Le malattie notificabili dei salmonidi: aggiornamenti sui Novirhabdovirus - Izsto.it
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Le malattie notificabili dei salmonidi: aggiornamenti sui Novirhabdovirus Anna Toffan Centro di referenza nazionale per le malattie dei pesci, molluschi e crostacei stituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie Problematiche vecchie e nuove nell’acquacoltura del terzo millennio Torino, 6 Aprile 2018
Rhabdoviridae • Grande famiglia di virus a -ssRNA • Dimensioni 100–430 nm x 45-100 nm • Presenza di envelope fospolipidico
Rhabdoviridae
• Comprende 18 generi
• Infettano mammiferi, pesci, uccelli, artropodi e altri invertebrati, piante
• Solo 3 generi infettano i pesci:
Sprivivirus
Perhabdovirus
Novirhabdovirus
Pereiro et al. 2016I Novirhabdovirus • Comprende 4 specie: Infectious hematopoietic necrosis virus (IHN) Viral hemorrhagic septicemia virus (VHS) Hirame rhabdovirus Snakehead virus • L’IHN è l’agente causale della necrosi ematopoietica infettiva (NEI) • Il VHS è l’agente causale della setticemia emorragica virale (SEV)
Distribuzione-VHS
He et al. 2014Distribuzione-IHN
U E
M J
LDistribuzione in Europa • UK ufficialmente indenne per VHS e IHN • Danimarca ufficialmente indenne da VHS e IHN dal 2009 • Francia vuole raggiungere l’indennità per VHS e IHN entro il 2022 • VHS – IHN endemici negli altri paesi europei
Focolai VHS e IHN in Europa – 2016
Dati EURL 2016:
•23% e 27% degli allevamenti in EU sono cat. I per VHS e IHN rispettivamente
•74% e 70% degli allevamenti in EU sono categorizzati in cat. III per VHS e IHN rispettivamente
3% nelle restanti categorie II, IV e V (63 VHS e 53 IHN focolai aperti)
6
2
23 8
3
4 3
2
4 3
12 5 3
3 1
12 18 4Italia: un po’ di storia …
• La VHS è stata segnalata per la prima volta in Italia negli anni ’60 (Ghittino et
al. 1962)
• 1978: Programma volontario di controllo VHS in provincia di Trento
• 1988: Programma obbligatorio di controllo VHS in provincia di Trento
• L’IHN è stata segnalata per la prima volta in Europa proprio in Italia nel 1987
(Bovo et al. 1987)
• 1990: IHN incluso nel programma di controllo
• Dal 1992 in poi: entrata in vigore norme comunitarieDistribuzione aziende indenni in Italia - 2017
• 513 aziende con specie sensibili censite
• 189 aziende indenni VHS
• 178 aziende indenni IHN
Nessun nuovo focolaio di VHS e IHN
nel 2017
In blu indenni per entrambe
In verde indenni solo per VHSVHS-ospiti • Il VHS è stato isolato da più di 80 specie ittiche diverse in tutto il mondo • La specie più suscettibile è la trota iridea (O. mykiss) • Anche i pesci piatti (rombo e passera in particolare), il luccio e le aringhe sono molto sensibili alla VHS • Trota fario, trota marmorata, salmerino sono meno suscettibili alla malattia • L’elenco (non aggiornato) delle specie sensibili e vettrici si trova nel D.lvo 148/2008 e nel Reg EC/1251/2008
IHN-ospiti
• Gli ospiti principale della malattia sono i pesci appartenenti alla famiglia dei
Salmonidae
• Il salmone (S. salar) è senza dubbio la specie più sensibile
• Gli Oncorhynchus sono le più sensibili dopo il salmone
• Pesci appartenenti ad altra famiglie: Salvelinus spp. Anguilla Anguilla, Clupea
pallasi, Gadus morhua, Acipenser transmontanus, Esox Lucius sono meno
sensibili alla malattia
