PRINCIPI PRATICI ED ESEMPI DI COLTURE CELLULARI - Dott.ssa Valeria Berton Università di Verona - TANDEM | UNIVR
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PRINCIPI PRATICI ED ESEMPI
DI COLTURE CELLULARI
Dott.ssa Valeria Berton
Università di Verona
Applicazioni delle colture
cellulari
Studi di biologia e biochimica
Studi di interazione tra organismi patogeni e cellule
Studi degli effetti di farmaci sulle cellule
Studiare processi cellulari
Studi di tossicologia
Ricerca sui tumori
Colture
Colture d’organo: L’organo (o parte di esso) viene asportato, conservando l’architettura.
Usate principalmente per studi di fisiologia e sviluppo.
Colture di rene di ratto E13,5
(Martovetsky et al. 2013)
Colture tissutali: o colture organotipiche. Fettine di tessuto vengono isolate dall’organo
intero.
Spessore minore rispetto alle colture d’organo; mantenuti solo gli
aspetti principali dell’architettura del tessuto.
Colture di ippocampo di ratto P7
(Armentano et al. 2010; Guy et al.
2011)
Colture cellulari: l’architettura del tessuto (o dell’organo) viene distrutta, fino ad
arrivare alla sospensione di singole cellule.
Colture cellulari Cellule isolate dal tessuto d’origine e mantenute in vita in un ambiente definito
Vantaggi e Svantaggi
Vantaggi Svantaggi
Sistemi semplici e riproducibili Sistema semplificato rispetto
all’intero organismo
Stretto controllo sulle condizioni
ambientali Difficile correlazione tra le
condizioni di coltura e le condizioni
Consentono analisi a livello in vivo
molecolare
Possibili interazioni tra la molecola
Disponibilità di diversi tipi cellulari e di studio e le condizioni di coltura
reagenti per colture
Costi comunque abbastanza elevati
Relativamente economiche
Expertise
Ridotti problemi etici
Necessitano comunque di prelievo
da animale o paziente
Tipi di colture
Colture primarie: derivate dall’isolamento di uno o più tipi cellulari da un
campione di tessuto o organo
Colture secondarie: derivate dalla propagazione di
colture primarie
neuroni cellule endoteliali cellule cervice uterina
Tipi di colture
Linee cellulari continue: derivate cellule tumorali o ottenute da trasformazione
(spontanea o indotta) di colture primarie
Sono linee clonali
Colture clonali: colture derivate da una singola cellula (clone)
Colture cellulari: limite di Hayflick
Cellule isolate da un
tessuto e seminate in Cellule della coltura primaria rimosse e
coltura seminate ad una minore densità
Coltura secondaria
Cellule derivate da tumori o
Coltura primaria
trasformate (trasformazione
Cellule trasformate
spontanea o con agenti chimici o
Log n cellule
Proliferazione Immortalizzate
biologici)
Acquisiscono la capacità di
proliferare indefinitamente
Cellule non
trasformate
Tempo
Primo passaggio Secondo passaggio
Colture cellulari primarie
Colture primarie: colture cellulari derivate dalla dissociazione di un tessuto o un
organo o isolate da fluidi biologici
Dissociazione: meccanica
enzimatica (tripsina, collagenasi, EDTA)
Distrugge la matrice cellulare che tiene unite le cellule; si ottiene una
sospensione di materiale extracellulare e cellule.
