Le nuove metodologie diagnostiche per aumentare la sicurezza delle cure - Francesco Luzzaro UOC Microbiologia e Virologia Ospedale Alessandro ...
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Le nuove metodologie diagnostiche
per aumentare la sicurezza delle cure
Francesco Luzzaro
UOC Microbiologia e Virologia
Ospedale Alessandro Manzoni, Lecco
Roma, 9 maggio 2019
Identificazione dei batteri
nella routine del Laboratorio di Microbiologia
Roma, 9 maggio 2019
Chiusura MALDI-TOF-MS
del vuoto
Sistema sotto vuoto
Piastra del
Griglie di Tubo di volo Rilevatore di Ioni
campione
accelerazione
Molecole di analita
immerse nella matrice Spettro di Massa
Lo spettro di massa riflette
essenzialmente le molecole di analita
Roma, 9 maggio 2019
Profilo MALDI
Identificazione basata su proteine ribosomiali
Spettri di massa specifici per famiglia, genere e specie
Intens. [a.u.]
4364.06 ribosomal Protein m/z
RL36 4364,33
5000
RS32 5095,82
5380.64
6254.64
RL34 5380,39
RL33meth. 6255,39
RL32 6315,19
4000
RL30 6410,60
6315.49
RL35 7157,74
RL29 7273,45
RL31 7871,06
5096.01
3000
RS21 8368,76
7157.65
7273.87
6410.90
2000
7870.62
8368.99
1000
0
4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000
m/z
Escherichia coli
Roma, 9 maggio 2019
EMOCOLTURE: DIAGRAMMA DI FLUSSO
Paziente “settico” Risultato finale
Esecuzione dei prelievi Identificazione ed antibiogramma
Flacone positivo 48 h prima del risultato finale
Invio al laboratorio Crescita su piastra
Incubazione delle bottiglie
100
Semina su terreno
90
80
% Positive samples
70
60 BACTEC 9240
50 BacT/Alert
40
30
20
10
0
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72
Incubation time (hrs)
Emocoltura positiva Colorazione di Gram
Mediamente 48 h prima del risultato diagnostico Roma, 9 maggio 2019
Flacone positivo Risultato finale a 24 ore
Colorazione di Gram
Identificazione a 3-4 ore:
Interpretazione delle batteriemie
Valutazione delle resistenze intrinseche
Semina su terreno
Identificazione ed antibiogramma
Roma, 9 maggio 2019
Test rapidi per la rilevazione delle resistenze
Carbapenemasi MCR-1
Roma, 9 maggio 2019
CTX-M-1 CPE:
• KPC
• VIM
• IMP
• NDM
• OXA-48
MCR-1
Roma, 9 maggio 2019
OXA-48
KPC
12%
KPC
OXA-48
NDM
VIM
OXA-48 OXA-48
NDM
KPC
OXA-48 NDM
OXA-48
OXA-48
KPC
OXA-48 KPC
KPC VIM
VIM
KPC NDM
Grundmann H. et al., Lancet Inf Dis 2017 Roma, 9 maggio 2019
Sorveglianza nazionale 2011 Roma, 9 maggio 2019
Sorveglianza nazionale 2013 Roma, 9 maggio 2019
Roma, 9 maggio 2019
Chromid Carba (bioMérieux) ChromArt CRE (Biolife) Brilliance CRE (Oxoid) Klebsiella pneumoniae (KPC) Klebsiella pneumoniae (KPC) Klebsiella pneumoniae (KPC) Escherichia coli (NDM-1) Escherichia coli (KPC) Escherichia coli (VIM) Roma, 9 maggio 2019
Roma, 9 maggio 2019
Risultato in circa 1 ora
Roma, 9 maggio 2019Vantaggi e limiti dei metodi molecolari
I nuovi metodi molecolari automatizzati presentano numerosi vantaggi in termini
di maggiore sensibilità, semplicità d’uso, standardizzazione e tracciabilità del
risultato.
Un limite di tutti i metodi molecolari è rappresentato dal fatto che essi
identificano ciò che conoscono ed eventuali varianti possono sfuggire alla
identificazione determinando pericolosi falsi negativi.
L’integrazione delle metodiche di microbiologia tradizionale con tecniche di
biologia molecolare sempre più automatizzata, inoltre, permette di ridurre in
modo significativo il turn around time dei risultati, passando da alcuni giorni a
poche ore.
L’implementazione di queste metodiche, specie in fase di screening, può ridurre il
rischio di trasmissione delle infezioni causate da batteri MDR, fornendo al
contempo dati essenziali per una corretta terapia antibiotica.
Roma, 9 maggio 2019Next Generation Sequencing
NGS (2005):
high throughput
deep sequencing
WGS: whole genome
sequence
Roma, 9 maggio 2019Piattaforme NGS disponibili
Roma, 9 maggio 2019Roma, 9 maggio 2019
PERCORSO CONVENZIONALE (settimane) METODICA NGS (circa 18 ore) Hasman H. et al., JCM 2014 Roma, 9 maggio 2019
Informazioni che si possono ottenere con NGS
Uso clinico: Uso epidemiologico:
Identificazione batterica Analisi di episodi epidemici
Predizione del fenotipo di Epidemiologia dei meccanismi di
sensibilità agli antibiotici e resistenza e dei fattori di virulenza
della virulenza
Uso a scopo di ricerca:
Identificazione di nuovi meccanismi
di resistenza e virulenza
Roma, 9 maggio 2019Incremento dell’uso
della NGS per la
sorveglianza dei patogeni umani
ECDC Technical Report, September 2018 Roma, 9 maggio 2019Vantaggi e limiti della metodica NGS
ENORME quantità di dati generati per esperimento
• Costo
implementazione
• Mancanza personale
qualificato
• Armonizzazione
procedure
informatiche/database
• Soluzioni per
gestione/raccolta
dati/condivisione
SEQUENZIAMENTO ANALISI INTERPRETAZIONE
Roma, 9 maggio 2019Grazie per l’attenzione !
Francesco Luzzaro
Laboratorio di Microbiologia e Virologia
Azienda Socio-Sanitaria Territoriale di Lecco
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