• IHNV è endemico nelle popolazioni di salmoni americani selvaticiSegni clinici Gli animali giovani sono i più suscettibili alla malattia con mortalità che possono raggiungere anche il 100% I principali segni clinici sono: • Letargia • Melanosi • Nuoto anomalo a spirale • Esoftalmo • Emorragie cutanee • Anemia e/o emorragie branchiali • Distensione addominale
Segni clinici VHS
Segni clinici VHS
Segni clinici IHN
Segni clinici IHN
1990
Ottobre
2015Lesioni anatomo-patologiche • Esoftalmo • Ascite • Splenomegalia • Emorragie in tutti gli organi • Anemia
Lesioni anatomopatologiche VHS
Lesioni anatomopatologiche VHS
Lesioni anatomopatologiche IHN
Lesioni anatomopatologiche IHN
Lesioni anatomopatologiche IHN
Patogenesi
• Trasmissione orizzontale e verticale (attraverso i fluidi riproduttivi)
• Lo sviluppo della forma clinica è strettamente dipendente dalla temperature dell’acqua:
tra 4 e 14°C il tempo di incubazione è di 5-12 giorni, a temperature 15°C generalmente la malattia non si manifesta
• I virus replicano in tutti gli endoteli, causando forme sistemiche
• Nelle forme croniche i virus tendono a localizzarsi nel SNC
• I virus vengono eliminato con le escrezioni e le secrezioni dei pesci infetti
• La forma clinica è più grave nei pesci < 1 anno, ma episodi di malattia si possono
osservare a tutte le età
• I pesci che sopravvivono generalmente restano portatori
• I virus possono resistere nell’acqua a basse temperature per molto tempo (più di un
anno)
• I virus possono essere veicolati con le attrezzature, le movimentazioni di animali infetti o
portatori, uccelli ittiofagiDiagnosi/1 IHN e VHS sono sovrapponibili dal pdv clinico: indispensabile ricorrere al laboratorio Sebbene molto simili VHSV e IHNV sono due virus distinti che non cross reagiscono Sono frequenti le coinfezioni Isolamento virale su colture cellulari (BF-2 and EPC) a 15°C. Altre linee cellulari (FHSM o le RTG-2) sono suscettibili 2 passaggi ciechi di 7 giorni ciascuno sono necessari prima di considerare il campione negativo.
Diagnosi/2
Alla comparsa dell’effetto citopatico, l’isolato virale può venire caratterizzato mediante: IF, PCR,
ELISA, SN.
L’isolamento virale è stata per anni la tecnica gold standard.
La decisione di esecuzione 1554/2015 che abroga la 183/2001 ha riconosciuto ufficialmente le
tecniche di biologia molecolare.
Photo by I. CapuaDiagnosi/3 Diversi protocolli di RT-PCR protocolli disponibili: • End point RT-PCR • Real time RT-PCR VHS (Jonstrup et al. 2013) • Real time RT-PCR IHN (Purcell et al. 2013)
Panzarin et al. 2016
Filogenesi VHSV
• 108 ceppi di VHS sequenziati (1982-2013)
• Gene G più informativo
• Identificati in Italia 7 cluster (A-F1)
• In Italia nel tempo ci sono state
introduzioni virali multiple
• Virus a tasso di evoluzione intermedio
(7.3 × 10−4 subs/site/year)
• Time to the most recent common
ancestor (tMRCA) stimato tra 1968 -
1979Filogenesi VHSV - Trentino • Dati 2013-2016 • Solo 2 cluster virali circolanti • Presenza di «scambi» virali tra allevamenti • Nessuna nuova introduzione recente
Filogenesi IHNV Panzarin 89 ceppi di IHN sequenziati (1991-2013) Gene G più informativo dentificato 1 solo cluster (A) Virus a tasso di evoluzione > di VHS (11 × 10−4 ubs/site/year) Time to the most recent common ancestor tMRCA) stimato tra 1982-1988 Virus più giovane HNV evolve più rapidamente di VHSV
Filogenesi IHNV - Trentino • Dati 2013-2016 • Diversi ceppi virali circolanti • Presenza di «scambi» virali tra allevamenti • Introduzioni recenti? • Aumentata virulenza di IHNV
