Indicatori immunologici integrati di valutazione dell'adattamento ambientale del bovino da latte
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Indicatori immunologici integrati
di valutazione dell’adattamento
ambientale del bovino da latte
Andrea Minuti, Erminio Trevisi
Dipartimento di scienze Animali, della Nutrizione e degli Alimenti,
Università Cattolica S. Cuore, Piacenza (ITALY)
andrea.minuti@unicatt.it
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 1
Summary
1. Risposta
infiammatoria
• Fegato
• Citochine
• Markers di fase acuta
2. Periodo di transizione
– indici compositi
• LFI, LAI, PIRI
• Marcatori predittivi
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 2
Sequenza degli eventi
durante la risposta
infiammatoria (Trevisi et al., 2016)
INDUTTORI SENSORI SEGNALI EFFETTI
Batteri, virus
microbici
Esogeni
allergeni, sostanze
(PAMPs) irritanti, corpi
Non estranei, composti
microbici tossici, fattori di
stress psicologici
✓Amplificazione
SENSORS Soluble systems & Cells
✓Manutenzione
Induttori Tissue • Segnali rilasciati da ✓Progressione
cellule stressate,
malfunzionanti o
Cell morte e da tessuti ✓Reiterazione
Endogeni danneggiati
Plasma ✓Risoluzione
(DAMPs) • Cristalli endogeni
Extracellular • Prodotti di rottura
matrix della matrice
extracellulare
PAMPs = pathogen-associated molecular pattern;
DAMPs = damage-associated molecular pattern
3
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A.
PIC sono responsabili di una serie di effetti
negativi (da lieve infiammazione a malattia)
Heat stress Pathogens
(microbes) Parasites
PAMPs = Oxidative
pathogen- stress
associated
Trauma/injury
molecular Activity
pattern; excess Nutrition: Deficiency /
DAMPs =
“distress” excesses, Poisoning, digestive
Emotional disorders, etc.
damage- stress
associated
molecular Physical Inflammation
Mental symptoms
pattern symptoms: (PIC, e.g. IL1β-IL6- loss of interest for
TNFα) environment, depression,
fever, tissue irritability, mild cognitive
damage, pain disorders, suffering
(Dantzer et al., 2008)
(Johnson and Finck, 2001)
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 4
Digestive rumen Infectious &
UTERUS disorders gut trauma
(pathogens)
INDUCERS (i.e. LPS)
MAMMARY GLAND
macrophages
SOCIAL STRESS
(i.e. overcrowding, INFLAMMATION Mast cells
discomfort)
Histamine
Pro-inflammatory
Hypothalamus:
SNC: anorexia cytokines (PIC)
fever Anaphylactic
shock
RUMEN: reduced motility
Adipose tissue: ADRENAL CORTEX:
lipolysis HYPHOPHYSIS:
CRH glucocorticoids
Lower absorption Pancreas:
of nutrients glucagon
Anti-inflammation
e.g. PIC, PG,
Increased proteins LIVER metallothionein
haptoglobin Zn metallothionein
ceruloplasmin (Cu) “acute phase”
Ferritin
Serum Amyloid A blood
Zn albumin
Fe
Reduced synthesis lipoproteins
of “common” blood Binding of proteins
uptake
and hormones
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 5
14 multiparous Holstein cows differentially expressed genes (DEG)
7 DIM Dynamic Impact transcription
7 cows = Intramammary LPS Approach (DIA) regulator
challenge
7 cows = Intramammary saline
Results - LPS vs. CTR
~2.5 h
Downregulated
189 of total DEG 20
Biopsies
169
Upregulated
RNA extraction Downregulated
107 of total DEG 42
Microarray
65
Upregulated
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 6
KEGG SUB-CATEGORY KEGG PATHWAY FLUX IMPACT
Immune System NOD-like receptor signaling pathway
Immune System RIG-I-like receptor signaling pathway
Immune System Cytosolic DNA-sensing pathway
FLUX IMPACT Immune System Chemokine signaling pathway
-50 0
-25 12.5 Immune System Adipocytokine signaling pathway
0 25 Immune System Toll-like receptor signaling pathway
25 50
Cell Growth and Death Apoptosis
50 100
Carbohydrate Metabolism Pentose phosphate pathway
Spazio extracellulare
Spazio extracellulare
Minuti A.
7
Lipidi totali
Trigliceridi
The effect of intra-mammary LPS or saline
(CTR) challenge at 7 days postpartum in
Networks among cytokines differentially expressed in the mammary gland and Holstein cows on liver lipid and
transcription regulators differentially expressed in liver at 2.5 h after intra-mammary triacylglycerol (TAG) concentration after
LPS challenge. Figure generated by IPA. Red color denotes upregulation due to LPS LPS challenge and 14 days in milk (DIM).
and green downregulation due to LPS. a-b Denote differences (Group 9 time) due
to LPS challenge.
