C.I. MEDICINA DI LABORATORIO MICROBIOLOGIA CLINICA - UniCH
←
→
Trascrizione del contenuto della pagina
Se il tuo browser non visualizza correttamente la pagina, ti preghiamo di leggere il contenuto della pagina quaggiù
C.I. MEDICINA DI LABORATORIO MICROBIOLOGIA CLINICA CdS MEDICINA E CHIRURGIA AA 2018-2019 Modulo 5: Meningite: diagnosi microbiologica Giovanni Di Bonaventura, PhD Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel. 0871 3554812) Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel. 0871 541519) E-mail: gdibonaventura@unich.it
Sistema nervoso Organizzazione • Sistema Nervoso Centrale (SNC): encefalo e midollo spinale • Sistema Nervoso Periferico (SNP): nervi periferici • Fisiologicamente sterile: – assenza di flora “autoctona” • Difese naturali del SN: – cranio e vertebre – cellule di microglia e macrofagi – presenza di una Barriera Emato-Encefalica (BEE) e della Barriera Emato-fluido cerebrospinale (BECS) che impediscono l’accesso cerebrale/meningeo a: • microrganismi • farmaci (es. antibiotici) • sistema immune
Sistema Nervoso Centrale Infezioni • Sindrome clinica: – Meningite (acuta o cronica) – Encefalite (acuta o cronica) – Sindrome da lesione occupante spazio – Mielite – Neurite – Radicolite – Nevrassite – Ascessi cerebrali • Eziologia: – ampio spettro di microrganismi (virus e batteri, quindi miceti, protozoi ed elminti; maggiore prevalenza in pazienti immunocompromessi)
Meningi Struttura ed organizzazione 3 membrane connettivali (nell’insieme costituiscono la barriera emato-encefalica) a rivestimento del cervello e della colonna vertebrale: – Dura madre • doppio strato: il primo a contatto con il periostio; l’altro, a contatto con le meningi (decorre attraverso il foramen magnum, copre CN’s) – Aracnoide • tesa a ponte sopra i solchi cerebrali • granulazioni aracnoidali che si proiettano nei seni venosi, (dove il liquor diffonde verso il leptomeningi torrente ematico) • spazio subaracnoidale occupato dal liquor cefalo-rachidiano – Pia madre • delicata, altamente vascolarizzata • a contatto con il cervello e la colonna vertebrale
Meningi Spazi meningei Con il rachide, le meningi delimitano tre spazi: ▪ vertebra < spazio EPIDURALE < dura madre ▪ dura madre < spazio SUBDURALE < aracnoide ▪ aracnoide < spazio SUBARACNOIDALE < pia madre (contiene il liquor; sede specifica di esordio della meningite) Ciascuno di questi spazi può essere sede di infezioni distinte.
I villi estremamente vascolarizzati della pia madre si proiettano in 4 ventricoli all’interno dell’encefalo e sono rivestiti da cellule epiteliali ependimali. Queste proiezioni, note come plessi coronoidei, sono i siti nei quali la componente fluida del sangue è modificata attraverso secrezione e assorbimento di certi soluti e convogliata all’interno dei ventricoli sotto forma di liquido cefalorachidiano (LCR) o liquor (adulti: 400-600 ml/die; volume totale: 40- 60 ml nei neonati e 100-160 ml negli adulti). Il liquor circola nei ventricoli e nello spazio subaracnoidale, attorno all’encefalo ed alla corda spinale e ritorna al sistema circolatorio sanguigno attraverso i villi subaracnoidali che proiettano nel seno sagittale superiore nella volta interna del cranio.
Meningite: definizione e tipologia Definizione La meningite è l’espressione clinica della infiammazione delle meningi: pachimeningite (dura madre), leptomeningite (pia madre, aracnoide). Se severa, può evolvere in encefalite, stato infiammatorio del cervello. Può essere causata da agenti infettivi, metastasi, agenti chimici e/o farmaci. Meningite infettiva - tipologia FULMINANTE: evoluzione rapida (coma, shock), quasi sempre irreversibile. ACUTA: esordio e sviluppo nel corso di ore o di pochi giorni. SUBACUTA: decorso lento e insidioso, con segni meningei sfumati (solitamente causata da bacillo tubercolare oppure da miceti). RICORRENTE: episodi ripetuti, anche a distanza; generalmente espressione di un difetto dell'ospite, dell'anatomia locale oppure delle difese antibatteriche immunologiche (trauma cranico, pazienti HIV+, ecc). DECAPITATA: con decorso attenuato per una precoce terapia antibiotica (N. meningitidis; alta frequenza di falsi negativi al colturale).
Meningite patogenesi I microrganismi debbono superare la barriera morfo-funzionale (emato-liquorale, emato-encefalica, meningo-encefalica) posta a protezione di LCR e SNC: – via ematogena (batteriemia, viremia): la più frequente – per contiguità: • da focolai infettivi parameningei (otiti, sinusiti, mastoiditi, ascessi cerebrali) attraverso la lamina cribrosa etmoidea, la guaina olfattoria, plessi corioidei, i vasi ematici/linfatici; • comunicazioni anomale post-chirurgiche e traumatiche (secondaria a frattura della base cranica) fra gli spazi subaracnoidali e siti colonizzati (naso e seni paranasali); • drenaggio di LCR; – per contagio diretto: rachicentesi, ferite penetranti, traumi cerebrali aperti, fratture, interventi neurochirurgici Le forme PRIMARIE, si sviluppano in assenza di infezioni extra-cerebrali. Nelle forme SECONDARIE, l’infezione diffonde per contiguità dai foci infettivi parameningei, o per metastasi da foci situati a distanza (tifo, polmonite,tubercolosi). Site all’interfaccia tra circolo sistemico e parenchima cerebrale, le leptomeningi - in particolare gli spazi di Virchow-Robin - rappresentano il principale sito di ingresso dei microrganismi. Il liquor è veicolo di diffusione dell’infezione che, se non contrastata, si estende al parenchima cerebrale (meningo-encefaliti).
