Germano Orrù Ph.D Uso dei Probiotici nelle Patologie del Cavo Orale
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Germano Orrù Ph.D Uso dei Probiotici nelle Patologie del Cavo Orale
Cavita’ Orale La bocca (anche detta cavità orale), è localizzata nella testa. Il limite anteriore, tramite il quale comunica con l’esterno, sono le labbra, il limite posteriore è formato dal palato molle e dall’istmo delle fauci (comunicazione con la faringe). Il tetto , è formato dal palato (duro anteriormente e molle posteriormente), Pareti laterali sono formate dalle guance. Arcate dentarie e Lingua. Le arcate dentarie sono 2, una superiore alloggiata sulle ossa mascellari e una inferiore alloggiata sulla mandibola. Tra le labbra e le arcate dentarie si trova uno spazio a forma di ferro di cavallo, detto vestibolo della bocca.
2000 d.C
Oral microbiology is the study of the microorganisms of the oral
cavity and the interactions between the oral microorganisms
with each other and with the host
HIPPOCRATES
400 a.C
Alfred Civilion Fones 1900 d.C
Sigmund Socransky 1990 d.C
Discovery of oral microbe
Antonie van Leeuwenhoek
1632 –1723
http://www.rightdiagnosis.com/sym/mouth_infections.htm#intro
WILLOUGHBY D. MILLER
1853-1907
•J.D. Rudney et al.
•Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas
gingivalis, and Tannerella forsythensis are components of
a polymicrobial intracellular flora within human buccal
cells
•J. Dent. Res., 84 (2005), pp. 59–63
Tannerella forsythia
Medical diagnosis
In oral infections
Diagnostician
Radiological Tests
Laboratory diagnosis
of infections
Oral infection chain
Pathogen
Virulence
Host Source
Means Trasmission
Of entry
Oral infections
Abscesses
Staphylococcus spp.
Dental caries
Streptococcus spp.
Candidiasis
Candida spp.
Endodontic infections
Coxsackievirus
Herpangina
Herpex simplex
Herpes
Gingivitis Gram -anaerobic pathogens.
Gingivostomatitis Papilloma virus
Periodontitis
Actinomyces spp
Oral Halitosis
Osteomyelitis Eikenella spp
Oral Papillomas
Microbes and humans
Very few microbes are
always pathogenic
Most Oral
Many microbes are bacterial
potentially pathogenic
Most microbes are
never pathogenic
Mark Pallen et al.,2011Oral Microbiota
Bacteria yeast Virus
protozoa• The microbiota is the vast array of bacteria, viruses, and fungi that live in and on our bodies. These organisms outnumber our own cells by 10 to 1, though they are much smaller in size. • The microbiome is the genetic information which provides the blueprints and instructions for these organisms. The terms microbiome and microbiota are generally interchangeable. Microrganisms are organized in sessile structure , biofilm
Human Microbiota
shotgun sequencing
Craig VenterNEXT Generation Sequencing
2nd Generation or High-Throughput DNA Sequencing
A differenza del
sequenziamento tradizionale
( metodo Sanger) , consente
di sequenziare moltissimi
frammenti di DNA in
parallelo, con rese
notevolmente piu’ elevateProcedura 1. Preparazione della “library” 2. Amplificazione 3. Sequenziamento
Applicazioni NGS • 1. Whole-Genome Sequencing - WGS, 2. Whole-Exome Sequencing – WES: 3. Targeted Sequencing: . 4. Transcriptome Analysis: analisi di tutti gli RNA). 5. Microbiomi (analisi infezione parodontale)
Analisi Bioinformatica ALIGNMENT VARIANT CALLING FILTERING & ANNOTATION
Strutture healthy human microbiome
Huttenhower et al., Nature 2012
• A total of 4,788 specimens from 242 screened and
