Mercodia C-peptide ELISA - Instruzioni per l'uso
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Mercodia
C-peptide ELISA
Instruzioni per l’uso
10-1136-01
Reagenti per 96 rilevazioni
Per l’uso diagnostico in vitro
A questa versione sono state apportate
modifiche significative
Pagina 6 La raccolta e il trattamento del modello
Il siero e Plasma
Prodotto da
Mercodia AB
Sylveniusgatan 8A
SE-754 50 Uppsala
SveziaSpiegazione dei simboli usati sulle etichette
Reagenti per 96 rilevazioni
∑ = 96
Data di scadenza
Conservare tra i 2–8°C
Lotto n.
Per l’uso diagnostico in vitro
© Mercodia 2010-2020Uso proposto
Mercodia C-peptide ELISA fornisce un metodo per la determinazione quantitativa
della C-peptide umana nel siero, plasma ed urine.
Relazione e spiegazione del test
La valutazione quantitativa e qualitativa della funzione della cellula ß pancreatica,
non è solo in uso negli studi pre e post diagnostici della storia naturale del diabete
melito, ma è anche rilevante nella pratica clinica come una guida per la corretta
scelta del trattamento.
I livelli periferici dell’insulina non possono essere usati per valutare la funzione
della cellula ß a causa di un condotto largo e variabile dalla circolazione portale
verso il fegato, e perché i dosaggi dell’insulina non possono distinguere tra
endogena e insulina esogena.
All’interno delle cellule ß pancreatiche, la proinsulina si scinde in una molecola
di C-peptide e una molecola d’insulina. La C-peptide è ulteriormente compresa
nella circolazione in una concentrazione equimolare a quelle dell’insulina. In
antitesi all’insulina, la C-peptide è solo minimamente estratta dal fegato. Le
concentrazioni periferiche di C peptide riflettono perciò la secrezione di cellule ß
più precisamente dell’insulina. L’escrezione urinaria di C-peptide è correlata con
i livelli integrati di plasma di C-peptide ma l’estrazione è altamente variabile tra
e all’interno individuali è quindi una misurazione imprecisa d ella funzione della
cellula ß.
Principio di procedura
Mercodia C-peptide ELISA, è una fase concreta dell’immunoanalisi Enzyme
due-sito. E’ basata sulla tecnica diretta sandwich nella quale due anticorpi
monoclonali sono diretti contro determinanti antigenici separati sulla molecola
C-peptide.
Durante l’incubazione la C-peptide nella reazione del campione con anticorpi
anti C-peptide diretto microtitrazione nei pozzetti.
Dopo il lavaggio, gli anticorpi perossidasi coniugata sono aggiunti e dopo la
seconda incubazione e un semplice lavaggio che rimuove indirettamente gli
anticorpi degli enzimi marcati, il diretto Conjugate è scoperto dalla reazione con 3,
3’,5,5’ tetrametibenzidine (TMB). La reazione è fermata aggiungendo acido per dare
una posizione estrema clorimetrica che è letta spettrometricamente.
3Preacauzioni e avvisi
• Per l’uso diagnostico in vitro.
• Tutti i pazienti presi come campione potrebbero essere trattati come capaci
di trasmettere infezioni.
• Ciascun pozzetto può essere usato una sola volta.
• La Stop Solution contieneMateriali richiesti ma non inclusi
• Pipette con volumi adeguati (riutilizza le pipette in dotazione per l’aggiunta della
soluzione enzima coniugato 1X , Assay Buffer, Substrate TMB e Stop Solution)
• Provette, becher e cilindri per la preparazione di reagenti
• Acqua ridistillata
• Agitatore magnetico
• Miscelatore di vortice
• Lettore micro piastra (450 nm filtro)
• Piastra dello shaker (700-900 giri/minuto, movimiento orbital)
• Micro piastra piano di lavaggio con la funzione traboccare-lavare (consigliato
ma non obbligatorio)
Reagenti
Ogni kit Mercodia C-peptide ELISA specific (10-1136-01) contiene reagenti per 96
prove, sufficienti per 42 campioni e una calibratura curva in duplicato. Per diverse
serie di analisi, usare reagenti provenienti da scatole portanti identici numeri di
lotto. La data di scadenza del kit completo è stabilita sull´etichetta all´esterno. Si
raccomanda di conservare ad una temperatura di 2–8°C.