Photomicrograph (original magnification, x20; hematoxylin-eosin stain) of a coronal section through the anterior perforated substance shows two arteries (straight arrows) with surrounding VR spaces (curved arrows).
Meningite batterica: patogenesi MECCANISMI DI DIFESA DELL’OSPITE ▪ Fimbrie (pili) ▪ Capsula ▪ Epitelio mucosale ▪ Proteasi vs IgA ▪ IgA secretorie (pneumococco) ▪ Attività ciliare ▪ Endocitosi (menigococco) ▪ Abs anti-capsulari ▪ Rottura tight-junctions epitelio colonnare (H. influenzae) ▪ Recettori specifici (H. influenzae, N. meningitidis) ▪ Complemento ▪ Abs specifici ▪ Fimbrie (pili) ▪ Associazione con Barriera Emato-Encefalica monociti (BEE) ▪ Capsula ▪ ridotti livelli di fagociti e IgG ▪ ridotta attività opsonizzante VIRULENZA DEL MICRORGANISMO
Meningite batterica: patogenesi
Meningite eziologia BATTERICA • le meningiti batteriche vengono indicate con il termine “meningiti purulente” (a liquor purulento) • meno frequenti ma estremamente più gravi, potendo causare exitus o danno cerebrale, anche in presenza di trattamento VIRALE • le meningiti virali vengono indicate come “meningiti asettiche” (a liquor trasparente) • rappresenta la eziologia più frequente e, generalmente, si risolve in assenza di trattamento FUNGINA • frequente nell’ospite immunocopromesso (C. neoformans in AIDS), si manifesta spesso in maniera subdola PROTOZOI • T. brucei, P. falciparum, T. gondii
Meningite batterica epidemiologia ▪ Incidenza: 1 milione di casi/anno (mondiale); 3-12 casi/100.000 abitanti/anno (Italia) ▪ Mortalità: 10% negli adolescenti, 25% nei neonati e negli adulti ▪ Fattori di rischio: età, gravidanza, ambienti comunitari, immunocompromissione ▪ Trattamento disponibile: terapia antibiotica (“mirata” vs l’agente eziologico) ▪ Reservoir: uomo ▪ Eziologia: dipendente dall’età del paziente; tuttavia, le meningiti pneumococciche sono le più comuni in Italia (0.48 casi/100.000 abitanti/anno) ed associate al più alto tasso di mortalità (20-50%): 1. neonati (< 1 mese): Streptococcus agalactiae (50-60%) Escherichia coli (20-30%) Listeria monocytogenes (2-10%) 2. bambini e ragazzi fino a 15 anni: Neisseria meningitidis (25-40%; sierotipi B-C maggiormente prevalenti in Italia) Streptococcus pneumoniae (10-20%) Haemophilus influenzae tipo b (5-10%) 3. adulti (anziani, immunocompromessi): Streptococcus pneumoniae (30-50%) Neisseria meningitidis (10-35%) (causa principale di fenomeni epidemici) Staphylococcus aureus (5-15%) altri (L. monocytogenes, H. influenzae) (1-10%) La pratica vaccinale ha significativamente ridotto l’incidenza dei casi dovuti a pneumococco, meningococco e, soprattutto. H. influenzae. Meningite da anaerobi: associata a foci contigui di infezione (otite, sinusite, faringite, ascesso cerebrale, tumori testa/collo, interventi chirurgici o ferite infette, post-trauma, post-operatorio neurochirurgico).
A D Principali agenti eziologici di B E meningite batterica: A. Escherichia coli K1 B. Streptococcus agalactiae C. Listeria monocytogenes D. Neisseria meningitidis E. Haemophilus influenzae F. Streptococcus pneumoniae C F
Meningiti virali (“asettiche”) • Decorso meno grave della meningite batterica: benigno, a risoluzione spontanea • Sindrome caratterizzata da comparsa acuta di sintomi meningei (febbre, cefalea, fotofobia) ma senza rigidità nucale • La meningite asettica è causata generalmente da virus, sebbene possa avere differente eziologia: – M. tuberculosis – Funghi – Leptospira • Aspetto del liquor: trasparente, mai purulento • Cellularità del liquor: pleiocitosi (inizialmente mista neutrofilo-mononucleare, quindi linfomonocitica)
Meningite virale epidemiologia Epidemiologia fortemente condizionata da fattori geografici. ▪ Incidenza: 1 milione di casi/anno (mondo); 5-35 casi/100.000 persone/anno (Italia) ▪ Mortalità: decorso meno grave della meningite batterica; benigno, a risoluzione spontanea ▪ Fattori di rischio: età, gravidanza, ambienti comunitari, immunocompromissione ▪ Trasmissione: principalmente interpersonale, ma anche vettori animati (artropodi) per Arbovirus. ▪ Incubazione: Variabile: 3-6 gg (Enterovirus), 2-15 giorni (Arbovirus) ▪ Trattamento disponibile: generalmente va incontro ad autorisoluzione. ▪ Reservoir: uomo (Enterovirus, Adenovirus, Morbillivirus, Herpes Simplex, Varicella) o naturale (uccelli per Arbovirus) ▪ Eziologia: Enterovirus quale causa più frequente (85%): - coxsackievirus, a maggiore incidenza nella stagione estivo-autunnale e soprattutto in età pediatrica - echovirus (in particolare i sierotipi 1-9, 11-25, 30, 31) possono causare infezioni sporadiche o ad andamento epidemico, prevalenti nei mesi estivi-autunnali
Meningite virale eziologia ▪ Enterovirus (Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus), le più comuni (85%) ▪ Herpesvirus (HSV 1/2, Varicella-zoster, Epstein Barr, CMV). ▪ Togavirus (Eastern/Western/Venezuelan equine, St. Louis, Powasson, California, West Nile) ▪ Mixo/paramyxovirus (Influenza/parainfluenza, Parotite, Morbillo) ▪ Miscellaneous (Adenovirus, LCM, Rabbia, HIV)