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 8
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 9
Citochine proinfiammatorie e
periodo di transizione della bovina
1. Le PIC mostrano livelli più alti prima e dopo il parto in
relazione alle malattie riproduttive del postpartum
(Ishikawa et al., 2004 J. Vet. Med. Sci. 66,1403–1408)
2. Non chiaro la variazione delle PIC in tarda gravidanza
(Trevisi et al., 2012 Res. Vet. Sci. 93, 695–704)
0
IMMAGINE
IMMAGINE
Le PIC sono responsabili della risposta
infiammatoria nel periodo di transizione?
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 10Pattern of changes of IL1β and IL6 in TP. (Significant Changes of plasma IL-6 in TP in cows grouped with UP-IL1, differences of each DFP vs -35 DFP are marked as *P
Ingestione e produzione in
UPIL1 INIL1 e LOIL1
Trevisi et al. 2015; IJAS 14:285-292
The letters A and B in the figures indicate the overall significant differences between the groups (PPrevalenza degli eventi clinici durante
il primo mese di lattazione
(Trevisi et al. 2015 Ital. J. Anim. Sci.)
Group
Item LOIL1 INIL1 UPIL1
Cow 7 7 7
Retained Placenta 0 1 0
Mastitis 0a 2ab 4b
Fever 2 3 2
Other 1 2 2
Number of cows with clinical
problems (1 or more) 2 4 5
Buona relazione tra i livelli di PIC e i problemi di salute clinica dopo il parto.
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 13Acute Phase Response
(posAPP & negAPP)
Cambiamenti nella concentrazione delle proteine plasmatiche dopo infiammazione.
A1 AGP, alpha-acid glycoprotein; CRP, C-reactive protein; ALB, albumin; ROM, reactive oxygen metabolites;
CHOL, cholesterol. Changes in CRP and haptoglobin concentrations are plotted on a logarithmic scale (adapted
from Fleck, 1989 and our data).
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 14Periodo di transizione, infiammazione e
proteine di fase acuta
Cosa misurare?
– Presenza di infiammazione?
– Conseguenza infiammazione?
plasma • Proteine positive di fase acuta
• i.e. aptoglobina, ceruloplasmina, I cambiamenti post-parto
posAPP SAA delle negAPP sono
maggiormente correlati
plasma • Proteine negative di fase acuta
• i.e. albumina, lipoproteine, RBP,
con le prestazioni, la
salute e l'efficienza rispetto
negAPP paraoxonase alle posAPP
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 15Punti critici del TP
1. immuno-
competenza (Kehrli
1997, Lacetera et al., 2005)
2. Forte BEN
(mobilizzazione delle
riserve corporee)
IMMAGINE
3. Infiammazione
(Cappa et al., 1989; Bionaz
et al., 2007), anche in
animali Goff & Horst Grummer / Theriogenology 68S (2007) S281–S288
apparentemente sani
4. Stress ossidativo
IMMAGINE
(Formigoni et al., 1997;
Bernabucci et al., 2005;
Bionaz et al., 2007)
5. Ipocalcemia (Goff,
2007; DeGaris & Lean, 2009)
Bertoni e Trevisi, 2013 VET CLIN N AM-FOOD A 29(2):413–431
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 16Come valutare la gravità di un
evento infiammatorio nel TP?
Sangue: "specchio del metabolismo"
• quali biomarcatori?
• quando misurare?