phenotyped adults (129 males, 113 females)Goals •To develop a reference set of microbial genome sequences and to perform preliminary characterization of the human microbiome •To explore the relationship between disease and changes in the human microbiome •To develop new technologies and tools for computational analysis •To establish a resource repository •To study the ethical, legal, and social implications of human microbiome research
http://www.homd.org/
Next Generation sequencing NGS Dr. Germano Orrù
Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity Jørn A. Aas, Bruce J. Paster ,Lauren N. Stokes Ingar Olsen and Floyd E. Dewhirst 2005 Faculty of Dentistry, University of Oslo, Oslo, Norway
*1
I BiofilmDiapositiva 25
*1 Lezuine N.1 ( 2 ore )
*****; 09/03/2007Biofilm
Strato gelatinoso/duro aderente a :
Tessuti
Superficie dentale
Materiale vario ( es. tubature)
Costituzione :
Cellule batteriche
• Polisaccaridi complessi
Matrice amorfa • proteine
• Sali ( es. carbonati)
Inglobati ( virus)•Il Biofilm è una struttura tridimensionale vantaggiosa per i batteri. •Si possono riscontrare fluid channels per il trasporto del substrato, di rifiuti e di molecole di segnale. •La matrice che costituisce il biofilm è costituita da un mix di polisaccaridi e proteine. •Quando si organizzano in biofilm i microrganismi sono meno suscettibili agli antimicrobici e più resistenti al sistema immunitario. Un agente antimicrobico per aver effetto sul biofilm deve avere una concentrazione 10-1000 volte superiore rispetto a quella inibitoria per i microrganismi planctonici.
Biofilm nel cavo orale
• Area sottogengivale
• Dorso della lingua Anaerobiosi
Biofilm:
comunità microbica immersa in una matrice
composta da polimeri di origine batterica e
prodotti di essudazione gengivali e salivariFunzioni
Rappresenta l’ organo più importante per
la produzione del linguaggio .
Durante il discorso , la lingua può fare una
vasta gamma di movimenti
La funzione primaria della lingua è di
fornire un meccanismo per il gusto . Le
papille gustative si trovano su diverse aree
della lingua , ma si trovano generalmente
intorno ai bordi . Sono sensibili a quattro
sapori principali : amaro, acido , salato e
dolce
InduitoCoating linguale e alimentazione Film sottile , lingua bianca lucente = stato di salute
Anaerobe Bacteria in tongue biofilm
Gram -
Fusobacterium nucleatum
Porphyromonas gingivalis
Prevotella intermedia
Prevotella melaninogenica
Prevotella nigrescens
Prevotella pallens
Prevotella veroralis
Peptostreptococcus spp.
Tannerella forsythensis
Veillonella disparDisposizione del Microbiota Orale
Tongue biofilm
Newborn 1 Newborn 2
mother
1 weekThe oral-systemic connection
Physiologic function
Role in the local and systemic diseasesOlfactory Perception of Cysteine-S-Conjugates from
Fruits and Vegetables
CHRISTIAN STARKENMANN,* BENEDICTE LE CALV ´ E, YVAN NICLASS,
ISABELLE CAYEUX, SABINE BECCUCCI, AND MYRIAM TROCCAZ
Corporate R&D Division, Firmenich SA, P.O. Box 239, CH-1211 Geneva 8, Switzerland
odorless J Agric Food Chem. 2008 Oct 22;56(20):9575-80. Epub 2008 Sep 24
F. nucleatum
The mouth acts as a reactor, adding another
dimension to odor perception, and saliva
modulates flavors by trapping free thiols.
Saliva solublization FlavorsHuman microbiome
Buffalo School of Dental Medicine in Buffalo, New York.
The bacterial profile of the placental
microbiome is similar to the microbiome of the
tongue, tonsils, saliva, and subgingival plaque.