Meningite virale: patogenesi Colonizzazione mucosa nasale Sede intracellulare viremia nervi olfattivi BEE Fattori virali: Sopravvivenza nel – dimensione inoculo SNC – virulenza – neurotropismo (rabbia, HSV tipo I)
Meningite diagnosi clinica ▪ Esordio della sindrome meningea: ▪ brusco, entro le 24h dal contagio (forme virali e tipicamente in quelle batteriche) ▪ lentamente progressivo (forme tubercolari) ▪ Sintomatologia indipendente dalla eziologia: ▪ ragazzo e adulto*: cefalea, febbre (moderata ad elevata), rigidità nucale, sensorio obnubilato, vomito cerebrale, allucinazioni, delirio; in rari casi sintomatologia assente ▪ nel neonato** (precoce, entro 48h di vita; tardiva, 7 giorni-6 settimane) è spesso assente la specifica sintomatologia *ADULTO: quasi tutti i pazienti mostrano almeno 2 tra cefalea, febbre, rigidità nucale, confusione mentale. **NEONATO: apiretico (50%); alterazioni gastrointestinali (50%); precoce (sepsi); tardiva (alterazioni SNC)
Meningite diagnosi ▪ La diagnosi di meningite infettiva richiede un approccio multidisciplinare: una anamnesi ed un esame fisico dettagliati, unitamente ad un elevato sospetto clinico e colture appropriate. ▪ il campione deve essere accompagnato da informazioni cliniche necessarie all’orientamento della indagine microbiologica: età, stato immunitario e tipologia di depressione/soppressione eventualmente presenti, contesto clinico ed epidemiologico (convulsioni, porpora, interventi chirurgici neurologici con indicazione della via di ingresso, trauma, casi in famiglia, viaggi all’estero). ▪ La prognosi di meningite dipende da una diagnosi eziologica rapida e da una tempestiva definizione di una adeguata terapia antibiotica, soprattutto nelle forme acute.
Meningite diagnosi di laboratorio ▪ Le infezioni del SNC, la meningite in particolar modo, rappresentano una vera emergenza medica. Debbono quindi essere: – riconosciute tempestivamente – correlate, possibilmente, con l’agente patogeno – trattate immediatamente sulla base della eziologia ▪ L’analisi di base del LCR si effettua «in urgenza» ed il Laboratorio svolge un ruolo fondamentale. ▪ Il maggior contributo alla diagnosi eziologica è sicuramente dato dallo studio microbiologico del liquor cefalorachidiano (LCR). ▪ L’agente causale viene generalmente ricercato mediante tecniche dirette (batteri: esame microscopico, ricerca di antigeni, amplificazione genica, isolamento colturale; virus: amplificazione genica) principalmente nel LCR, ma anche in altri campioni (batteri: sangue, tampone cutaneo; virus: sangue, tampone faringeo, feci).
Meningite diagnosi di laboratorio fase ANALITICA (LCR) fase PRE-ANALITICA 1. Valutazione MACROSCOPICA • RACCOLTA e 2. Valutazione TRASPORTO di LCR MICROSCOPICA (e/o altri campioni) 3. Indagini CHIMICO- FISICHE
Fase pre-analitica - rachicentesi controindicazioni ▪ Il sospetto di meningite richiede il prelievo di LCR mediante esecuzione della puntura lombare (rachicentesi), anche in presenza di sintomatologia sfumata. ▪ La rachicentesi non è esente da rischi: la complicanza più temuta è «l’incuneamento», che si verifica quando le tonsille cerebellari erniano attraverso il foramen magnum del cranio, comprimendo le strutture cerebrali vitali del peduncolo. ▪ Ciò accade più facilmente in presenza di lesioni cerebrali espansive (tumori, empiema subdurale, infarto cerebrale) o di pressione intracranica aumentata. ▪ I pazienti con papilledema e/o segni neurologici di lesioni localizzate dovrebbero essere sottoposti a TAC prima di altre procedure volte ad escludere una lesione. ▪ L’esecuzione di una TAC comporta un ritardo nell’esecuzione della rachicentesi e, quindi, nell’avvio della terapia antibiotica che, nelle forme batteriche acute, deve essere avviata entro 1 h dalla formulazione del sospetto clinico. Si avvia una terapia empirica, PREVIO prelievo di sangue per emocoltura. ▪ Altre controindicazioni per la rachicentesi sono: ▪ infezioni cutanee (al sito di puntura) ▪ paziente instabili o con diatesi emorragica come risultato di una sindrome settica ▪ ostruzione/blocco alla circolazione del LCR (stenosi, malformazioni, tumori spinali)
Fase pre-analitica - rachicentesi indicazioni • LCR è un materiale biologico molto prezioso: il prelievo, l’utilizzo e la sua conservazione debbono essere previamente ed accuratamente concordati tra il Clinico ed il Microbiologo, in modo che le procedure analitiche abbiano inizio immediatamente dopo il prelievo del campione. • La raccolta andrebbe effettuata, quando possibile, prima dell’inizio della terapia antibiotica poiché essa: – modifica il significato diagnostico di varie tecniche – interferisce con l’isolamento colturale (falsi-negativi) In caso contrario, bisogna avvertire il Laboratorio affinchè si possano mettere in atto procedimenti in grado di minimizzare gli effetti inibitori sui microrganismi (resine che rimuovono gli antibiotici, aumento dei volumi colturali e di liquor per diluire l’effetto inibente). • E’ necessario segnalare la sede di prelievo (lombare, ventricolare, cistico), poiché i valori di riferimento sono, di norma, attribuiti al liquor lombare.