Suggeriamo alcuni "indici compositi" per valutare
le risposte / effetti dell'infiammazione in un
periodo limitato (ad esempio 3-30 DIM):
• LAI (Liver Activity Index) (Trevisi et al., 2001)
• LFI (Liver Functionality Index) (Bertoni et al., 2006)
Details in:
Trevisi et al., 2016 Chapter 9 - In “The Innate Immune Response to Non-infectious Stressors” ISBN: 978-0-12-801968-9
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 17LFI = Liver Functionality Index
Bertoni et al., 2006; Trevisi et al., 2016
3 biomarkers plasmatici legati alle sintesi epatiche:
albumina
colesterolo (= lipoproteine)
parametri
bilirubina (= misura indiretta degli enzimi necessari per la sua
clearance)
• 2 campionamenti nel primo mese di lattazione (3 and 28 DIM)
• I step: indice per ogni biomarker: per albumina e colesterolo = 50% VI + 50% I; per
la bilirubina = 67% VI + 33% R (VI = valore a 3 DIM; I = incremento da 3 a 28 DIM; R
= riduzione da 3 a 28 DIM)
calcolo • II step: normalizzazione degli indici (step I) con valori di riferimento ottenuti da
animali sani e con buone performance produttive
• Il punteggio finale di ogni vacca è la somma degli indici normalizzati
• Il punteggio può essere confrontato con tutte le vacche (tra allevamento e
punteggio lattazioni)
• Più è elevato il valore migliore è l’adattamento dell’animale e minori sono le
conseguenze dell’evento infiammatorio nel periparto
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 18LAI = liver activity index
Trevisi et al., 2001; Bertoni et al., 2008
3 biomarkers plasmatici normalmente sintetizzati dal
fegato:
albumina
parameters colesterolo (= lipoproteine)
vitamina A (= retinol binding protein)
• 3 or 4 campioni nel primo mese di lattazione
• Dati trasformati in unità di deviazione standard (all’interno di ogni
calculation allevamento) per ridurre la differenza dovuta all’ambiente
• Il punteggio finale per ogni vacca è la media del punteggio parziale
dei tre punteggi per ogni parametro ematico
• Più è alto migliore è l’adattamento della vacca e minori sono le
score conseguenze dell’infiammazione
LAI and LFI: r = 0.87; PLFI = Liver Functionality Index
6,0
CHOLESTEROL (mmol/L)
5,0
Indici diretti (albumina,
colesterolo) e indiretti (bilirubina)
4,0 **
**
della risposta negAPP in campioni *
**
3,0
di plasma di vacche con LFI alta *
** **
2,0
(HILFI) e bassa (LOLFI). (Trevisi et +
al., 2012 Res Vet Sci 93:695-704)
1,0
-28 -21 -14 -7 0 7 14 21 28
Days around calving
42,0 12,0
TOTAL BILIRUBIN (µmol/l)
40,0 10,0
ALBUMIN (g/l)
38,0 8,0 +
*
36,0 *
* ** ** 6,0 **
* ** ** * * *
34,0 * 4,0 *** *
*** *
** *** **
32,0 2,0
+
* *
30,0 0,0
-28 -21 -14 -7 0 7 14 21 28 -28 -21 -14 -7 0 7 14 21 28
Days around calving Days around calving
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 20LFI & stato di salute
Trevisi et al. 2014. RVS 96(2):229-233
Table 1 - Frequency of main health problems observed in the first month of lactation in multiparous dairy cows, belonging to two
herds ranked in tertiles of Liver Functionality Index (LFI): low (LOLFI), intermediate (INLFI), high (HILFI) LFI. Different subscripts
among groups of LFI within each herd indicate statistical differences (P 39.5°C (also without additional clinical signs); Other = other health problems with clinical signs
... i costi dei trattamenti farmacologici ridotti rispettivamente del
77 e del 45% (tra terzile migliore vs. peggiore)
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 21LFI & costi delle terapie
(antibiotici)
Trevisi et al. 2014. RVS 96(2):229-233
Table 2 - Average costs (euro/cow) for the drug treatments in the first month of lactation in
multiparous dairy cows, belonging to two herds ranked in tertiles of Liver Functionality Index
(LFI): low (LOLFI), intermediate (INLFI), high (HILFI) LFI. Different subscripts among groups
of LFI within each herd indicate statistical differences (PLFI: body reserves
mobilization & milk yield
46 Milk Yield (kg/d) ***
