.69 + Solanum melongena fruit 4.85 - Aloe arborescens leaves 4.10 + Camellia sinensis leaves 5.10 + Inhibitory activity was scored as follows: -, no inhibition; +, very weak inhibition; ++, low inhibition with a little clear zone near the rim of the colony; +++ strong inhibition, with large clear zone near the rim of the colony; ++++, very strong inhibition, with no growth near the rim of the colony. 37
02/03/2021 BAKING TEST Pani gluten-free conservati a temperatura ambiente per 28 gg Mr St 1 2 3 4 KDa 97.4 66.2 45.0 31.0 Control 21.0 14.0 SDS-PAGE di 1:EA di semi di amaranto; 2: proteine totali estratte da pane GF CT; 3: da pane GF con EA amaranto; sourdough + W.E. of Amaranthus spp (30%) 4: pane GF con EA amaranto + lievito naturale St:standard Quesito scientifico E’ possibile applicare la biotecnologia del “lievito naturale” per degradare completamente il glutine e rendere i cereali tollerati dai soggetti celiaci? 38
02/03/2021 Glutine: 1. Industria Sottoprodotto proteico della produzione di amido, insolubile 2. Biochimica Frazione proteica di riserva dei cereali, costituita da gliadine e glutenine 3. Codex Alimentarius (celiachia) Frazione proteica di frumento, segale, orzo, [avena] e delle varietà da esse derivanti per incrocio, verso la quale alcune persone sono intolleranti e che risulta non solubile in acqua e soluzioni saline (NaCl). Grano, Segale, Orzo, Farro, Spelta, Kamut,Triticale anche… birra, salumi, preparati carnei e salumi, sughi pronti, salse, creme, surrogati del caffe, piatti precotti, cioccolato, farmaci e integratori in tavoletta… Avena Riso, Mais, Grano saraceno, Manioca, Miglio, Amaranto, Quinoa, Sorgo, Legumi 39
02/03/2021 Celiac Disease CD is an inflammatory disorder of the small intestine that affects genetically predisposed individuals when they ingest gluten and similar proteins Iceberg Model Mexico 1:39 Estonia 1:50 Finland 1:50 Italy 1:84 Iran 1:114 Ireland 1:122 Libya 1:127 Australia 1:131 New Zealand 1:131 USA 1:133 India 1:143 Argentine 1:167 Tunisia 1:167 More than 1 celiac on 100 people Turkey 1:167 From 1:100 to 1:150 cases Egypt 1:189 From 1:150 to 1:200 cases Sweden 1:190 Netherlands 1:203 Less than 1:200 cases Brazil 1:214 Only few cases United Kingdom 1:300 No studies found Germany 1:333 Spain 1:389 Croatia 1:500 (Lionetti and Catassi, 2011; Accomando and Cataldo, 2004; Remes-Troche et Denmark 1:500 al., 2006; Fasano and Catassi, 2001) WORLD 1:134 40
02/03/2021 Produzione lievitati da forno Agenti lievitanti Lievito naturale chimici Lievito di birra (cocktail di batteri lattici (es. acido tartarico + e lieviti) bicarbonato di sodio) • assenza di fermentazione • processo rapido • processo multi-step • processo istantaneo (0.5 – 1 h) piuttosto prolungato • nessuna degradazione delle • fermentazione alcolica (ca. 24 h) componenti proteiche • nessuna degradazione delle • fermentazioni lattica componenti proteiche ed alcolica • proteolisi intensa St 1 2 Pool 1 (ca. log 9/ml) Lb. brevis 14G Lb. alimentarius 15M Lb. hilgardii 51B v -gliadins Lb. sanfranciscensis 7A + a, b, v -gliadins Pool 2 (ca. log 8/ml) Lb. sanfranciscensis E14 Lb. sanfranciscensis E21 hydrolized Lb. sanfranciscensis 174 gliadins Lb. sanfranciscensis 13 Lb. sanfranciscensis A1 Lb. sanfranciscensis 274 + St, European gliadin standard; Fungal proteases (200 ppm) (CAD) controllo (SLP) 1, chemically acidified dough (CAD); 2, fermented dough (20% wheat flour) with pool 1, 2 and proteases (SLP) Alb.-Glob. Glutenins Glutenins Gliadins Water salt soluble R5-ELISA SLP < 10 ppm Organic nitrogen concentration of spray-dried flour 41
02/03/2021 Elettroforesi bidimensionale di gliadine: (A) impasto acidificato chimicamente e (B) impasto al 20% di farina fermentato con batteri lattici selezionati e proteasi per 48 h a 37°C (A) (B) Mr pH 6 pH 11 pH 6 pH 11 kDa 200 200 10 10 Proteolytic events during fermentation (Adapted from Ganzle et al., 2008) gliadin LMW glutenin y-HMW glutenin x-HMW glutenin degradation products peptide Fungal enzymes Aspergillus oryzae (500,000 HUT/g) Primary proteolysis by cereal proteinases, Aspergillus niger (3,000 SAPU/g), Microbial reduction of disulfide bonds (BIO-CAT Inc.,USA) 42