Fase pre-analitica - rachicentesi esecuzione ▪ Operare in asepsi: usare guanti sterili ed eseguire accurata disinfezione della cute nella zona di prelievo ▪ Il paziente viene invitato ad assumere una posizione atta a separare i processi spinosi delle vertebre lombari ▪ Inserimento ago nel canale spinale generalmente tra L3-L4, ma anche L4-L5 o L5-S1 ▪ Il liquor può anche essere ottenuto dal ventricolo, cisterna o fontanelle, o dal drenaggio di riserva ▪ Prelievo LCR (pressione > 600 mm Hg: fuoriuscita “spontanea”)
Fase pre-analitica raccolta del LCR E’ consigliabile prelevare 3 campioni, numerati sequenzialmente: #1 (chimico-fisico), #2 (microscopico, ricerca Ag), #3 (colturale, molecolare) ▪ Standardizzare il volume da prelevare: – raccolta in provette sterili, fondo conico e tappo a vite (siliconate, per evitare l’adesione dei monociti alle pareti) – totale: 9-12 ml (3-4 ml/provetta; minimo 2 ml); max vol prelevabile (adulto): 15-20 ml – volumi maggiori o campioni ripetuti per ricerca di M. tuberculosis o funghi – possibilità di confrontare diversi prelievi (intra-, inter-paziente) ▪ Evitare contaminazione ematica e/o cutanea (principale causa di errore pre-analitico): – contaminazione ematica: generalmente secondaria al trauma da puntura lombare (diminuzione conteggio eritrociti dal 1o al 3o campione); non processare il campione in presenza di massiccia contaminazione (inibitori di crescita batterica e/o PCR) – il 3° campione è destinato al colturale (meno soggetto a contaminazioni cutanee) ▪ Seminare, al momento stesso del prelievo, parte del liquor in 2 flaconi (aerobi e anaerobi) per emocoltura
Fase pre-analitica raccolta di altri campioni ▪ Sangue da prelevare, contestualmente al LCR, per: – indagini biochimiche e sierologiche (emocromo per conteggio cellulare) – emocoltura per ricerca di funghi/batteri indicanti una sottostante infezione sistemica – diagnostica siero-immunologica ▪ Tamponi (nasale, faringeo o vescicolare): devono essere trasportati tramite apposito terreno per la ricerca dei virus e batteri. ▪ Biopsia cutanea: in caso di porpora (meningite meningococcica, meningite da Streptococcus pneumoniae e Rickettsia rickettsiae). ▪ Urine: in contenitore sterile. ▪ Feci: vanno raccolte in contenitori sterili, per una eventuale ricerca di enterovirus.
Fase pre-analitica Trasporto del campione ▪ Il trasporto deve essere effettuato in “sicurezza biologica”: inserire i campioni in un contenitore rigido di plastica a chiusura ermetica. ▪ Inviare i campioni in laboratorio entro 15-30 min (max 2h) dal prelievo: – ipotonicità del liquor causa la lisi dei neutrofili (alterata conta cellulare) – diminuzione della vitalità batterica: • mortalità aumenta da 32% (dopo 1 h) al 50% (dopo 24 h) ▪ Trasportare a temperatura ambiente, evitando la refrigerazione: – N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae sono organismi “esigenti” che non potrebbero sopravvivere a lunghi tempi di trasporto (cronolabili) od a variazioni di temperatura (termosensibili) – è, tuttavia, consigliabile congelare il campione residuo dalla esecuzione dell’esame colturale e microscopico, nel caso di ricerca virus mediante PCR ▪ Qualora si sospetti la presenza di anaerobi (materiale purulento da ascesso o da empiema): ▪ trasporto in contenitori privi di O2; utilizzare il flacone emocolturale per “anaerobi”
Meningite diagnosi di laboratorio fase ANALITICA (LCR) fase PRE-ANALITICA 1. Valutazione MACROSCOPICA • RACCOLTA e 2. Valutazione TRASPORTO di LCR MICROSCOPICA (e/o altri campioni) 3. Indagini CHIMICO- FISICHE
Fase analitica 1. esame macroscopico del LCR ASPETTO: Grado di torbidità: limpido (“acqua di roccia”), opalescente, torbido. Sulla base dell’aspetto del liquor, le meningiti sono classificate in: ▪ meningiti a liquor limpido (opalescente, ma mai purulento, smerigliato per pleiocitosi). Eziologia prevalentemente virale, ma anche batterica (tubercolare, Brucella, Salmonella, Leptospira, Listeria) o protozoaria (Toxoplasma, Trypanosoma). ▪ meningiti a liquor torbido (purulento, fuoriesce ad alta pressione). Indicativo di eziologia batterica, fungina (Candida, Mucor), protozoaria (Naegleria, Acanthamoeba). PRESENZA DI SANGUE O COAGULO: La presenza di globuli rossi nel LCR può essere conseguente a: ▪ emorragia intra-cerebrale/sub-aracnoidea (presenza uniforme dei globuli rossi in tutti i campioni sequenziali da 1 a 3); ▪ traumatismo da rachicentesi con contaminazione di sangue periferico (riduzione dei conteggi sequenziali) Presenza di coagulo “a ragnatela” (meningite tubercolare)
Fase analitica 1. esame macroscopico del LCR COLORE: ▪ incolore ▪ xantocromico: giallo-arancio (ricco di proteine, bilirubina) ▪ eritrocromico: contaminazione ematica (lesione subaracnoidea) LCR eritrocromico ASPETTO SURNATANTE (a seguito di centrifugazione): ▪ xantocromico, colorazione giallognola (emorragia subaracnoidea) ▪ trasparente e privo di colorazione (rachicentesi traumatica) LCR xantocromico
Fase analitica 2. esame microscopico del LCR CONTEGGIO CELLULARE, sul campione non centrifugato, preferibilmente sull’ultimo prelevato, utilizzando una camera di conteggio e previa colorazione con blu di metilene o May-Grunwald-Giemsa. I conteggi non devono essere eseguiti su campioni con coagulo: ▪ conta totale dei leucociti ▪ conta differenziale dei leucociti: polimorfonucleati (PMN) vs mononucleati (LINF), eseguita su conteggio totale > di 5x106 leucociti/litro. ▪ conta eritrociti eseguita su due campioni, in caso di sospetta emorragia ▪ Una pleiocitosi polinucleata indica una eziologia batterica, mentre una pleiocitosi mononucleata (linfocitosi) indica una eziologia virale.