Coated Plate 1 piastra 96 pozzetti Pronti per l’uso
Topo monoclonale anti C-peptide 8 strips de pozzetti
Per le strisce di microtitolazione non utilizzati, sigillare nuovamente la confezione con
nastro adesivo e conservare a 2–8°C per 2 mesi.
Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 fiale 1000 µL Liofilizzato
Giallo colore codificato Aggiungere 1000 µL
Concentrazione ha affermato sull’etichetta della fiala. acqua ridistilata
Conservare dopo la ricostituzione: 2-8 °C per 1 settimana. per fiala.
Per la conservazione di Calibrator ricostituiti per un periodo superiore a una settimana,
suddividerli in aliquote e conservarli a -20°C. A -20°C i Calibrator aliquotati si
mantengono stabili per 6 settimane.
Calibrator 0 1 fiala 5 mL Pronti per l’uso
Giallo colore codificato
Assay Buffer 1 fiala 6 mL Pronti per l’uso
Rosso colore codificato
Enzyme Conjugate 11X 1 fiala 1.2 mL Per la preparazione
Peroxidasi Conjugate topo monoclonale anti C-peptide vedi sotto
Enzyme Conjugate Buffer 1 fiala 12 mL Pronti per l’uso
Blu colore codificato
Wash Buffer 21X 1 bottiglia 50 mL Diluir con 1000 mL
Conservazione dopo la diluizione: d’aqua ridistillata
2-8°C per 2 mesi per fare diluenti la
soluzione de wash
buffer 1X.
Substrate TMB 1 bottiglia 22 mL Pronti per l’uso
Solución incolore
Nota! Sensibile alla luce!
Stop Solution 1 fiala 7 mL Pronti per l’uso
0.5 M H2SO4
5Preparazione del soluzione enzyme conjugate 1X
Preparare la quantitá necessaria del enzyme conjugate 1X con la diluizione
dell’Enzyme Conjugate 11X, (1+10) nel Enzyme Conjugate Buffer in base alla tabella
sottostante. Quando si prepara la soluzione enzyme conjugate 1X per tutta la
piastra, versare tutto il tampone Enzyme Conjugate Buffer nella fiala dell’Enzyme
Conjugate 11X. Mescolare lievemente.
Enzyme Enzyme
Numero de strisce Conjugate 11X Conjugate Buffer
12 strisce 1 fiala 1 fiala
8 strisce 700 μL 7 mL
4 strisce 350 μL 3.5 mL
Conservazione dopo la diluzione: 2-8°C per 1 settimana.
La raccolta e il trattamento del modello
Il siero
Il prelievo in vena di sangue, permette di coagulare, e separare il siero con
la centrifugazione. Prima di effettuare l’analisi, i campioni di siero devono
essere conservati a 2-8°C per il più breve tempo possibile. Per periodi più
lunghi, conservare i campioni a -80°C. Evitare di ripetere il congelamento e lo
scongelamento.
Plasma
Prelevare il sangue direttamente in vena in provette contenenti eparina o EDTA
come anticoagulante, e separare la frazione del plasma con la centrifugazione.
Prima di effettuare l’analisi, i campioni di plasma devono essere conservati
a 2-8°C per il più breve tempo possibile. Per periodi più lunghi, conservare i
campioni a -80°C. Evitare di ripetere il congelamento e lo scongelamento.
L’ urina
Raccogliere l ’urina di 24 ore (senza conservativo). Tenere il campione a 2–8°C tra
le raccolte. Registra la quantità totale del campione e ritenere un frazionato ben
miscelato per le analisi. Conservare i campioni a 2–8°C per un massimo di 24 ore
prima dell’analisi. Per periodi più lunghi di conservazione, tenere i campioni di
urina congelati a –70°C fino ad analisi effettuata.
Devono essere evitati ripetuti congelamenti e scongelamenti. Frammenti
cellulari dovrebbero essere rimossi prima dell’analisi, sia tramite filtrazione o
centrifugazione.
Preparazione dei campioni
I campioni urinari di valore superiore al Calibrator 5 devono essere diluiti al 1/10
nel Calibrator 0. In generale, non cè bisogno dei diluire i campioni de serum e
plasma. Tuttavia, si il valore è superiore al Calibrator 5, allora i campioni devono
essere diluiti nel il Calibrator 0.
6Procedura del test
Tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente prima
dell’uso. Prepare una calibratura curva per ciascuna di analisi. Il prodotto è stato
ottimizzato e validato senza utilizzare la pellicola sigillante.