Novimark Identificare i marker molecolari di virulenza dei Novirhabdovirus al fine di sviluppare e validare test diagnostici rapidi che consentano di discriminare tra ceppi a bassa e ad alta patogenicità. Partner : Institut National de la Recherche Agronomique (INRA, Francia) (Coordinatore) Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie (IZSVe, Italia) Agence Nationale de Sécurité Sanitaire (ANSES, Francia) Technical University of Denmark (DTU, Danimarca) Universidad de Santiago de Compostela (IA-USC, Spagna) Center for Enviroment Fisheries and Acquaculture Science (CEFAS, Regno Unito)
Novimark • Prima fase: caratterizzare il maggior numero di ceppi di VHS e IHN in base alla patogenicità • Infezione per bagno di trote iridee di 0,1-0,3 g con 104 TCID50/ml • 40% e 70% alta patogenicità
Caratterizzazione VHSV Italiani
%
Class of
Virus cumulative
virulence
mortality
VHSV/O.mykiss/I/TN/480-2/Oct96 14,3 Low
VHSV/O.mykiss/I/PN/234/Mar99 100 High
VHSV/O.mykiss/I/BZ/301/Jun00 92,9 High
VHSV/O.mykiss/I/TV/3-2/Dic02 55,7 Moderate
VHSV/O.mykiss/I/TN/475/Nov04 91,4 High
VHSV/O.mykiss/I/TV/299-3/Aug04 100 High
VHSV/S.trutta/I/TN/470/Nov09 55,7 Moderate
VHSV/O.mykiss/I/TN/80/Mar10 100 High
VHSV/O.mykiss/I/TN/28-1.2/Feb11 100 High
VHSV/O.mykiss/I/TN/62-5/Feb15 100 High
VHSV/O.mikiss/I/TN/68-10/Feb15 100 HighCaratterizzazione IHNV Italiani
% cumulative Class of
Virus
mortality virulence
IHNV/O.mykiss/I/TN/459/Sep97 48,6 Moderate
IHNV/O.mykiss/I/TN/139-6/Mar01 L.1 15,7 Low
IHNV/O.mykiss/I/TN/139-6/Mar01 L.2 18,6 Low
IHNV/O.mykiss/I/TV/3-1/Jan02 10 Low
IHNV/O.mykiss/I/TV/310-1/May05 10 Low
IHNV/O.mykiss/I/VI/409/Nov06 L.1 20 Low
IHNV/O.mykiss/I/VI/409/Nov06 L.2 18,6 Low
IHNV/O.mykiss/I/TN/534/Dec11 5,7 Low
IHNV/O.mykiss/I/TN/143/Apr14 5,7 Low
IHNV/O.mykiss/I/TN/86-9/Feb15 55,7 Moderate
IHNV/O.mykiss/I/TN/68-4/Feb15 60 Moderate
IHNV/O.mykiss/I/TN/62-6/Feb15 50 Moderate
IHNV/O.mykiss/I/TN/509/Oct15 82,9 HighNovimark in progress
• Sequenza completa dei virus caratterizzati in vivo
• Identificazione delle mutazioni caratterizzanti i ceppi ad alta patogenicità, anche
in associazione (NV-N-L)
• Generazione di virus reverse genetic (RG) con e senza le mutazioni identificate
• Infezioni sperimentali con ceppi RG
• Sviluppo test molecolari discriminanti i diversi ceppiControllo e Prevenzione • Non esistono vaccini commerciali per questa malattia. Di fatto la vaccinazione è vietata ai sensi del D.lvo 148/2008 Applicazione delle norme di biosicurezza Buone prassi igieniche Installazione reti anti-ittiofagi Controllo approvvigionamento idrico Limitazione delle movimentazioni Riduzione dei contatti con animali selvatici (derattizzazione, ostacoli alla risalita, animali domestici) Raccolta e controllo della mortalità Introduzione di materiale indenne Disinfezione delle uova
Fattori di rischio di introduzione e diffusione di agenti infettivi
(Dec. 2008/896)
Acqua Movimentazione di pesci/uova
• Ripopolamento a monte dell’azienda con specie sensibili •Stato sanitario delle aziende da cui si acquista pesce
• Presenza di aziende a monte e loro stato sanitario e/o uova
•Introduzione di pesce selvatico
Allevamento
d’acquacoltura • Tipo di produzione
Fattori geografici
• Densità degli allevamenti
• Prossimità degli allevamenti
Misure di biosicurezza
• Disinfezione di mezzi ed attrezzature