Fase analitica 2. esame microscopico del LCR LCR, pleiocitosi neutrofila LCR, pleiocitosi linfocitaria LCR, pleiocitosi mista neutrofila/linfocitaria
Fase analitica 2. esame microscopico del LCR CONTEGGIO CELLULARE Una pleiocitosi polinucleata indica una eziologia batterica, mentre una pleiocitosi mononucleata (linfocitosi) indica una eziologia virale. Tuttavia, bisogna ricordare che: ▪ sia la meningite virale che tubercolare presentano, nelle fasi precoci dell’infezione, una predominanza liquorale neutrofila ▪ una meningite batterica può inizialmente presentarsi «normale» quando il campione viene prelevato in una fase precoce dell’infezione, in corso di terapia antibiotica oppure da paziente immunodeficiente o neutropenico ▪ la meningite ad eziologia fungina, tubercolare o brucellare è linfocitica ▪ i pazienti neutropenici non sono generalmente in grado di produrre una risposta di tipo neutrofila nel LCR (anergici) ▪ in pazienti con shock settico e complicanze sistemiche si hanno basse conte cellulari
Fase analitica 2. esame microscopico del LCR RICERCA MICROSCOPICA DIRETTA DI MICRORGANISMI eseguita sul pellet, ottenuto a seguito di centrifugazione, colorato mediante: ▪ Gram: ▪ specificità: elevata (97-98.5%) per N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae. Morfologia patognomonica: diplococchi Gram- (N. meningitidis), diplococchi Gram+ (S. pneumoniae), coccobacilli Gram- (H. influenzae). ▪ sensibilità: 60-80%, ma ridotta in presenza di terapia antibiotica (40-60%) e nel caso di L. monocytogenes (23-36%) per scarsa carica batterica.1 ▪ può essere l’unica evidenza laboratoristica per meningite: 4% di 875 pazienti in uno studio danese.2 ▪ importante in caso di meningite meningococcica (eseguita su materiale da scarificazione petecchie/vescicole). ▪ Ziehl-Nielsen e auramina-rodamina (micobatteri) ▪ blu di metilene (morfologia cellulare) ▪ inchiostro di china o nigrosina (capsula di C. neoformans) ▪ arancio di acridina (batteri e miceti): ▪ fluorocromo che si intercala nella struttura dell’acido nucleico ▪ alta sensibilità ma non differenzia Gram+ vs Gram- 1. Bohr, V., et al. 1983. 875 cases of bacterial meningitis: diagnostic procedures and the impact of preadmission antibiotic therapy. Part III of a three-part series. J. Infect. 7:193–202. 2. Brouwer, M.C., et al. 2006. Community-acquired Listeria monocytogenes meningitis in adults. Clin. Infect. Dis. 43:1233–1238.
Fase analitica 2. esame microscopico del LCR A B C D LCR, colorazione Gram. A) Streptococcus pneumoniae; B) Neisseria meningitidis; C) Haemophilus influenzae; D) Escherichia coli.
Fase analitica 2. esame microscopico del LCR A B C D LCR. A) Colorazione inchiostro India: capsula di Cryptococcus neoformans; B) Colorazione auramina-rodamina: Mycobacterium tuberculosis; C) Colorazione arancio di acridina: Staphylococcus aureus; D) Colorazione blue di metilene: Neisseria meningitidis.
Fase analitica 3. esame chimico-fisico del LCR ESAME CHIMICO-FISICO effettuato previa centrifugazione e rimozione del surnatante, poiché le cellule - lisandosi con il tempo – liberano il loro contenuto proteico in sospensione: ▪ [glucosio]: (ipoglicorrachia), (iperglicorrachia) ▪ Ipoglicorrachia (infezioni batteriche, fungine, tubercolari; L. monocytogenes soltanto nel 20% dei casi) ▪ [glucosio]liquor / [glucosio]siero ≤ 0.6 (infezioni batteriche) ▪ Normoglicorrachia (infezioni virali) ▪ [proteine]: (ipoprotidorrachia), (iperprotidorrachia) ▪ Forte iperprotidorrachia, proteina C-reattiva (infezioni batteriche) ▪ Moderata iperprotidorrachia (infezioni virali) ▪ Aumentata iperprotidorrachia (infezioni fungine, tubercolari) ▪ [LDH]liquor, LDH (infezioni batteriche); rapido, economico, accuratezza terapia-relata ▪ Esame del sedimento: previa colorazione con May-Grunwald-Giemsa, per lo studio delle caratteristiche morfologiche e strutturali. Le variazioni possono essere relate all’eziologia. Nel neonato le variazioni sono, generalmente, modeste od assenti.