The thicker lines demonstrate this similarity
http://www.dimensionsofdentalhygiene.com/2015/01_january/Features/The_Human_Microbiome.aspxSuperficie Dorsale
Costituita dalla mucosa linguale
due parti, diverse sia per aspetto che per
origine embriologica: corpo e radice della
lingua (orale e faringea) Fondo cieco
Solco terminale
Collegata : ant. Frenulo
e post. Osso ioide
Meccano
Corpo 2/3 volume recettorimother Newborn 1 Newborn 2
Hypothesis
on oral microbiota connection
Saliva
Periodontal pathogens
weaningHypothesis on Innate functions of the periodontal pathogens Preferably, the reductase is an F420 dependent reductase. More preferably, the F420 dependent reductase is a member of the pyridoxamine 5 '-phosphate oxidases
Hypothesis on Innate functions of the periodontal pathogens
Ferula communis L.Alitosi
ALITOSI Odore sgradevole dell’aria emessa dal cavo orale rappresenta una grande limitazione nei rapporti interpersonali interessa circa il 50% della popolazione mondiale può essere il segnale di diverse patologie Classificazione: Transitoria Persistente Alitofobia
PubMed
120
halitosis
100
80 Periodontal
Pathogens Real-
n. lavori
time PCR
60
40 Anaerobic Bacteria
20
0
1965 1970 1975 1980 1985 1990 Anno 1995 2000 2005 2010 2015 2020
BANA test sulfite- Biofilms probiotic
(H2S) gas
Tongue VSC reductor tongue Cells
detectionCause di Alitosi
fumo e consumo di alimenti alitogeni
Alitosi periodi di digiuno prolungato
periodi di alterazioni ormonali (periodo mestruale, pubertà)
transitoria
periodi di particolare stress psico-fisico
assunzione di farmaci che causano xerostomia
Alitosi
patologie sistemiche:
persistente
gastriti, reflusso gastroesofageo
malattie epatiche
insufficienza renale cronica
diabete mellito
sinusiti, tonsilliti e infezioni orofaringee
neoplasie gastroesofagee e laringo-tracheo-polmonariOrigine:
Cavo orale (85-90%)
Extra orale (15-10%)
ALITOSI ORALE TERAPIA
ALITOSI NON ORALE INVIO AD ALTRI MEDICI
SPECIALISTIPatologie o condizioni che interessano
il cavo orale:
patina linguale
patologie delle ghiandole salivari (xerostomia)
lesioni cariose molto estese
protesi o restauri incongrui
scarsa o inappropriata igiene orale
malattia parodontale
lingua fissurata o a carta geografica
neoplasie orali e faringee
altre lesioni orali (ascessi, infezioni da Candida spp.)
PRESENZA DI BATTERI ANAEROBI IN GRADO DI
PRODURRE “COMPOSTI SOLFORATI VOLATILI”
(VSC), RESPONSABILI DEL DISTURBOBatteri responsabili dell’ alitosi
Porphyromonas gingivalis
Tannerella forsytensis
Treponema denticola
Prevotella intermedia
Helicobacter pylori a livello gastricoTongue microbial biofilm
Flavors Modulation
Oral Protection
Halitosis
Patient
Therapy
homeostasis
Periodontal
diseases
Pathogens reservoir
Transitory
septicemiasEndocarditis after Use of Tongue Scraper
Volume 13, Number 9–September 2007
Emerging Infectious Diseases
Letter
Andrew M. Redmond et al.
• A 59-year-old woman reported infective
endocarditis after a known history of mitral
valve prolapse.
• Two months previously she had begun
cleaning her tongue with a plastic tongue
scraper purchased at her local pharmacy.
• We propose that our patient's infective
endocarditis was most likely a consequence of
bacteremia from her use of a tongue scraper.Batteri responsabili dell’alitosi
Gram negativi,
anaerobi,
proteolitici
Principali localizzazioni:
Zone povere o prive di ossigeno
in cui tali batteri trovano le
condizioni ottimali per la loro
proliferazione
Cripte linguali OBL Tasche parodontaliBacteria in tongue biofilm
Gram -
Fusobacterium nucleatum
Porphyromonas gingivalis
Prevotella intermedia
Prevotella melaninogenica
Prevotella nigrescens
Prevotella pallens
Prevotella veroralis
Peptostreptococcus spp.