Isolamento: Delle cellule dal materiale extracellulare (filtrazione)
Del tipo cellulare di interesse dalla popolazione mista di cellule; si sfruttano
le proprietà fisiche (dimensioni), le capacità di adesione a substrati specifici,
specificità di legame con anticorpi, terreni di coltura selettivi
Linee continue
Linee continue: cellule tumorali o cellule non tumorali trasformate
Dette anche linee cellulari immortalizzate
Il programma genetico della senescenza è stato annullato:
Mutazioni spontanee: cellule derivate da tumori o trasformazione in coltura di cellule da
colture secondarie
Trasformazione indotta: cellule da colture primarie immortalizzate tramite
manipolazione genetica
Agenti fisici (radiazioni o mutageni chimici)
Virus codificanti porzioni di genoma modificateColture primarie vs. immortalizzate
Colture primarie Colture immortalizzate
Limitato numero di cicli cellulari Proliferazione rapida e continua
dipendente solo dalla presenza di
Mantengono con maggiore metaboliti
probabilità le caratteristiche delle Possono acquisire caratteristiche diverse
cellule in vivo
dalle cellule in vivo (morfologia, fisiologia
e corredo cromosomico)
Continui prelievi da
animali/pazienti Disponibili commercialmente
Coltura più semplice (minori esigenze
Condizioni di coltura più delicate trofiche, ridotta inibizione da contatto)
Variabilità ridotta
Maggiore variabilità (isolate da
soggetti diversi)Tipi di colture cellulari
Aderenti: Cellule che fanno parte di tessuti solidi (es. cellule nervose, epiteliali,
fibroblasti)
Crescono aderendo alla superficie di coltura
Spesso richiedono l’interazione tra recettori di adesione di
membrana e proteine adesive adsorbite sulla superficie di coltura
(es. fibronectina, lamimina, poly-L-lisina, matrigel)
L’adesione è necessaria per la proliferazione
Inibizione da contatto
della proliferazione
In sospensione: Cellule che crescono normalmente in mezzo fluido (es. cellule
ematopoietiche)
Crescono in sospensione, senza aderire alla superficie di coltura
Esaurimento dei fattori di crescitaCondizioni necessarie alla coltura cellulare Adeguato apporto di sostanze nutritive • zuccheri • amminoacidi • ormoni • vitamine • ioni • fattori di crescita Controllo e mantenimento di condizioni chimico-fisiche ottimali • sterilità • pH • concentrazione di anidride carbonica e ossigeno • temperatura • umidità • substrato
Terreni di coltura
Contengono i nutrienti essenziali al mantenimento e alla crescita delle cellule in coltura
Cellule diverse hanno requisiti nutrizionali diversi diversi terreni di coltura
Esempio: componenti Neurobasal medium (Gibco)
Amminoacidi Vitamine Sali inorganici
Glycine Choline chloride Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.)
L-Alanine D-Calcium pantothenate Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O)
L-Arginine hydrochloride Folic Acid Magnesium Chloride (anhydrous)
L-Asparagine-H2O Potassium Chloride (KCl)
Niacinamide
L-Cysteine Sodium Bicarbonate (NaHCO3)
Pyridoxine hydrochloride
L-Histidine hydrochloride-H2O
Riboflavin Sodium Chloride (NaCl)
L-Isoleucine
L-Leucine Thiamine hydrochloride Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O)
L-Lysine hydrochloride Vitamin B12 Zinc sulfate (ZnSO4-7H2O)
L-Methionine i-Inositol
L-Phenylalanine
L-Proline
L-Serine Altri componenti
L-Threonine
D-Glucose (Dextrose)
L-Tryptophan
L-Tyrosine HEPES
L-Valine Phenol Red
Sodium PyruvateTerreno in uso
In generale, al terreno di coltura vengono aggiunti:
Supplementi o siero
Glutammina
Antibiotici
Il terreno così composto può essere conservato a 4°C per un mese e mezzo al massimo
(meglio un mese)
Il terreno di coltura deve essere riscaldato a 37°C prima di essere messo in contatto
con le cellule.