LCR: parametri chimico-fisici e cellulari Eziologia Parametro Fungina, Tubercolare, (valore fisiologico in adulto) Batterica Virale Leptospira Pressione (seduto: 35-45; decubito > 300 mm 200 mm 300 mm laterale:15-20 cm H2O) cellule > 1.000 100-1.000 5-1.000 (0-5 / µL) %PMN > 80% 1-50% 1-50% (0) Glucosio < 35 ↓ 45-85 < 45 ↓ (45-85 mg/dL) Proteine > 100 < 100 > 100 (15-45 mg/dL) Lattato > 30 0 0 (mg/dL) Gram + - - Citologia - - + Aspetto lattescente/purulento limpido limpido/smerigliato (limpido, incolore, trasparente)
Meningite diagnosi di laboratorio fase ANALITICA 1. Ricerca antigeni 2. Isolamento colturale + antibiogramma 3. Emocoltura 4. Amplificazione genica* fase ANALITICA (LCR) fase PRE- ANALITICA 1. Valutazione MACROSCOPICA • RACCOLTA e 2. Valutazione TRASPORTO LCR MICROSCOPICA ed altri campioni 3. Indagini CHIMICO-FISICHE fase ANALITICA 1. Amplificazione genica* * anche su sangue, tampone faringeo, biopsia cutanea
Fase analitica: eziologia batterico-fungina 1. ricerca di antigeni ▪ I microrganismi che comunemente causano meningite presentano sulla loro superficie antigeni di natura polisaccaridica che possono essere rilevati in LCR mediante test di agglutinazione al lattice (latex test): – Streptococcus pneumoniae – Haemophilus Influenzae di tipo b – Neisseria meningitidis (gruppi A, B, C, Y/W135) – Esherichia coli (gruppo K1) – Streptococcus agalactiae (streptococco beta-emolitico di gruppo B) – Cryptococcus neoformans ▪ Costosi e di controversa affidabilità (sensibilità: 59-100%; fortemente compromessa da terapia antibiotica1), tali tests sono utilizzati SOLO in caso di: 1) conteggio cellulare anomalo (immunodeficienza con deficit GB); 2) LCR purulento ma negativo al Gram; 3) LCR ed emocolture negativi per oltre 48 ore (pregressa antibiotico-terapia). ▪ Per queste limitazioni, sebbene una positività al lattice possa indicare la presenza di un agente infettivo, la negatività non può escludere una infezione. ▪ Al contrario, la ricerca dell’antigene solubile di C. neoformans (LCR), S. pneumoniae (LCR od urine) mediante immunocromatografia è associata ad elevata sensibilità. 1. Brouwer MC, et al. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clin Microbiol Rev 2010;23:467–92.
Fase analitica: eziologia batterico-fungina 1. ricerca di antigeni: latex assay
Fase analitica: eziologia batterico-fungina 1. ricerca di antigeni: immunocromatografia Durante la migrazione del campione gli antigeni ricercati, se presenti nel campione, formeranno complessi antigene-anticorpo con gli anticorpi marcati con oro colloidale. Questi complessi verranno catturati dagli anticorpi di cattura sulla linea del test, formando una banda di colore viola generata dalle nanoparticelle ▪ sensibilità 95-100%1 d'oro. La presenza di una banda di controllo interno ▪ possibili false-positività per altri streptococchi2 viola nella parte superiore della membrana indica che il risultato è valido e che la procedura seguita è corretta. 1. Saha SK, et al. Rapid diagnosis of pneumococcal meningitis: implications for treatment and measuring disease burden. Pediatr Infect Dis J 2005;24:1093–8. 2. Alonso-Tarres C, et al. False-positive pneumococcal antigen test in meningitis diagnosis. Lancet 2001;358:1273–4.
Fase analitica: eziologia batterico-fungina 2. isolamento colturale ▪ Rappresenta il gold standard per la diagnosi di meningite batterica. ▪ Si effettua sul centrifugato di LCR (concentrare la carica batterica) per la ricerca di: – aerobi: N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae, stafilococchi (agar sangue, agar cioccolato) – anaerobi (in caso di meningiti post-neurochirurgiche o shunt cerebrali-related) – altri patogeni: miceti (C. neoformans), M. tuberculosis (solo terreni liquidi) ▪ Sensibilità: 67-85% 3,4 ; ▪ non ottimale per M. tuberculosis (25%–70%) che comunque richiede maggiori volumi di LCR (≥5 mL) ▪ riduzione della sensibilità (del 10-20%) 3,5,6 se il paziente è già in terapia antibiotica al momento della rachicentesi All’isolamento del microrganismo seguirà la valutazione della sua sensibilità agli antibiotici (antibiogramma) per eventualmente modificare la terapia (empirica) avviata in prima battuta. N. meningitidis su agar cioccolato 3. Bohr V, et al. 1983. 875 cases of bacterial meningitis: diagnostic procedures and the impact of preadmission antibiotic therapy. Part III of a three-part series. J. Infect. 7:193–202. 4. Bryan JP, et al. 1990. Etiology and mortality of bacterial meningitis in northeastern Brazil. Rev. Infect. Dis. 12:128–135. 5. Nigrovic LE, et al. 2008. Effect of antibiotic pretreatment on cerebrospinal fluid profiles of children with bacterial meningitis. Pediatrics 122:726–730. 6. Ragunathan L, et al. 2000. Clinical features, laboratory findings and management of meningococcal meningitis in England and Wales: report of a 1997 survey. J. Infect. 40:74–79.
