Espressione della proteina NMP22 e della ploidia del DNA nel carcinoma della vescica
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Espressione della proteina NMP22 e
della ploidia del DNA nel carcinoma della vescica
F. FERRARA', L. CASTIGLIA', R COLOMB02, G. BANFP, P.A. BONINI'
lServizio Integrato di Medicina di Laboratorio, IRCCS H S.Raffaele, Milano
2Dipartimento di Vrologia, IRCCS H S.Raffaele, Milano
3Direzione Sanitaria Clinica S.Maria HSR, Castellanza (VA)
RIASSUNTO and NMP22 content in urine samples to define new ap-
proaches to bladder cancer. Subjects entering the study
L'indagine cistoscopica e l'esame citologico del sedi-
were divided as following: Group 1, including 30 healthy
mento urinario rappresentano i due metodi attualmente in
volunteers, Group 2, including 30 patients with benign uri-
uso negli schemi di monitoraggio della malattia neoplasti-
nary conditions and Group 3, including 30 patients with
ca della vescica. La cistoscopia è una procedura diagno-
transitional cells carcinoma. DNA f10w cytometry and cyto-
stica estremamente invasiva, mentre l'esame del prepara-
logical examination were performed on urine sample col-
to citologico mostra i suoi limiti nella necessità di disporre
di esaminatori molto esperti, nella scarsa sensibilità e nel- lected in 3 consecutive days and fixed in ethanol50% . At
/'impossibilità di fornire risultati quantitativi. Inoltre la cito- the third day, an additional urine sample for NMP22 was
logia del sedimento urinario è caratterizzata da un'ampia collected. Flow cytometry was performed using Kinesis-
variabilità tra diversi operatori al momento dell'osservazio- CK (BioRad, Segrate, Italy) for simoultaneous detection of
ne al microscopio ottico. In questo studio vengono con- DNA and Cytocheratines. NMP22 detection was perfor-
frontati i dati ottenuti dall'esame citologico convenzionale, med using the NMP22 immunoassay (Matritech, Newton,
dall'analisi citofluorimetrica del DNA cellulare e dall'e- MA). NMP22 assay and double fluorescence DNA-Cyto-
spressione della proteina NMP22 in campioni di urine rac- keratines by flow cytometry are helpful in detection and
colti da 90 soggetti suddivisi in tre gruppi: Gruppo 1, costi- surveillance of bladder carcinoma, a clinical condition
tuito da 30 soggetti sani, Gruppo 2, costituito da 30 sog- wich show at their best the sensitivity limits of traditional
getti affetti da patologie benigne della vescica (calcolosi, cytology.
cistite cronica), Gruppo 3, costituito da 30 soggetti con KEY WORDS: flow cytometry, nuclear matrix proteins, bladder
diagnosi pregressa di carcinoma a cellule transizionali tumor
della vescica. L'assenza di falsi positivi nei soggetti con
patologie benigne e di falsi negativi nei pazienti con dia- INTRODUZIONE
gnosi di carcinoma della vescica suggeriscono che il do-
saggio di NMP 22 può essere utilizzato vantaggiosamen- Le neoplasie vescicali sono caratterizzate da un inci-
te nel monitoraggio della malattia unitamente alla ploidia denza che le pone al quarto posto fra i tumori che colpi-
del DNA determinata su campioni di urine in citometria a scono gli individui di sesso maschile, per i quali
flusso. rappresenta la settima causa di morte a livello mondiale.
Nel 1998 sono stati diagnosticati negli Stati Uniti 54.400
PAROLE CHIAVE: citrometria a flusso, proteine della matrice nu- nuovi casi di neoplasia vescicale (39.500 uomini e 14.900
cleare, tumore della vescica donne) e sono stati segnalati 15.500 decessi in soggetti
con pregressa diagnosi (8.400 uomini e 4.100 donne) (1).
