MICROBIOLOGIA AMBIENTALE - in ACQUACOLTURA Dott.ssa Piera Anna Martino DIMEVET - Università degli Studi di Milano - Fabio Luzi

MICROBIOLOGIA AMBIENTALE
    in ACQUACOLTURA

     Dott.ssa Piera Anna Martino
DIMEVET – Università degli Studi di Milano

                    Corso di Perfezionamento
      «Benessere dell’animale da laboratorio ed Animal Care
            (Roditori-Lagomorfi-Specie Acquatiche)»
                           6 aprile 2018

QUALITA’ DELL’ACQUA

   La qualità dell’acqua rappresenta l’elemento più
   importante per mantenere in salute gli animali

•I pesci sono in grado di adattarsi a cambiamenti nella qualità
 dell’acqua senza eccessivo stress
•NO cambiamenti rapidi

•Principali parametri dell’acqua, i cui cambiamenti possono
 causare fluttuazioni ambientali:
    – Temperatura, ossigeno, composti dell’N, pH, salinità,
      durezza

L’ACQUARIO: parametri

TEMPERATURA
  Adattamento della temperatura corporea a quella
   dell’ambiente circostante
  Temperatura ottimale per avere la massima
   efficienza
    Temperature molto alte o basse sono pericolose
  La temperatura deve essere più costante possibile,
   con variazioni minime e molto lente
  Uso di termoriscaldatori

L’ACQUARIO: parametri

FILTRAZIONE
  Acquario sistema biologico isolato
  Necessità di un sistema di filtrazione per depurare
   l’habitat ed evitare l’accumulo di sostanze di rifiuto
  Impianti sempre in funzione e con adeguata
   manutenzione
  I filtri devono essere puliti e cambiati o rigenerati

http://www.scanbur.com/housing-ventilation/aquatic-line/zebrafish-
systems/zebtec/

L’ACQUARIO: qualità dell’acqua

DUREZZA
 Somma totale delle concentrazioni di calcio e magnesio
 Gradi di durezza con definizione non universale
 Se la concentrazione di Ca2+ è bassa si ha:
     Tossicità dell’ammoniaca
     Tossicità dei metalli
     Mortalità e minore resistenza degli avannotti alle infezioni

SALINITA’
 Concentrazione di NaCl
     Acque dolci: 0.01 -1 ppt

FATTORI AMBIENTALI

            COMPOSTI DELL’AZOTO

AMMONIACA
 Valore “safe” di ammoniaca non ionizzata: 0.02 mg/L
 Aumenta ed è molto tossica in caso di
     Sovraffollamento
     Sovra-alimentazione

FATTORI AMBIENTALI

NITRITI [< 0.1 mg/L]**
 Sono il prodotto intermedio di due processi mediati
  da batteri
    1. Nitrificazione (aerobi Nitrosomonas)
    2. Denitrificazione (Nitrobacter)

NITRATI [< 1g/L]
 Meno tossici

**Aumentano in caso di sovraffollamento, dieta
iperproteica, aumento di Nitrosomonas

L’ACQUARIO: qualità dell’acqua

OSSIGENO
 6-15 mg/L
 Forte stress immunitario se la concentrazione di O2
  diminuisce; morte per ipossia
 “Malattia delle bolle di gas” se la concentrazione di O2
  aumenta

Zebrafish

Zebrafish
 In natura vivono in acqua dolce, poco mosse, con pH ≈ 8
 Vivono in piccoli gruppi di 5-20 individui; non hanno cure
  parentali; durata della vita di circa 5 anni
 Tollerano bene le diverse condizioni ambientali, poiché in
  natura vivono in habitat che possono variare in modo
  significativo (aree monsoniche)
 Se il range non è ottimale però
   Necessità di più energia per l’omeostasi, per la crescita, per la
    produzione di gameti, per la sopravvivenza e per il
    funzionamento del Sistema Immunitario                PROBLEMI

 Temperatura
   Poichilotermi euritermi con ampio range di tolleranza
    termica da 6.7 a 41.7 °C (risposta naturale)
   T = 28,5 °C (24-30 °C)
   Temperature più elevate possono compromettere il
    differenziamento sessuale o la funzionalità cellulare

 pH
   7-8 come per i pesci di acqua dolce

 Durezza
   Si tratta di «hard water species» che preferiscono valori >
    100 mg/L di CaCO3