Fase analitica: eziologia batterico-fungina 3. emocoltura Nella maggior parte dei casi i microrganismi dopo aver attraversato la barriera mucosale si immettono nel circolo ematico per poi penetrare la barriera emato-encefalica e raggiungere il SNC. Per questo, è necessario eseguire una emocoltura (su 3 sets) in parallelo alle indagini condotte su LCR. L’esito dell’indagine emocolturale ci consentirà di confermare la eziologia derivante dall’indagine liquorale. Nei casi di emocoltura negativa è raccomandata l’esecuzione di un tampone faringeo. Qualora non fosse possible prelevare il LCR (pericolo di incuneamento cerebrale), l’indagine emocolturale rappresenta l’unicà opportunità di poter isolare il microrganismo causa dell’infezione.
Fase analitica: eziologia batterico-fungina ricerca molecolare (amplificazione genica) Polymerase Chain Reaction (PCR) ▪ Su LCR, ma anche su sangue, tampone faringeo, biopsia cutanea per la ricerca diretta di batteri (N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae, L. monocytogenes, M. tuberculosis) e virus ▪ Rappresenta l’approccio diagnostico principale in caso di eziologia virale ▪ Particolarmente utile quando l’esame colturale risulta negativo (LCR torbido ma in corso di antibiotico- terapia). PCR assay. Amplificazione gene per ▪ Valore diagnostico incrementale vs Gram e colturale1,2 proteina b (419bp) di M. tuberculosis su gel agarosio 1.5%. ▪ False positività: pneumococchi commensali e non patogeni Lane 1: 100bp DNA marker Lane 2: CTRL + Lanes 3,4,5: CSF positivi Lane 5: CTRL - (Sharma et al, Neurol India 2010) 1. Corless CE, et al. Simultaneous detection of N.meningitidis, H.influenzae, and S.pneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using real-time PCR. J Clin Microbiol 2001;39:1553–8. 2. Tzanakaki G, et al. Simultaneous single-tube PCR assay for the detection of N. meningitidis, H. influenzae type b and S. pneumoniae. Clin Microbiol Infect 2005;11:386–90.
Fase analitica: eziologia batterico-fungina Sensibilità, costi e tempi di esecuzione Brouwer et al, Clin Microbiol Rev 2010 Test Tempo Costo (euro) Glucosio
Diagnosi di meningite ... in assenza di LCR ▪ Nei pazienti con controindicazione alla puntura lombare, la diagnosi microbiologica viene condotta su altri campioni: Urine: ricerca di antigeni batterici. Markers infiammatori sierici: ▪ indicano la eziologia dell’infezione (batterica vs virale):1 ▪ PCT (>0.5–2 ng/mL) e proteina C-reattiva sono suggestive, ma non esclusive, per una eziologia batterica2 Biopsia cutanea (meningite meningococcica): ▪ campione prelevato mediante biopsia, scraping od aspirazione ▪ colorazione Gram: sensibilità 0.5%-36%3,4 ▪ isolamento colturale La accuratezza dell’esame delle lesioni cutanee non è influenzata da una terapia antibiotica eventualmente in atto.5 Meningite meningococcica: rash petecchiale. 1. De Cauwer, H. G., et al. 2007. Differential diagnosis between viral and bacterial meningitis in children. Eur. J. Emerg. Med. 14:343–347. 2. Dubos, F., et al. 2008. Serum procalcitonin level and other biological markers to distinguish between bacterial and aseptic meningitis in children: a European multicenter case cohort study. Arch. Pediatr. Adolesc. Med. 162:1157–1163. 3. Levy, C., et al. 2008. Characteristics of meningococcal meningitis in children in France. Arch. Pediatr. 15(Suppl. 3):S105–S110. 4. Arend, S. M., et al. 2006. Prospective controlled study of the diagnostic value of skin biopsy in patients with presumed meningococcal disease. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 25:643–649. 5. van Deuren, M., et al. 1993. Rapid diagnosis of acute meningococcal infections by needle aspiration or biopsy of skin lesions. BMJ 306:1229–1232.
Meningiti fungine ▪ Rare e di difficile diagnosi ▪ Cryptococcus neoformans (causa più frequente), Coccidioides immitis (Messico, America meridionale) ▪ Maggiore prevalenza nell’ospite neutropenico (AIDS; immunosoppresso) a seguito di disseminazione ematica ▪ Quadro liquorale: pleiocitosi linfocitaria, aumento quoziente albumina ▪ Identificazione mediante colorazione della capsula (India ink): solo per C. neoformans ▪ Isolamento colturale ▪ E’ raccomandabile l’utilizzo di volumi maggiori di liquor (almeno 4 ml) per l’allestimento del vetrino e per la coltura ▪ Ricerca di antigeni + ricerca anticorpale nel LCR per monitorare l’efficacia della terapia: ▪ aumentati livelli di Abs specifici + ridotta presenza di antigeni = terapia efficace ▪ Ricerca di materiale genico: PCR, non ancora standardizzata
Round capsulated fungal organisms Lymphocytic infiltrate around LCR, inchiostro di china: C. neoformans C. neoformans su agar sangue: colonie di con evidente capsula piccole dimensioni con aspetto mucoide dovuto alla produzione di una abbondante capsula polisaccaridica
Meningite diagnosi di laboratorio fase ANALITICA 1. Ricerca antigeni 2. Isolamento colturale + antibiogramma 3. Emocoltura 4. Amplificazione genica* fase ANALITICA (LCR) fase PRE- ANALITICA 1. Valutazione MACROSCOPICA • RACCOLTA e 2. Valutazione TRASPORTO LCR MICROSCOPICA ed altri campioni 3. Indagini CHIMICO-FISICHE fase ANALITICA 1. Amplificazione genica* * anche su sangue, tampone faringeo, biopsia cutanea
Meningite virale Fase analitica Nelle meningoencefaliti virali la fase analitica prevede l’esecuzione di tests molecolari su LCR ed eventualmente test molecolari o sierologici su sangue e altre indagini su altre tipologie di campione per escludere false positività/negatività. Gli agenti eziologici da ricercare sono in relazione allo stato immunitario del paziente, alla clinica e alla stagionalità. Paziente immunocompetente. Ricerca del genoma di: Enterovirus (i più frequenti), HSV1/2, VZV e HHV-6 (se paziente < 3aa). ▪ In caso di sospetto per Enterovirus può essere utile la ricerca nel tampone faringeo e nelle feci. Possibili false-positività (non sempre presente un nesso causale con meningite; nei bambini la positività fecale può essere dovuta a ceppi vaccinici). ▪ In corso di encefalite da HSV (1-2), nei primi 1-3 giorni dalla comparsa dei sintomi neurologici si possono ottenere nel LCR risultati falsi negativi. Quindi, in caso di LCR negativo è indicato ripetere la rachicentesi dopo 3-7 giorni. ▪ In presenza di vescicole cutanee o mucose effettuare ricerche colturali o molecolari per HSV e VZV su tampone cutaneo/mucoso. Un risultato positivo non è sempre eziologico.