Tannerella forsythensis
Veillonella disparTongue Biofilm
Cellula epiteliale
Gram +
Biofilm
Gram -Fattori di patogenicità •Endotossine: LPS di membrana •Proteasi: aspecifiche •Enzimi: tipo-tripsina, sialidasi (neuroaminidasi). •Proteine leganti Fc (di membrana): inibiscono l’attivazione del complemento •Enzimi anti-Ig: Litici per Ig
Composti responsabili dell’alitosi
Acidi grassi (acido butirrico, isovalerico, propionico)
Composti amminici (cadaverina e putrescina)
Composti solforati volatili (solfuro di idrogeno e metilmercaptano)
Derivanti dalla degradazione, da parte dei batteri
alitogeni, dello zolfo contenuto negli aminoacidi
presenti:
nella saliva e nel fluido crevicolare
nei residui di cibo dopo i pasti
nel sangue presente in caso di lesioni gengivaliCOMPOSTI VOLATILI SOLFORATI (VSC)
Principali responsabili dell’alitosi
• Solfuro di idrogeno;
R-SH
• Metilmercaptano;
• Acidi grassi a catena alifatica (ac. butirrico, ac. valerico,
ac. isovalerico, ac. propionico)
Batteri Enzimi Putrefazione sostanze organiche VSCCOMPOSTI POLIAMINICI (PC),
DIAMINICI E INDOLICI
• Metilamina;
• Diamina;
• Putrescina;
• Cadaverina.Diagnosi di alitosi
Diagnosi clinica • Anamnesi
• Esame clinico del cavo orale
Diagnosi strumentale strumentale
Misura la concentrazione di VSC presente nell’alito del paziente
Non permette di stabilire se la causa è orale o extraorale
Diagnosi di laboratorio PCR real time
Identificazione e quantificazione dei patogeniIter diagnostico Percorso diagnostico • Anamnesi; • Esame clinico del cavo orale; • Prova organolettica; • Esame strumentale con Halimeter; • Esame microbiologico (BANA test); • Esame molecolare (PCR classica e PCR real-time).
OralChroma
(1) Hydrogen sulfide
(2) Methyl mercaptan
(3) Dimethyl sulfide
Colonna
cromatografica
•Aria prelevata con siringa, no contaminazioni
•No tarature tra un paziente e l’altro
•Durata colonna 2 anni.
SondaANAMNESI ESAME CLINICO istruzioni: NO fumo, alcool, caffè, cibi speziati, aglio, cipolle nelle 24 ore precedenti; NO collutori contenenti clorexidina o olii essenziali nei 7 giorni precedenti il test; nessuna cura antibiotica nei 7 giorni precedenti il test. •Aspirare l’aria all’interno del cavo orale con una siringa. •Inserire l’ago per poi iniettare un campione di 0.5 ml all’interno del gascromatografo
Esempio H2S = - 41,04% H2S = Ø CH3SH = - 48,12% CH3SH = - 96,51%
Negativi 55%
45%
Moderata 21% Grave 24%
77 pazienti24
13%
78
44%
34
19%
43
24%
Alitosi Assente Alitosi Preclinica
177 pazienti Alitosi Orale Alitosi Non Orale90 89
39 39
22 21 20
14 15
9
Alitosi Assente Alitosi Preclinica Alitosi Orale Alitosi Non Orale TOT
Uomini 39 22 14 15 90
Donne 39 21 20 9 89Alitosi in rapporto all’ età
50
TOT
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
6-14 anni 15-20 anni 21-30 anni 31-40 anni 41-50 anni 51-60 anni >60 anni
TOT 18 11 10 28 38 43 31Trattamento classico
a medio termine
Terapia meccanica Terapia antimicrobica
Non risolve per il 80% dei casi!Terapia dell’alitosi orale
evitare il consumo di alimenti alitogeni, alcolici e tabacco
bere spesso o utilizzare specifici sostituti salivari, in caso di xerostomia