Non riscaldare l’intero contenitore di terreno, solo la quantità necessaria
Eventuali fattori di crescita (per stimolare la proliferazione o il differenziamento)
vanno addizionati al terreno già riscaldato appena prima dell’uso, in quanto si
degradano velocemente a 37°CContaminazione
Ambientale: Stanze per colture cellulari a norma
Pulizia delle superfici
Non portare materiale fuori dalla stanza colture
Operatore: Le colture cellulari possono essere contaminate (virus) o trasformarsi
durante l’uso
Procedure e tecniche che riducono il rischio per l’operatore (cappe a flusso
laminare, dispositivi di protezione individuale)
Le colture cellulari di derivazione umana devono sempre essere considerate
pericolose
Colture: Più frequenti da lieviti, funghi e micoplasmi; possono uccidere le
colture (lieviti, funghi e batteri) o alterare le caratteristiche delle cellule
(micoplasmi)
E’ necessario lavorare in condizioni di sterilitàContaminazione della coltura
Terreno di coltura tendente al giallo e torbido
Batteri Funghi
Lieviti Virus
Micoplasmi
Hoechst: attraversa le membrana cellulare e si lega al DNASterilità
Assenza di microrganismi inquinanti (batteri, funghi, micoplasmi, virus)
Trattamento dei materiali con autoclavi e stufe
Irraggiamento (UV) delle superfici
Ultrafiltrazione dei liquidi (membrane con pori Ø 0,4 – 0,2 µm)
Disinfettanti (prima di introdurre materiale sotto la cappa sterile)
Addizione di antibiotici nei terreni (preventiva)
Manipolazione in atmosfera sterile (cappe a flusso laminare)
Incubatori
Norme di comportamento in stanza delle colture
uso dei dispositivi di protezione individuale;
divieto di mangiare o bere all’interno della stanza;
non parlare mentre si lavora sotto la cappa sterile;
pulire la cappa prima e dopo l’utilizzo;
controllo periodico dei filtri della cappa;
uso di materiali monouso sterili, ad esempio pipette, fiasche e piastre petri etc,pH
pH fisiologico: 6.8 – 7.8 (dipende dall’origine della coltura cellulare)
Ma il terreno di coltura tende ad acidificarsi a causa dei prodotti del metabolismo
cellulare
Nei terreni di coltura si trovano:
Sistemi tampone (comunemente
bicarbonato di sodio)
Rosso fenolo (indicatore di pH)
Giallo = pH acido
Rosso-arancio = pH neutro
Viola = ph basico
Se il terreno di coltura tende al viola,
non deve essere usato!Concentrazione CO2 e O2
Incubatori mantengono costante CO2
pCO2 (pressione parziale CO2) solitamente 5%
Corrisponde alla pressione parziale di CO2 media nei tessuti (4.6% - 5.9%)
Contrasta l’acidificazione del terreno dovuta al metabolismo cellulare
La pCO2 ottimale per la coltura cellulare dipende dal tipo di cellule coltivate
Nell’incubatore: 5% CO2 e 95% aria
Se all’interno dell’incubatore, il terreno di coltura tende al giallo, significa che il
metabolismo cellulare (proliferazione) sta acidificando il terreno
Se invece il terreno tende al viola, la regolazione della pCO2 dell’incubatore non è ben
calibrata o le cellule stanno morendoTemperatura
Il mantenimento della temperatura ottimale è garantito dagli incubatori termostatati
La temperatura ottimale dipende dal tipo di cellule in coltura
Generalmente è 37°C, ma può essere inferiore
In generale, le cellule possono sopravvivere a lievi ipotermie rispetto alla
temperatura ottimale, ma lievi ipertermie portano a morte o alterazioni
Umidità
Il mantenimento di un corretto grado di umidità impedisce al terreno di coltura di
evaporare (la temperatura all’interno di un incubatore è superiore ai 30°C)
Il fondo degli incubatori termostatati viene riempito di acqua (sterile)
Il livello dell’acqua deve essere monitorato costantementeSupporto di coltura La plastica per coltura è generalmente in polistirene, trasparente al microscopio. Viene trattata per essere sterile e atossica nei confronti delle cellule. La superficie è idrofila e carica negativamente, in modo da favorire il legame dei fattori di adesione presenti nel siero o aggiunte dall’operatore in un secondo momento, Nel caso di colture cellulari in sospensione è necessario usare plastica trattata appositamente allo scopo di inibire l’adesione delle cellule alla superficie. I supporti di coltura maggiormente usati sono le piastre multiwell, le piastre Petri e le fiasche
Substrato
Tipi diversi di cellule richiedono la presenza (o l’assenza) di un substrato proteico che
favorisca l’adesione delle cellule stesse alla superficie
Esempi: cellule endoteliali e cellule neuronali richiedono un substrato
più comuni: laminina, fibronectina, collagene, poli-L-lisina, gelatina,
Matrigel (mix di proteine)
cellule ematopoietiche (linfociti), alcuni tipi di cellule staminali vengono
coltivate in sospensioneVitalità
Una densità di cellule in coltura troppo alta provoca sofferenza, e spesso alterazioni,
delle cellule
Cellule in adesione crescono fino ad occupare l’intera superficie a disposizione: sono
confluenti.