Meningite virale Fase analitica Paziente immunocompetente. ▪ La sieroconversione da HIV è accompagnata nel 17% dei casi da sintomi neurologici. E’, quindi, consigliabile effettuare su sangue il test combinato. ▪ La diagnosi di encefalite acuta da EBV può essere supportata dalle indagini sierologiche su sangue (EBV VCA IgM positive e EBV EBNA negative). ▪ In presenza di epidemia o clinica suggestiva per parotite, morbillo e rosolia effettuare su sangue le ricerche anticorpali alle quali aggiungere, solo in casi particolari, le ricerche di biologia molecolare su LCR. Paziente immunocompromesso. ▪ In aggiunta alle indagini descritte per gli immunocompetenti, effettuare la ricerca nel LCR del genoma di CMV, EBV, JC virus e, anche se il paziente è adulto, HHV-6. ▪ Una eventuale positività di EBV su liquor non denota necessariamente una infezione del SNC poiché potrebbe essere in relazione alla presenza nel LCR di cellule mononucleate che ospitano il virus latente. In corso di encefalite acuta da EBV o di linfoma primitivo del SNC il carico virale nel LCR è elevato.
Meningite virale Rhabdovirus: diagnosi di laboratorio • Campioni clinici: strisci corneali, biopsie cerebrali, biopsie cutanee • Ricerca di antigeni virali in IF o tramite PCR • Rilievo microscopico di cellule neuronali cerebrali contenenti i corpi del Negri (inclusioni intracitoplasmatiche) Cervello rabbico: colorazione IF (in alto); Cervello rabbico, colorazione campione negativo (in basso) ematossilina-eosina: indicati, i corpi del Negri (Rhabdovirus)
Meningite da protozoi • Le amebe (Naegleria, Acantameba) possono moltiplicarsi in acque stagnanti nei Paesi tropicali (scarichi fognari). • Se inalate, raggiungono le meningi attraverso il nervo olfattivo e la lamina cribrosa etmoidea. • Diagnosi: osservazione microscopica per evidenziare la caratteristica motilità ameboide. Meningite amebica: sedimento liquorale con trofozoiti di Naegleria fowleri
Esame LCR refertazione ▪ ASPETTO: aspetto del LCR (limpido, purulento) ed eventuale presenza di coaguli ▪ MICROSCOPIA: ▪ Conteggio cellulare • numero di GR (x106 per litro) • numero di PMN e linfociti (x 106/L; oppure % conta totale GB, riferito a x 106) ▪ Osservazione microscopica previa colorazione • Gram: descrizione del(dei) microrganismo(i) osservato(i) • descrizione dei funghi dotati o meno di capsula • osservazione microscopica per Mycobacterium spp. e parassiti ▪ PCR (se disponibile): «DNA/RNA non rilevato» oppure «DNA/RNA rilevato» ▪ COLTURALE • descrizione microrganismi isolati oppure indicazione di assenza di crescita ▪ ANTIBIOGRAMMA: Refertare le sensibilità ai vari farmaci saggiati secondo le linee guida EUCAST per ogni associazione farmaco/microrganismo. ▪ TEMPI DI REFERTAZIONE: comunicazione telefonica/telematica entro 15-30 min per osservazione microscopica, 16-72 h (se negativo o positivo, rispettivamente) per esame colturale.
Diagnosi microbiologica di meningite Esami microbiologici effettuabili Sospetto clinico Esame effetuabile Campione biologico Note Meningite batterica Esame diretto e colturale per Liquor (almeno 1 ml) Inviare anche emocoltura (1 batteri Trasportare immediatamente flacone x aerobi + 1 flacone x Mantenimento: RT < 2 h anaerobi) Ricerca antigeni batterici mediante Liquor (0.5-1 ml) Lo stesso test può essere test di agglutinazione Trasportare immediatamente eseguito anche su sangue od Mantenimento: 4°C < 12 h urine Ricerca antigene S. pneumoniae Liquor (0.5 ml) Lo stesso test è eseguibile anche (immunocromatografia) Mantenimento: RT
Diagnosi microbiologica di meningite Esami microbiologici effettuabili Sospetto clinico Esame effettuabile Campione biologico Note Meningite virale Ricerca DNA virus erpetici (CMV, Liquor (almeno 1 ml) 1 ml di liquor è sufficiente per la ENV, VZV, HSV1, HSV2) Mantenimento:
Meningite: percorso diagnostico (linee-guida AMCLI, 2015) MRI: Magnetic Resonance Imaging MTC: Mycobacterium tuberculosis complex
Puoi anche leggere