trattamento di eventuali patologie o condizioni orali che favoriscono il disturbo
Scrupolosa igiene orale
Efficacia limitata nel tempo:
immediata ricolonizzazione
Utilizzo di antimicrobici
delle cripte linguali
(olii essenziali, clorexidina)
Batteri “buoni” in grado di ricolonizzare le cripte
Probiotici
linguali dopo terapia, impedendone la
ricolonizzazione da parte dei batteri alitogeni
Composti
Estratti vegetali in grado di modulare il
funzionali
microbiota.oral microbioma as a double-edged sword
Patient
homeostasis
Flavors Modulation
Oral cavity/Body Protection
Halitosis
Therapy
Periodontal diseases
Pathogens reservoir
Transitory
Systemic diseases septicemiasProbiotici Probiotici Lactobacillus reuteri • Competono con i patogeni per i siti di adesione Streptococcus salivarius • Producono sostanze antibatteriche
Principali Probiotici in studio presso OBL Cagliari L. reuteri DSM 17938 L. reuteri ATCC PTA 5289 S. salivarius ceppo K12
Meccanismo d’azione
Tolleranza orale
macrofago
A. actinomicetemcomitans
Richiamo di commensali
TLR4
Quorum sensing
N
Porphyromonas gingivalis
Immunomodulanti
batteriocine
Probiotico
s
S. intermedius
Cross talk Walker et al., 2008, CID
adesione
TLR
Tongue cellsL. rhamnosus Supplementing 1-6 year old
children with L. rhamnosus for 7 months
significantly reduced the risk of dental caries.
L. salivarius & L. fermentum Both strains
showed antagonistic activity on the growth of
S. mutans and Streptococcus pneumonia. L.
salivarius was able to survive an environment
of low pH as that produced by a high number
of S. mutans
L. rhamnosus & Lactobacillus bulgaricus
Inhibitory effects against P. gingivalis,
Fusobacterium nucleatum & streptococcal spp
L. fermentum L. fermentum was found in the
saliva of healthy children. This strain
significantly inhibited the formation of the
insoluble glucan produced by S. mutans. It did
not affect the multiplication of this pathogenic
strain, but it completely inhibited the
adherence onto cuvette walls
Haukioja 2010 Eur. J. DentProbiotico Reports di
effetti avversi
Bifidobacterium 15
setticemia, ascessi, peritonite
Lactobacillus rhamnosus 13
endocardite, ascessi, peritonite
Lactobacillus casei 8
endocardite, ascessi
Lactobacillus plantarum 8
endocardite
Lactobacillus johnsonii 0
Lactobacillus probiotici 0
Streptococcus K12*
Saccharomyces boulardii 13
fungimiaAnamnesi
pazienti: 6 Esame cavità orale
Oral Chroma
5 affetti da alitosi
orale Meccanica
1 affetto da
glossite Terapia Colluttorio
Età media: 11 anni Probiotico
L. reuteri 3 mesiH2S = - 96,62% Valori risultano
CH3SH invariato azzerati dopo un
mese di terapia
30 60 120
giorniI caso
Caso II
H2S = - 41,04% H2S = Ø
CH3SH = - 48,12% CH3SH = - 96,51%
30 60 120
giorniCase report
Candidosi MDR
Basale 30 giorni
S. salivarius K12Oral microbiome is very complex and when disturbed lead to oral and systemic pathologies . The “microbiome analysis approach” suggest a modulating treatment ,. i.e for long term therapy. Probiotics could be useful for reconstruct a physiological oral microbiota .
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