Regola generale: non superare l’80%
della confluenza
Cellule in sospensione, non aderendo alla superficie di coltura, non offrono un segnale
così chiaro del raggiungimento della densità massima
E’ necessario contare le celluleConta delle cellule
Camera di Burker
Contare le cellule vitali nei 4 quadranti
Il numero di cellule/ml è:
Numero di cellule contate x Fattore di diluizione x 104
4Coloranti vitali
Trypan Blue: internalizzato solo dalle cellule morte, che quindi diventano blu opaco; le
cellule vive sono bianche e “luminose” (rifrangono la luce emessa dal
microscopio)
Un’aliquota di sospensione cellulare viene mescolata con Trypan Blue al
rapporto desiderato (1:10, 1:2, a seconda della densità delle cellule in
coltura) e lasciata riposare a T. amb. per 5-10 minuti.Coloranti vitali
Ioduro di Propidio: intercalante del DNA, diventa fluorescente solo quando va ad inserirsi
tra I filamenti di DNA.
Le cellule sane non sono permeabili al PI solo le cellule non vitali
diventano fluorescentiColoranti vitali
Diacetil fluoresceina: tutte le cellule incorporano la forma esterificata (non fluorescente),
ma solo le cellule vitali sono in grado di produrre la forma idrolizzata
fluorescente (verde).
Le cellule non vitali possono essere evidenziate con PI (rosse)Applicazioni delle colture cellulari:
studio di farmaci
Farmaco
Cambiamenti Vitalità
(RNA, proteine, studi funzionali)Applicazioni delle colture cellulari:
organi su chipApplicazioni delle colture cellulari:
polmoni su chip
http://www.elveflow.com/microfluidic-
tutorials/cell-biology-imaging-reviews-and-
tutorials/microfluidic-for-cell-biology/a-review-
about-organs-on-chip/
Huh, D. et al., Reconstituting organ-level lung functions on a chip, Science, 2010Applicazioni delle colture cellulari:
fegato su chip
https://ncats.nih.gov/tissuechip/chip/liver
https://ncats.nih.gov/tissuechip/chip/liverApplicazioni delle colture cellulari:
uomo su chip
http://youngzine.org/news/technology/organs-chipOligodendrociti Gli oligodendrociti sono cellule formanti mielina, la quale ricopre gli assoni migliorando efficienza e velocità di trasmissione dei potenziali d’azione. La guaina mielinica ha il principale compito di isolare gli assoni, è ricca di lipidi che le conferiscono caratteristiche di isolante ed è costituita da particolari proteine che la caratterizzano.