1. Preparar di soluzione enzyme conjugate 1X y di soluzione wash buffer 1X.
2. Preparare sufficienti pozzetti nelle micropiastre a comporre Calibrators,
controlli e campioni in duplice copia.
3. Pipette 25 μL per ogni Calibrators, controlli e campioni in appropriati
pozzetti.
4. Aggiungere 50 μL al Assay Buffer per ogni pozzetto.
5. Mettere in incubatrice in una piastra shaker (700-900 rpm) per 1 ora a
temperatura ambiente (18–25°C).
6. Lavare 6 volte con 700 µL di soluzione wash buffer 1X per pozzetto usando
un lavatore automatico per piastre con la funzione traboccare-lavare. Dopo
il lavaggio finale, capovolgere la piastra e picchiettarla con decisione contro
della carta assorbente. Nella procedura di lavaggio non utilizzare la funzione
immersione.
O manualmente:
Eliminare il volume di reazione capovolgendo la micropiastra su un lavabo.
Aggiungere 350 µL di soluzione di lavaggio ad ogni pozzetto. Eliminare
la soluzione di lavaggio, sbattere con forza diverse volte contro carta
assorbente per rimuovere il liquido in eccesso. Ripetere 5 volte.
Evitare prolungate pause di immersione durante la procedura di lavaggio.
7. Aggiungere 100 μL di soluzione enzyme conjugate 1X per ogni pozzetto.
8. Mettere in incubatrice in una piastra shaker (700-900 rpm)per 1 ora a
temperatura ambiente (18–25°C).
9. Lavare come descritto in 6.
10. Aggiungere 200 μL Substrate TMB.
11. Mettere in incubatrice per 15 minuti in panchina a temperatura ambiente
(18–25°C).
12. Aggiungere 50 μL di Stop Solution ad ogni pozzetto.
Mettere la piastra in uno shaker per approssimativamente per 5 secondi per
garantire la miscelazione.
13. Leggere l’assorbività a 450 mn e calcolare i risultati.
Leggere entro 30 minuti.
Nota! Fare particolare attenzione a non contaminare il substrato TMB con la
soluzione dell’enzima coniugato.
7Controllo di qualita’ interno
I controlli commerciali tale come il Mercodia Diabetes Antigen Control (codifica
No. 10-1134-01/10-1164-01) e/o il siero interno proveniente da diversi donatori con
basse, intermedie e alte concentrazioni di C-peptide dovrebbero essere analizzate
periodicamente come se fossero esterne, e i risultati tracciati di giorno in giorno.
E’ buona norma di un laboratorio registrare i seguenti dati per ciascuna analisi: un
certo numero di kit, una ricostituzione dei dati e dei componenti del kit, i valori di
OD per il modulo, Calibrature e controlli.
I laboratori dovrebbero seguire le norme governative o i requisiti di
accreditamento per la frequenza dei controlli di qualità.
Il calcolo dei risultati
La riduzione dei dati computerizzati dell´assorbenza per le Calibrators, eccetto
il Calibrator 0, verso la concentrazione usando un regressione cubica flessibile
potrebbe essere effettuata per ottenere la concentrazione di C-peptide.
Esempio di risultati
Conc. princ.
Pozzetti Identità A450 nm pmol/L
1A–B Calibrator 0 0.072/0.070
1C–D Calibrator 1* 0.146/0.149
1E–F Calibrator 2* 0.340/0.339
1G–H Calibrator 3* 1.128/1.113
2A–B Calibrator 4* 1.878/1.939
2C–D Calibrator 5* 2.977/2.951
2E–F Campioni 1 0.311/0.321 316
2G–H Campioni 2 0.991/0.959 1065
3A–B Campioni 3 1.737/1.766 2172
*Concentrazione ha affermato sull’ etichetta della fiala.
8Esempio di una calibratura curva
Una calibratura rappresentativa è mostrata qui. Non usare questa curva per
determinare i risultati attuali delle analisi.
10
A450 nm
1
0.1
10 100 1000 10000
C-peptide (pmol/L)
Limitazioni della procedura
Come tutti i test diagnostici, una diagnosi clinica definitiva non dovrebbe essere
basata sui risultati di un singolo test, ma dovrebbe essere fatto medico dopo
averne valutate le conclusioni cliniche.
Grossolanamente campioni lipemic, itterico o hemolysed non interferiscono
nell’analisi.