 Salinità
   Tollerano diverse concentrazioni saline
   Variabilità tra facilities, ma il range ottimale da
    mantenere stabile è 0,25 -0,75 ppt

 Ossigeno disciolto
   I pesci tropicali come Zebrafish consumano più O2 per
    unità di peso rispetto ai pesci più grandi
   Livello da mantenere: alla saturazione o poco più sotto
    (≈ 7,8 mg/L a 28 °C)

Tossico > 0.02 ppm

   Tossico > 1 ppm

LO STATO SANITARIO

 Idealmente i pesci “da esperimento” dovrebbero essere
  free da agenti infettivi e da qualsiasi tipo di stress
 Infezioni sub-cliniche sono abbastanza frequenti ma con
  effetti sui risultati sperimentali spesso ignoti
 Elevata influenza dei fattori ambientali

                          PESCE
             PATOGENO             AMBIENTE

                        MALATTIA

Cosa cerchiamo nell’acqua?

PATOLOGIE BATTERICHE

 Un management inadeguato dei parametri chimico-fisici
  ed igienico-sanitari può portare allo sviluppo di
  infezioni a varia eziologia

 I batteri possono essere
    Patogeni primari
    Opportunisti

 I batteri possono causare lesioni cutanee
    Direttamente
    Indirettamente dopo invasione sistemica

 I batteri si possono riscontrare nell’acqua

LE PATOLOGIE BATTERICHE
      in ZEBRAFISH

SETTICEMIA EMORRAGICA BATTERICA

 È anche conosciuta come “setticemia da Aeromonas
  mobile”, “bocca rossa”, “peste rossa”, “ulcer disease”
 È causata da Aeromonas hydrophila e colpisce tutte le
  specie di pesci
   Batterio Gram-negativo, mobile, con un singolo
    flagello polare, in grado di crescere anche a 37 °C
   Alcuni ceppi possono produrre pigmenti marroni
   La diagnosi si basa sulla coltura e l’identificazione del
    microrganismo

Aeromonas hydrophila

SETTICEMIA EMORRAGICA BATTERICA

 A. hydrophila è stato associato ad un’ampia varietà di
  condizioni cliniche e può essere isolato anche in presenza
  di altri patogeni
 Patogeno primario o un semplice “invasore” secondario?
   Osservazione di risposte chemiotassiche verso il muco dei
    pesci in alcuni ceppi
   Produzione di prodotti extracellulari con attività proteolitica
    ed emolitica (correlata alla virulenza); enterotossine
   Casi individuali o anche epidemie

SETTICEMIA EMORRAGICA BATTERICA

 La setticemia emorragica batterica può essere:
   Iperacuta con assenza o presenza di sintomi
   Acuta con perdita di squame, emorragie focali anche a
    livello della bocca
    Comparsa di ulcere cutanee sul corpo; anemia e danno
    renale ed epatico
   Cronica (più rara)

BACTERIAL TAIL ROT

 È anche conosciuta come “bacterial fin rot”,
  pseudomoniasi, setticemia emorragica
 È causata da Pseudomonas fluorescens ed ha diffusione
  ubiquitaria
   Batterio Gram-negativo, in grado di crescere tra 22-28 °C,
    con colonie pigmentate giallo brillante
   La diagnosi si basa sulla coltura e l’identificazione del
    microrganismo

BACTERIAL TAIL ROT

•Cause predisponenti:
   •Stress
   •Bassa temperatura dell’acqua che rappresenta il
      serbatoio primario
•P. fluorescens può essere sia patogeno primario sia
 secondario
•Morbilità e mortalità discrete

               Pseudomonas fluorescens

BACTERIAL TAIL ROT

 Erosione della pinna e/o della coda segno cardinale
 Comparsa di setticemia
   Morte per infezione peracuta
   Sopravvivenza anche in presenza di lesioni estese
 Presenza di ulcere cutanee, petecchie ed eritema
 Assenza di emorragie attorno alle ulcere ≠ infezione da
  Aeromonas