Danno agli oligodendrociti
Demielinizzazione da parte degli oligodendrociti
perdita della funzionalità degli assoniDanno agli oligodendrociti
oligodendrocytes from meningeal stem cells
can be used regenerative medicineOligodendrociti dalle meningi
1st: obtain stem cells from meninges
Isolation of
meninges
In vitro cultureOligodendrociti dalle meningi
2nd: obtain oligodendrocytes from meningeal cells
Oligodendrocytes from
meningeal stem cells
Cells in culture
Add PDGF and T3Oligodendrociti dalle meningi: protocollo NS: A small spinal cord meningeal biopsy is isolated and cultured in neurosphere expansion medium OliGo1 : Neurosphere dissociation and culture in oligodendrocyte induction medium in floating conditions OliGo2 : Oligosphere dissociation and cell culture in oligodendrocyte differentiation medium in adherent condition OliGo3 : Final differentiation with oligodendrocyte maturation medium
Oligodendrociti dalle meningi: protocollo
Oligodendrociti dalle meningi: davvero?
Nestin, Vimentin and other stemness and neural progenitor markers
are expressed at low levels by the end of the protocol
Neural Progenitor-related genes
NS
Relative Gene Expression
Expression of stemness-related genes OliGo1
OliGo2
Nanog, Oct4, Sox2 and Pax6 was OliGo3
detected only at very low levels at every
step of the protocol
Vimentin Nestin
One-way ANOVA and Bonferroni post-test. *pOligodendrociti dalle meningi: davvero?
Pre-oligodendrocyte and immature oligodendrocyte markers
are expressed in the intermediate stages of the differentiation protocol
Oligodendrocyte Progenitors
NS
Relative Gene Expression
OliGo1
OliGo2
OliGo3
Olig1 Olig2 Nkx2.2 Cspg4
One-way ANOVA and Bonferroni post-test. *pOligodendrociti dalle meningi: davvero?
Expression of myelin-specific genes:
1- high increase by the end of the protocol
Mature Oligodendrocyte - High Increase
NS
Relative Gene Expression
OliGo1
OliGo2
OliGo3
Mag Mbp Mog Plp1
One-way ANOVA and Bonferroni post-test. *pOligodendrociti dalle meningi: davvero?
Expression of myelin-specific genes:
2- Cnp increases by the end of the protocol
Mature Oligodendrocyte - Low Increase
NS
OliGo1
Relative Gene Expression
OliGo2
OliGo3
Cnp, Mag, Mbp, Mog and Plp1 are
considered the signature of mature
oligodendrocytes in vivo and in vitro
GalC Sox10 CaII Cnp
One-way ANOVA and Bonferroni post-test. *pOligodendrociti dalle meningi: davvero?
Under our culture conditions, LeSCs do not differentiate into neurons or
astrocytes
Neurons
NS
Relative Gene Expression OliGo1
OliGo2
OliGo3
Dcx Tub3 Syt1
One-way ANOVA and Bonferroni post-test.