Valori previsti
E’ buona norma e pratica di ogni laboratorio stabilire una serie del tutto sua di
presunti valori. I seguenti risultati potrebbero servire come guida fino a che il
laboratorio abbia raccolto dati sufficienti del tutto suoi.
I livelli di digiuno per 136 esaminati, individui apparentemente sani, hanno reso
un media di 742 pmol/L (2.2 μg/L), una mediana di 628 pmol/L (1.9 μg/L) e una
serie corrispondente al centrale 95% delle osservazioni dei 343–1803 pmol/L
(1.0–5.4 μg/L).
9Caratteristiche e esecuzione
Il limite della scoperta
Il limite di rivelabilità è definito come la Capacità di Rivelazione in base alla
ISO11843-Parte 1. La Capacità di Rivelazione deve essere considerata parte di un
metodo di verifica, piuttosto che la concentrazione minima misurabile. Il limite
di rilevabilità è 25 pmol/L come determinato dalla metodologia descritta nella
ISO11843- Parte 4. La concentrazione dei campioni con assorbanza inferiore al
Calibrator 1 non devono essere calcolati, maespresse come minori o uguali (≤)
rispetto alla concentrazione indicata sulla fiala per il Calibrator 1.
Riacquisto
Il siero:
Il recupero sull’aggiunta è 96%-108% (media 102%).
Il recupero alla diluizione è 97%-107% (media 102%).
Hook effect
I campioni con una concentrazione sopra i 1 750 000 pmol/L può essere
analizzata senza dare falsamente bassi risultati.
Precisione
Ogni campione è stato analizzato su 4 riprodotti in 7 diversi momenti.
Coefficiente di variazione
Campioni Valor principale Ripetibilità%* Interno di laboratorio%**
pmol/L
1 304 4.8 6.8
2 818 3.1 5.4
3 1803 2.9 3.0
*Variabilità intra-assay
**La variabilità totale della prova
Specificità
Sono state trovate le seguenti reazioni trasversali:
InsulinaCalibratura
Il kit Mercodia C-peptide ELISA è calibrato contro i International Reference
Reagent for C-peptide, IRR C-peptide 84/510.
Il fattore di conversione
1 μg/L corrispondono a 331 pmol/L
Garanzia
I dati dei rendimenti presentati qui sono stati ottenuti usando le procedure
indicate. Qualsiasi cambiamento o modifica nella procedura non raccomandata da
Mercodia AB possono avere effetti su i risultati, nel caso in cui Mercodia rinuncia
al diritto tutte le garanzie espresse, implicite o fissate, inclusa la garanzia implicita
per l’uso commerciale e appropriato.
Mercodia AB e i suoi distributori autorizzati, in tal caso, non sarà soggetto a
danni indiretti o consequenziali.
Riferimenti
Gaines-Das RE and Bristow AF (1988) WHO international reference reagents for
human proinsulin and human insulin C-peptide. J. Biol Stand 16:179-186
Riserus U, Vessby B, Arner P, Zethelius B (2004) Supplementation with
trans10cis12-conjugated linoleic acid induces hyperproinsulineamia in obese men:
close association with impaired insulin sensitivity. Diabetologia 47:1016-1019
Rudovich NN, Rochlitz HJ, Pfeiffer AF (2004) Reduced hepatic insulin extraction
in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin
secretion in normal-weight and normal glucose tolerant first-degree relatives of
type 2 diabetic patients. Diabetes 53:2359-65
Ulteriori riferimenti sono disponibili sulla nostra pagina web: www.mercodia.com
11Protocollo di sintesi
Mercodia C-peptide ELISA
Aggiungere Calibrators,
25 μL
controlli* e campioni
Aggiungere Assay Buffer 50 μL
1 ora a 18–25°C in una piastra
Incubazione
shaker 700-900 rpm
Lavare piastra con soluzione
700 µL, 6 volte
wash buffer 1X
Aggiungere di soluzione enzyme
100 μL
conjugate 1X
1 ora a 18–25°C in una piastra
Incubazione
shaker 700-900 rpm
Lavare piastra con soluzione
700 µL, 6 volte
wash buffer 1X
Add Substrate TMB 200 μL
Incubazione 15 minuti a 18-25°C
50 μL
Aggiungere Stop Solution Agitare per 5 secondi per
garantire la miscelazione
Misura A450 nm Valutare i risultati
*Non incluso Per tutti i dettagli vedere a pagina 7
Per assistenza tecnica contattare: support@mercodia.com
31-3122
Version 14.0
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