BACTERIAL TAIL ROT

 Erosione della pinna e/o della coda segno cardinale
 Comparsa di setticemia
   Morte per infezione peracuta
   Sopravvivenza anche in presenza di lesioni estese
 Presenza di ulcere cutanee, petecchie ed eritema
 Assenza di emorragie attorno alle ulcere ≠ infezione da
  Aeromonas

EDWARDSIELLOSI

 Edwardsiella tarda
   Gram-negativo, appartenente alle Enterobacteriaceae, è
    un patogeno intracellulare che cresce in un range tra
    30-37 °C
   È causa di setticemia generalizzata associata a scarsa
    qualità dell’acqua e a stress
   Trasmissione attraverso l’acqua contaminata a livello
    di cute, branchie o per via orale
     Zebrafish usati anche come modelli sperimentali di questa
      patologia

EDWARDSIELLOSI

 I segni clinici possono includere:
   Piccole lesioni cutanee che possono evolvere in ascessi
    necrotici
   Addome disteso e ano gonfio per l’accumulo di liquido
    ascitico
   Depigmentazione
   Rene di dimensioni aumentate
   Ascessi in organi interni

BACTERIAL GILL DISEASE (BGD)

 È anche chiamata “environmental gill disease” poiché è
  legata al sovraffollamento e a scarsa qualità dell’acqua
   Elevata concentrazione di residui organici
   Elevata concentrazione di ammoniaca nell’acqua
   Stress da trasporto tipico negli Zebrafish
 Vari agenti causali appartenenti al gruppo dei gliding
  bacteria
   Flavobacterium columnare, F. branchiophilum

Citophaga

Flexibacter

              Flavobacterium

BACTERIAL GILL DISEASE

 Eccessiva produzione di
  muco ed iperplasia
  dell’epitelio delle branchie
 Cute infetta
   perdita dello strato
    epidermico esterno ed
    esposizione del derma
 Infezioni della pinna e
  coda (fin and tail rot)

Fin and Tail rot

AEROCISTITE BATTERICA o INFEZIONI
  BATTERICHE DELLA VESCICA NATATORIA

 Infezione cronica grave sostenuta da più batteri:
   Aeromonas hydrophila, Aeromonas spp., Pseudomonas
    fluorescens, Pseudomonas spp., Flexibacter, Flavobacterium
   Cause sottostanti ignote
      Colonizzazione da parte di batteri intestinali?
      Microsporidiosi?
      Immunocompromissione?
      Stress?
      Scarsa qualità dell’acqua?

Presenza di eritema alla base della pinna
         (non patognomonica)

Batteri filamentosi colorati con Gram
e Ziehl-Neelsen

                   Colorazione di Gram
                  della vescica natatoria

STREPTOCOCCOSI

 Le infezioni da Streptococcus spp. sono ubiquitarie e
  possono causare elevate mortalità (>50%) in 3-7 gg
   Anche cronicizzazione con mortalità entro parecchi giorni in
    pochi animali
 Streptococcus iniae
 Stress importante fattore predisponente
 Altri stressori:
     Elevate temperature dell’acqua
     Sovraffollamento
     Manipolazione
     Scarsa qualità dell’acqua
       Elevata concentrazione di ammoniaca
 Zebrafish usati anche come modelli sperimentali di questa
  patologia

STREPTOCOCCOSI

 I pesci colpiti possono presentare diversi segni clinici che
  progrediscono rapidamente, oltre a mortalità:
   Emorragie nell’occhio o attorno, a livello branchiale o alla
    base delle pinne
   Esoftalmia (“pop-eye”)
   Alterazioni nel nuoto
   Ulcerazioni

 Identificazione:
   mediante colorazione di Gram di impronte con
    l’osservazione di tipiche catenelle Gram-positive
   coltura e identificazione di streptococchi

Forte iperemia alla base
             delle pinne pettorali

Tipiche catenelle di streptococchi
da liquido peritoneale dopo colorazione
di Gram