• Condivisione di mezzi e personale
• Stato sanitario degli allevamenti a monte e a valle
• Presenza di reti contro uccelli ittiofagi
Ceolin SIPI 20Analisi dei fattori di rischio per l’introduzione di VHSV in impianto 1) Raccolta informazioni (dalle schede di richiesta di autorizzazione e valutazione del rischio) relative a: •Indirizzo produttivo: az. con riproduttori, az. con incubatoio, az. da ingrasso per consumo umano •Tipologia di approvvigionamento idrico : corso d’acqua, pozzo, sorgiva •Stato sanitario delle aziende da cui si acquista pesce 2) Raccolta informazioni geografiche (GIS): •Posizione geografica •Numero e stato sanitario degli allevamenti presenti nel raggio di 5 km •Distanza dal più vicino allevamento positivo per VHS •Numero di allevamenti presenti lungo il corso d’acqua entro i 5 km a monte e a valle 3) Risultati analisi di laboratorio per la ricerca di VHS dal 2010 al 2015 4) Creazione ed implementazione di un database
Risultati Conferma di quanto riportato in letteratura (Oidtmann et al., 2011) cioè che i fattori di rischio più importanti associati alla diffusione di VHS sono: Stato sanitario aziende limitrofe Vicinanza ad allevamenti positivi Movimentazioni di animali vivi Conferma che i fattori considerati nella scheda “di valutazione del rischio” per il rilascio dell’autorizzazione sono giustamente da prendere in considerazione: Presenza di aziende a monte e loro stato sanitario Movimentazioni (legate all’indirizzo produttivo) stato sanitario delle aziende da cui si acquista pesce Ulteriori approfondimenti necessari analizzando anche l’applicazione delle misure di biosicurezza nonché il numero e l’origine delle singole partite introdotte in azienda
Controllo e Prevenzione Applicazione delle norme di biosicurezza Buone prassi igieniche Installazione reti anti-ittiofagi Controllo approvvigionamento idrico Limitazione delle movimentazioni Riduzione dei contatti con animali selvatici (derattizzazione, ostacoli alla risalita, animali domestici) Raccolta e controllo della mortalità Introduzione di materiale indenne Disinfezione delle uova
Abbattimento a fasi nelle aziende di acquacoltura sedi di focolaio Nota Minsal 2386-31/01/2017 Nelle aziende colpite da VHS e IHN, in alternativa allo svuotamento completo dell’azienda prima del ripopolamento, ove possibile, è permesso effettuare il ripopolamento prima del completamento del ciclo produttivo dei pesci ancora sotto taglia commerciale (eradicazione per fasi) - Effettuata secondo una logica «da monte a valle» - Effettuata sotto controllo della ASL territorialmente competente con l’adozione di appropriate misure di biosicurezza - Associata all’esecuzione di opportuni controlli diagnostici a carico dell’allevatore per monitorare gli eventuali rischi sanitari
Sector 4
Sector 2
Sector 3
Sector 1Eradicazione a step Vantaggi •Approccio innovativo •Approccio a lungo termine senza interruzione di produzione •Minori costi di disinfezione e personale •Educazione alla biosicurezza sul lungo termine •In caso di reinfezione si può ricominciare il programma senza elevate perdite economiche •Possibilità di chiudere i focolai di malattia Svantaggi •Percentuale di successo sconosciuta •Elevato rischio di reinfezione •Azione di lunga durata •Elevati costi di mantenimento della biosicurezza (nel lungo periodo)
atoffan@izsvenezie.it
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