n=5
Gene expression of the mature marker Mtap2 and the astrocytic markers Gfap and Aqp4 were
detectable only at low levels
Immunofluorescence analysis detected rare expression of the neuronal markers Tuj1 and MAP2,
while the astrocytic marker GFAP was never observedCellule Nestina+ nelle corteccia di ratto
Immunofluorescenza su
campioni di cervello di
ratto in diverse fasi
dello sviluppo
Nestina: filamento
intermedio tipico delle
cellule progenitrici
neurali
SVZ: nicchia
riconosciuta di cellule
staminali/progenitrici
neuraliIsolamento delle cellule da tessuto
Cervello di ratto Sprague-Dawley al 15°
giorno dopo la nascita (P15)
Prelievo delle leptomeningi
Dissociazione delle meningi:
Enzimatica: Collagenasi (10 minuti 37°C)
Tripsina e DNAsi (5 minuti 37°C)
Meccanica: pipetta 10ml
pipetta 5ml
pasteur di vetro
Azione degli enzimi bloccata dall’aggiunta di terreno contenente siero
Centrifugazione
Filtrazione (per eliminare i frammenti di tessuto rimasti)Caratterizzazione delle cellule
FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorting
Cellule in sospensione in PBS
Incubazione con anticorpo anti-Nestina coniugato con un
fluoroforo
Valutazione della percentuale di cellule Nestina+ nella popolazione
cellulare
Neurosfere: Aggregati cellulari sferici derivati dalla proliferazione di singole cellule in
colture in sospensione
La capacità di formare neurosfere è una delle caratteristiche principali delle cellule
staminali/progenitrici neurali
Le cellule isolate dalle meningi sono state coltivate nel
terreno di coltura solitamente usato per indurre la
generazione di neurosfere da cellule dell’SVZ
Neurobasal bFGF
Glutammina EGF
Pen/Strep
B27
Le cellule isolate dalle leptomeningi formano neurosfere N2Colony-Forming Unit Colony-Forming Unit (CFU): Cellula in grado di dare generare una colonia di cellule derivate dalla replicazione della cellula di origine Molte cellule dell’organismo sono in grado di proliferare in vitro, ma solo per un numero limitato di volte (piccole colonie). Le cellule staminali/progenitrici sono invece in grado di formare colonie molto numerose. Una coltura di cellule staminali/progenitrici comprende un alto numero di CFU Importante: • Una coltura di cellule staminali/progenitrici mantiene un alto numero di CFU anche dopo diversi passaggi • Se le cellule sono staminali/progenitrici, una cellula isolata da una colonia forma a sua volta una colonia
Analisi dell’immunofenotipo della
coltura
La coltura in vitro può modificare le proprietà delle cellule stesse.
Nestin MAP2 GFAP
L’analisi con FACS consente di verificare il
livello di espressione di un marker di
interesse
CD106 CD31 CD34
CD106: marker cellule staminali
mesenchimali marker
CD45 CD90 isotype control
CD31: marker cellule endoteliali
CD34: marker cellule staminali
ematopoietiche
CD45: marker leucociti
CD90: marker non specifico cellule
staminaliAnalisi dell’espressione proteica
Le neurosfere sono formate da una popolazione cellulare eterogenea, composta da
cellule staminali/progenitrici (nel core della neurosfera) e cellule in via di
differenziamento negli strati più superficiali.
Nestina: marker cellule staminali/progenitrici
MAP2: Microtubule-Associated Protein 2
marker neuronale
GFAP: marker astrocitiDifferenziamento in vitro
Coltura in terreno di differenziamento in
senso neuronale
Diminuisce l’espressione di Nestina
Aumenta l’espressione di MAP2
Immunofluorescenza per studiare la
morfologia delle cellule MAP2+
BrdU: analogo della Timidina
viene incorporata dalle cellule in
replicazione, sostituendosi alla
Timidina
Le cellule MAP2+ derivano da cellule
proliferanti nella coltura, non sono neuroni
pre-esistenti
Spine dendritiche, tipiche dei neuroniAnalisi dell’espressione genica
RT-PCR: Reverse Transcriptase PCR
Consente di retrotrascrivere cDNA a partire dall’RNA
In questo modo si può valutare l’espressione dei geni effettivamente
espressi dalla cellula
Si preleva una quantità di cellule (minimo 105) dalla popolazione in coltura
Le cellule vengono sospese in TRIzol (soluzione chimica che favorisce la rottura delle
membrane e delle componenti cellulari mantenendo al contempo l’integrità degli acidi
nucleici)
Conservate a -80°C
Misurata la quantità di RNA contenuta nei campioni
PCR e quantificazione (relativa)Time course in coltura aderente Osservazione delle colonie derivate da cellule delle meningi a diversi time-points: Nelle prime fasi della coltura sono visibili cellule Nestina+ e qualche cellula NG2+ Durante le diverse fasi, le cellule Nestina+ continuano a proliferare formando colonie omogenee. Non ci sono cellule NG2+ o GFAP+ Anche in condizioni di aderenza, le cellule isolate dalle leptomeningi mantengono la capacità proliferativa e l’espressione di Nestina
Differenziamento in vitro Sinaptofisina: proteina pre-sinaptica GAD67: enzima coinvolto nel metabolismo del glutammato; marker neuroni GABAergici GluR2: recettore per il glutammato il recettore più comune nel CNS
Differenziamento in vitro
Calcium Imaging: misurazione dei livelli cellulari di ioni Calcio tramite uso di indicatori
Gli ioni Calcio fungono da segnali intracellulari in tutti i tipi cellulari. Nei neuroni regolano l’esocitosi dei
neurotrasmettitori, la plasticità sinaptica e la trascrizione genica.