MICOBATTERIOSI

 Infezioni croniche sistemiche sostenute da
  Mycobacterium spp.
   M. marinum, M. abscessus, M. chelonae,
    M. fortuitum, M. peregrinum, M. haemophilum
 Forme croniche con bassi livelli di mortalità ma
  anche infezioni acute con gravi epizoozie
   perché queste diverse manifestazioni?
      elevata virulenza dei ceppi
      immunodepressione

                                             M. chelonae

Struttura della parete dei micobatteri

Lo strato degli acidi micolici (cere) rappresenta il 60% del peso secco

M. marinum

             M. chelonae

MICOBATTERIOSI

 I cambiamenti clinici e macroscopici sono variabili ma
  il segno tipico è la comparsa di noduli bianchi multipli
  = granulomi negli organi viscerali
 Negli Zebrafish si ha anche un calo delle performances
  riproduttive accompagnato da edema generalizzato
  con addome rigonfio e ulcere cutanee

Macrofagi
con melanina

      Granulomi multipli
                             Micobatteri in macrofagi.
        a livello renale
                            Colorazione di Ziehl-Neelsen
     (macchie biancastre)

MICOBATTERIOSI

 DIAGNOSI
   Osservazione di macrofagi “ripieni” di batteri
    colorabili con la colorazione per alcool-acido
    resistenti (Ziehl-Neelsen)
   Difficile crescita in coltura
   PCR utile per lo screening di infezioni
    latenti/subcliniche

Infezione diffusa in Zebrafish. Massiccia
 proliferazione di fagociti nei visceri con
distribuzione diffusa di batteri (frecce).
               P = pancreas
       Colorazione di Ziehl-Neelsen

PROFILASSI E TERAPIA

Attenzione ad un corretto management
 Mantenimento di una buona qualità dell’acqua, con
  ricambi d’acqua al 5-10 %/die;
 Immediata rimozione dei pesci morti;
 Manipolazione prima dei pesci sani rispetto ai malati;
 Uso di cibo pathogen-free quando possibile;
 Accurata disinfezione di tutta la strumentazione e dei
  devices utilizzati ogni volta;
 Pulizia dell’ambiente;
 Quarantena in apposite vasche per almeno 3 settimane;
 Accesso limitato ai soli autorizzati nelle aree «pulite»

PROFILASSI E TERAPIA

• Trattamento antibiotico
  • Uso appropriato, se possibile, di diversi antibiotici:
      • Ossitetraciclina
      • Eritromicina
      • Fluorchinoloni
  • Terapie antibiotiche con dosaggi adeguati e giusta
    tempistica
  • Attenzione ad alcuni parametri dell’acqua: pH, durezza,
    temperatura
  • Attenzione ai batteri del ciclo dell’azoto

PROFILASSI E TERAPIA

• Trattamento con disinfettanti
  • Verde malachite
      • (cancerogeno potenziale e teratogeno/mutageno; no
        in USA)
  • Formaldeide 37% (fungicida registrato negli USA)
  • Perossido di idrogeno (con minimo impatto ambientale)
  • Cloruro di sodio (NaCl)
      • Acqua salata: 29 g/L
      • Acqua dolce: 15 g/L

RISCHIO ZOONOSICO

   Il rischio zoonosico legato a Teleostei infetti
   è piuttosto limitato anche se è indispensabile,
durante la manipolazione, indossare guanti protettivi

EDWARDSIELLOSI
 Edwardsiella tarda
 È causa di gravi malattie enteriche (gastroenteriti) ma
  anche di meningite, ascessi epatici, infezioni di ferite

RISCHIO ZOONOSICO

STREPTOCOCCOSI
  Streptococcus iniae
  Primo caso nel 1991 in Texas; secondo caso nel 1994 in
   Canada
  Comparsa di cellulite alle mani con febbre
     Rischio minimo nelle persone sane
     Rischio elevato in immunocompromessi
  Attenzione durante la manipolazione dei pesci

RISCHIO ZOONOSICO

MICOBATTERIOSI
   In genere si tratta di infezioni che non mettono a
    rischio la vita se non in soggetti immunocompromessi
   Attenzione durante la manipolazione dei pesci
      Infezione localizzata alle estremità dove la temperatura
       è più bassa
   Mycobacterium marinum

                                        swimming pool granuloma

GRAZIE PER L’ATTENZIONE