2.9 **
BCS 41
L O -L F I
*
IN L O -L F I ***
**
IN U P -L F I
2.7
U P -L F I
36
** ***
2.5 *
31
DIM
2.3
26
-14 -7 0 7 14 21 28 35 70 14
14 28 DIM
28
BCS and Milk Yield in lower (LO-LFI, ), lower intermediate (INLO-LFI, ), upper intermediate
(INUP-LFI ) and upper (UP-LFI, ) quartile of LFI. Significant differences between LO and
others groups, at the same DIM are shown: * PLFI & efficienza energetica
Trevisi et al., 2010 - 3rd ISEP Meeting - EAAP publ. No. 127:489-490
Bilancio energetico
LO-LFI vs HI-LFI (1° mese di lattazione):
Minore efficienza in
✓ Maggiore NEB (PAminoacidi
Concentrazione plasmatica di AA glucogenici
LFI P-value
Amino acids LFI×Da
L ML MH H SEM1 LFI Day
(µmol/L) y
Alanine 177.12cd 190.40bc 207.77ab 211.25a 6.96 < 0.01 < 0.01 0.02
Asparagine 34.30cd 38.18bc 40.29ab 44.25a 1.53 < 0.01 < 0.01 0.05
Proline 69.28bc 74.30bc 75.49ab 82.17a 2.73 0.02 < 0.01 0.47
Serine 81.76b 89.29a 88.15a 91.47a 2.19 0.02 < 0.01 0.27
Tyrosine 38.43b 40.29b 42.34b 47.70a 1.80 < 0.01 < 0.01 < 0.01
TAA 1885.63b 2005.46b 1995.1b 2184.62a 34.50 < 0.01 < 0.01 0.42
H-LFI mostra:
✓ disponibilità di aminoacidi glucogenici i quali
contribuiscono ad una migliore performance produttiva
(ma suggeriscono anche una minore infiammazione)
Zhou et al., 2016 JDS
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 25Migliori performace produttive in
animali con alto LFI
DMI, produzione e qualità del latte
Zhou et al., 2016 JDS
LFI P-value
Parameter L ML MH H SEM1 LFI Day LFI×Day
Prepartum
DMI (kg/d) 11.59d 13.54c 14.67bc 15.87ab 0.70 < 0.01 < 0.01 0.43
Postpartum
DMI (kg/d) 16.14cd 17.86c 21.26ab 21.78a 0.82 < 0.01 < 0.01 0.70
Milk yield 36.24d 41.89c 48.04ab 49.54a 2.03 < 0.01 < 0.01 < 0.01
Milk fat yield 1.35b 1.62a 1.56ab 1.58ab 0.09 0.11 < 0.01 0.07
Milk protein yield 1.09d 1.35c 1.49bc 1.61ab 0.06 < 0.01 < 0.01 < 0.01
Milk components
Fat 3.90d 4.02cd 3.33a 3.27ab 0.18 < 0.01 < 0.01 0.78
Protein 3.12 3.35 3.19 3.35 0.11 0.34 < 0.01 0.10
SCC6 1.86 2.02 1.74 1.81 0.13 0.36 0.02 0.89
Lactose 4.61 4.67 4.76 4.77 0.05 0.07 < 0.01 0.85
Total solids 12.25b 12.97a 12.11b 12.28b 0.24 0.04LFI e profilo
immunometabolico
Biomarcatori di infiammazione e stress ossidativo
Zhou et al., 2016 JDS
LFI P-value
Parameter L ML MH H SEM1 LFI Day LFI×Day
Liver function and inflammation biomarkers
Cholesterol (mmol/L) 2.78d 3.28c 3.76ab 3.80a 0.17 < 0.01 < 0.01 < 0.01
Albumin (g/L) 34.45b 36.09a 36.47a 37.06a 0.50 < 0.01 0.13 < 0.01
Bilirubin (µmol/L) 6.33b 4.58ab 3.18a 3.54a 0.73 0.01 < 0.01 0.21
Haptoglobin (g/L) 0.55b 0.45b 0.41b 0.21a 0.06 0.01 < 0.01 0.24
Oxidative Stress biomarkers
Paraoxonase (U/ml) 75.08b 88.54ab 93.76a 96.15a 5.39 0.05 < 0.01 0.02
Liver total GSH (µmol/g protein) 23.55 34.71 83.12 51.10 16.83 0.09 < 0.01 0.91
Liver reduced GSH (µmol/g protein) 23.06 34.13 82.18 50.48 16.72 0.09 < 0.01 0.91
Alto LFI = Riduzione di infiammazione e stress ossidativo
− Il colesterolo più alto suggerisce una funzionalità epatica migliore
− Maggiori negAPP (alb) & minori posAPPs (& Hp) suggeriscono minore
infiammazione
− Maggiore PON e GSH suggerisce un minore stress ossidativo
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 27L'infiammazione ritarda la ripresa della
ciclicità ovarica
(30.0±2.5 vs 18.4±0.8 DIM in LO & HI-LAI)
Grafico di sopravvivenza:
proporzione di 21 vacche
che hanno ovulato HI-LAI
durante i primi 42 DIM. Le
vacche sono state
classificate in base al loro
LAI: gruppo 1 (LO-LAI,
linea tratteggiata, N = 10) LO-LAI
e gruppo 2 (HI-LAI, linea
continua, N = 11) valori
inferiori di LAI indicano
una più seria conseguenza
infiammatoria Osservations on cows of Bossaert et al.,
Vet. J. 2011, 192(2):222-225
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 28LFI & fertilità
(Bertoni et al., 2006 - EAAP)
Il gruppo UP-LFI (il più produttivo) ha avuto la migliore fertilità
Fertility indices in lower (LO), lower and upper intermediate (INLO,
INUP) and upper (UP) quartile of LFI.