02/03/2021 Clinical Challenge 1: Department of Pediatric, Sapienza - University of Roma Recipe Clinical challenge - Fermented wheat flour (50%, w/w), -Eight CD patients - Sucrose (11.3%, w/w), (age median 13, range 8-17 years), - Eggs (8.8%, w/w), -Daily consumption of ca. 200 g of - Pasteurized yolk (1.2%, w/w), Sweet baked goods, - Egg white (13%, w/w), - The challenge lasted 60 days - Butter (7.3%, w/w), - Milk cream (7.3%, w/w), - Sodium bicarbonate (1%, w/w), -Vanilla beans and lemon peel as flavoring agents. Sweet baked goods (200 g) corresponding to 100 g of processed wheat flour which contained 10 g of hydrolyzed gluten Clinical Challenge 2: Pediatrics and European Laboratory for the Study of Food Induced Diseases University of Naples, Federico II, Italy Recipe Clinical challenge - Fermented wheat flour (100g), -Sixteen CD patients - Sucrose (50 g), (age median 19, range 12-23 years), - Butter (50 g), -Daily consumption of ca. 200 g of - Water (as required) biscuits, - The challenge lasted 60 days Biscuits (200 g) corresponding to 100 g of processed wheat flour which contained 8 g of hydrolyzed gluten Clinical Gastroenterology Hepatology Safety for celiac patients of baked goods made of wheat flour hydrolyzed during food processing. Greco L, Gobbetti M, Auricchio R, Di Mase R, Landolfi F, Paparo F, Di Cagno R, De Angelis M, Rizzello CG, Cassone A, Terrone G, Timpone L, Aniello MD, Maglio M, Troncone R, Auricchio S. doi:10.1016/j.cgh.2010.09.025 43
02/03/2021 Quesito scientifico E’ possibile applicare ingredienti non convenzionali secondo la biotecnologia del “lievito naturale” per ottenere nuovi prodotti lievitati da forno? 44
02/03/2021 A protocol for sourdough fermentation of a mixture of wheat and legume flours was set up. • The lactic acid bacteria microbiota of wheat–legume sourdough was characterized. • Legume and sourdough fermentation increased functional compounds of wheat bread. • Wheat–legume sourdough increased phytase and antioxidant activities of wheat bread. • Wheat–legume sourdough decreased the hydrolysis index of wheat bread. Representative images of breads made by wheat flour alone (control wheat bread) (A), wheat flour added of 5 (B), 7.5 (C) or 1 0% (w/w) (C) of each legume (chickpea, lentil and bean) flour. Nuovi ingredienti da farine di lenticchie intere e germogliate mediante fermentazione a lievitazione naturale per migliorare il pane di frumento Microbiota analysis Proximate composition Screening for EPS producing strains DEXTRAN sottomesso 45
02/03/2021 COMUNICAZIONE CELLULARE I batteri hanno la capacità di “sentire” ed adattarsi ai cambiamenti ambientali Quesito scientifico La co-abitazione di un stesso ecosistema/nicchia con altre specie/biotipi è una forma di stress ambientale, la cui risposta dipende da meccanismi di comunicazione cellulare? 46
02/03/2021 Cinetica di crescita di L. sanfranciscensis CB1 2.4 2 1.6 Δ log CFU/mL 1.2 0.8 (A) (B) 0.4 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time (h) Condizioni Cellule vive Cellule morte/ Cellule ( ) = monocoltura colturali danneggiate coltivabili ( ) = co-coltura con L. plantarum DC400 (log cell/mL)* (log cell/mL)* (logCFU/mL)* ( ) = co-coltura con L. brevis CR13 ( ) = co-coltura con L. rossiae A7 CB1 9.30a 7.93c 9.10a CB1 - DC400 8.45c 9.32a 8.40c CB1 - CR13 8.83b 8.94b 8.8b CB1 - A7 9.33a 8.0c 9.04a Quesito scientifico E’ possibile usare batteri lattici per prolungare la conservabilità di frutta e verdura comunemente presenti sulle nostre tavole ? 47
02/03/2021 Effetto della fermentazione lattica sulla conservabilità Giorni di conservazione Dopo fermentazione In frigorifero 30 giorni 2 – 3 giorni 30 giorni 5 – 6 giorni 30 giorni 6 – 7 giorni 5 – 6 giorni 3 giorni 40 giorni 4 – 5 giorni Quesito scientifico È possibile valorizzare i sottoprodotti naturali da matrici vegetali mediante le biotecnologie alimentari? 48
02/03/2021 SOTTOPRODOTTI NATURALI DA MATRICI VEGETALI VALORIZZATI PER PREPARAZIONI DALLE ELEVATE PROPRIETÀ SALUTISTICHE (SNIPS) SOGGETTO CAPOFILA: Farmalabor SRL Creare una filiera viti-vinicola innovativa con RESPONSABILE SCIENTIFICO: Prof.ssa Maria De Angelis uve e vini ricchi di metaboliti secondari per la produzione di preparazioni ad azione salutistica; Utilizzo dei sottoprodotti di origine ortofrutticoli (invenduto e/o scarti di lavorazione) al fine di valorizzare le proprietà nutraceutiche delle matrici vegetali; Introdurre la coltivazione di Stevia rebaudiana nel panorama produttivo pugliese come possibile opportunità per fronteggiare la crisi delle aziende flotrovivaistiche. 49
02/03/2021 Ask both what you can do for your microbes and what your microbes can do for you BMC Systems Biology, 2011 50
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