Fura-2: indicatore fluorescente; eccitato a 350/380 nm emette fluorescenza proporzionale al livello di ioni Calcio.
Consente valutazione quantitativa.
La depolarizzazione (KCl) attiva i canali del Calcio voltaggio-dipendenti che si aprono e fanno entrare ioni Calcio.
I neuroni derivati dalle cellule delle leptomeningi mostrano livelli di Calcio simili a quelli
misurati da colture primarie di neuroni Possono essere differenziate in
neuroni funzionaliPotenziale differenziativo in
vivo
Riconoscimento delle cellule trapiantate Espressione di EGFP
Cellule isolate dalle leptomeningi di ratti transgenici EGFP
Trapiantate nell’ippocampo di ratti adulti
McCaffery P, Zhang J, Crandall JE J Neurobiol.
2006
Cheung and Cardinal BMC Neuroscience 2005Potenziale differenziativo in
vivo
4 settimane
Analizzate tramite immunofluorescenza
Doppia immunofluorescenza: anticorpo anti-EGFP (verde) e anticorpo anti-GFAP,
-MAP2 o -NG2 (rosso)
Cellule EGFP+ nella Astrociti (GFAP) circondano
zona di iniezione le cellule EGFP+ nella zona
dell’iniezione
Real time PCR: espressione di EGFP solo nei ratti trapiantatiPotenziale differenziativo in
vivo 4 settimane
Molte cellule
EGFP+ sono
anche Nestina+
Rare cellule
EGFP+/GFAP+
Rare cellule
EGFP+/NG2+Potenziale differenziativo in
vivo 8 settimane
La maggior parte delle cellule EGFP+ (49,8%)
sono MAP2+
La maggior parte delle cellule EGFP+/MAP2+ si
trovano nella regione CA1 dell’ippocampo
Alcune cellule EGFP+ mostrano
morfologia complessa e simile a quella dei
neuroni piramidali dell’ippocampo
Neuronal Dynamics
Laboratory
University of UtahPotenziale differenziativo in
vivo 8 settimane
Cellule EGFP+/MAP2+ nello strato
piramidale e nello stratum oriens
dell’ippocampo
Alcune cellule EGFP+/MAP2+ sono
migrate nella sub-granular zone (SGZ) del
giro dentatoConclusioni
Le cellule isolate dalle leptomeningi sono Nestina+ e possono essere
coltivate in vitro sottoforma di neurosfere
Le cellule delle leptomeningi (in colture aderenti e di neurosfere)
esprimono alti livelli di geni correlati alla staminalità
Le cellule possono proliferare in coltura per diversi mesi e possono
essere indotte a differenziare con alta efficienza in cellule della linea
neuronale
Una volta trapiantate nell’ippocampo del ratto adulto, le cellule delle
leptomeningi si integrano nel tessuto e acquisiscono caratteristiche
simili a quelle dei neuroni maturi (espressione di MAP2 e morfologia)
Presenti nell’adulto
Proliferazione in vitro Leptomeningeal Stem/progenitor
Cells (LeSCs)
Differenziamento in
neuroni in vitro e in
vivoPuoi anche leggere