Groups LO-LFI INLO-LFI INUP-LFI UP-LFI
Indices
PFS 34.0 30.0 38.0 44.0
DO# 123.47±66.31 124.91±59.37 113.01±57.89 100.72±57.02
NSC# 2.17±1.68 2.21±1.47 2.06±1.43 1.58±1.02
% culled 19.0 9.0 0.0 16.0
FSI 23.20 29.66 55.44 61.13
Legend: # Normalized data
PFS (% Pregnant to First Service); DO (Days Open); NSC (Number of Services per Conception);
FSI (Fertility Status Index) = (PFS/NSC) – (DO - 125) – (% culled – 25)
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 29Una migliore funzionalità epatica (LFI) significa migliore fertilità, e conferma i nostri dati (Bertoni et al., 2008 JDS, 91:3300-3310; Bossaert et al., 2011 Vet.J. 192:222-225) Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 30
LFI e il periodo di transizione
Vacche alte LFI vs vacche basso LFI
DMI (+13%) Mobilizzazi Produzione Migliore risposta
one riserve di latte immunitaria
(~30% less) [lower liver APR; fewer clinical diseases (-
ruminazione +10% 85%), lower rectal T°]
Minore NEB: -21% Energia di mantenimento
Migliore bilancio N: +13% (energia e AA per il sistema immunitario)
efficienza:
+15%
benessere fertilità longevità
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 31Un indice più tempestivo
per il TP
✓ A livello dell'allevamento è richiesto un indice più
tempestivo per scoprire gli animali problema
(possibilmente entro 1 ° sett. di lattazione)
✓ “Instant LFI” = PIRI (Post-calving Inflammatory
Response Index)
• Profilo ematico diagnostico semplice e rapido
• Include molte risposte biologiche (posAPP, negAPP,
stress ossidativo)
• Rileva casi subclinici a 3-7 DIM
• Non è valido per patologie che saranno causate da errori
dopo 1 ° settimana
• Richiede ulteriori approfondimenti (ad esempio in
combinazione con strumenti di precisione del bestiame)
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 32PIRI Post-calving Inflammatory
Response Index (Trevisi et al., 2016)
4 biomarkers plasmatici:
• aptoglobina (posAPP)
• Colesterolo (= lipoproteine) and Paraoxonasi (negAPP)
parameters
• ROM (stress ossidativo)
• 1 prelievo ematico a 7 (±1) DIM
• Per ogni parametro è definite un range [valori estremi = 10 punti (migliore) e 0
(peggiore)] il punteggio per ogni vacca è calcolato utilizzando una relazione
calculation lineare.
• Punteggio finale: somma aritmetica dei 4 valori parziali.
• Più è alto il valore migliore è l'adattamento dell’animale e minori le
conseguenze infiammatorie
score
Alto PIRI:
bassa infiammazione,
basso stress ossidativo, Tertile of
% on cows
PIRI score with clinical
lievi conseguenze sulla PIRI
diseases
LO-PIRI 13.76 ±4.29 53
salute / prestazioni IN-PIRI 23.33 ±1.49 26
HI-PIRI 31.17 ±3.59 16
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 33XXXXXXX
XXXXXXX
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 34POSSIBILE
Marcatori candidati per l’identificazione di
AGGIORNAMENTO IN vacche a rischio prima del TP
ASCIUTTA
✓ PIC (high):
• IL6 Trevisi et al., 2015 IJAS 14:285-292; Amadori et al., 2015 RVS 102:25-26;
• IL1 Trevisi et al., 2015
✓ Complemento (low): Trevisi et al., 2010 JDR 77:310–317
✓ Ceruloplasmina (high): Trevisi et al., 2012 RVS 93:695-704; Trevisi et al., 2015
✓ ROM (high): Trevisi et al., 2010; 2012; 2015
✓ Sialic acid (high): Trevisi et al., 2010
✓ Bilirubina (high): Trevisi et al., 2012
✓ Albumina (low): Trevisi et al., 2012; 2015
✓ Vitamina A (RBP): Trevisi et al., 2010; 2012
✓ Lisozima (low): Trevisi et al., 2012; Amadori et al., 2015
✓ Altri d’interesse: risposta alla stimolazione con LPS (Jahan et
al., 2015); aminoacidi (Zhou et al., 2016, JDS)
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 35Acknowledgements
Prof. Erminio
Prof. Giuseppe
Trevisi
Bertoni
Prof. Juan J Loor Nusrat Jahan
Matteo
Mezzetti
Roma 17 Maggio 2019 Minuti A. 36Puoi anche leggere