SUMMARY Il tumore della vescica colpisce più frequentemente i
soggetti di età compresa tra i 50-70 anni con un inciden-
NMP22 PROTEIN ANO DNA PLOIDY za tripla nel sesso maschile rispetto a quello femminile. Il
EXPRESSION IN BLADDER CARCINOMA carcinoma a cellule transizionali rappresenta l'istotipo più
Cystoscopy and urine cytology are effective methods frequente (90%), mentre l'adenocarcinoma è più raro (1).
for surveiflance of urothelial cancer. The former is an inva- Dal punto di vista della stadiazione le diverse tipologie
sive technique, whereas the latter show drawbacks such di neoplasia vescicale si manifestano nella maggioranza
as training required for screener to perform evaluation, in- dei casi come malattia superficiale (carcinoma "in situ") e
sufficient sensitivity and impossibility of quantification. Ad- in questo caso la probabilità di recidiva locale varia dal
ditional/y, voided urine cytology is affected by wide impre- 50% al 75% (2).
cision related to variability of microscopical evaluation. We Dal punto di vista epidemiologico attualmente non sono
. compared results from urine cytology, DNA flow cytometry state identificate predisposizioni genetiche o familiari. Per
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contro diversi agenti esplicano un'azione carcinogenica gia.
locale a livello della parete vescicale. La presenza di eritrociti nelle urine può essere visibile
Numerosi agenti chimici sono stati rilevati nelle urine di già al semplice esame ispettivo, ma nella maggioranza dei
pazienti che hanno sviluppato un carcinoma vescicale. Di casi può essere evidente solo esaminando il sedimento
alcune di essi è stata ben provata e di altri fortemente so- urinario al microscopio ottico. In ogni caso non esiste cor-
spettata la carcinogenità. relazione tra il grado di ematuria e lo stadio del tumore.
È stato chiaramente dimostrato che l'esposizione lavo- Deve essere inoltre sottolineato che l'ematuria non indica
rativa a betanaftilamina, 4-aminobifenil, 4-nitrobifenil e a necessariamente la presenza di neoplasia in quanto il ri-
4-4diaminobifenil è carcinogenica (3). Tali composti sono scontro di emazie nelle urine può essere dovuto a condi-
intermedi della sintesi di un ampio spettro di azocoloranti zioni infiammatorie croniche, calcoli ed altre situazioni che
e di pigmenti usati nell'industria tessile, della stampa, del- possono determinare microtraumatismi ed emorragie nel
la plastica, della gomma e di cavi. Il cancro vescicale in- tratto urinario.
sorge tra i lavoratori dopo una esposizione media di circa In generale la presenza di pochi globuli rossi in un
23 anni ed ha una incidenza 50 volte superiore rispetto ai campione di urina (generalmente inferiore a 3 o 5 elemen-
soggetti non esposti. Il denominatore comune tra tali ti per campo) può essere considerato un reperto occasio-
agenti sembra essere l'escrezione e la concentrazione di naie in molti individui. Per tale motivo è stato suggerito
metaboliti ortoidrossilati legati a solfati o ad acido glucoro- che solo nei pazienti nei quali è stata rilevata la presenza
nico. Il pH delle urine è più vicino all'ottimale per la beta- di un numero superiore a 3 o 5 emazie per campo in al-
glucoronidasi di quanto non lo sia il pH dei tessuti o del meno due analisi del sedimento, può essere presa in con-
sangue: di conseguenza i glucoronidi sono scissi nelle uri- siderazione la possibilità di cancro della vescica. La
ne esponendo l'epitelio vescicale a livelli più alti del carci- comparsa di macroematuria o microematuria persistente
nogeno attivo rispetto a un qualsiasi altro tessuto dovrebbe indurre comunque una valutazione dell'intero
dell'organismo. Ciò può spiegare l'effetto carcinogenetico tratto urinario, che dovrebbe includere l'indagine ecografi-
di tali sostanze chimiche, limitato alla vescica (4). Esisto- ca, l'analisi di preparati citologici ottenuti da campioni di
no inoltre potenziali carcinogeni che comprendono additivi urine per la ricerca di cellule tumorali maligne ed infine l'e-
dietetici, come i nitrati e i nitriti e i dolcificanti artificiali same cistoscopico (12).
(saccarina, ciclamati) , le infezioni schistosomiasiche, il L'esame citologico delle urine viene effettuato tramite
fumo della sigarette, l'alcolismo e i virus (5). Bryan e Ertuk l'analisi al microscopio ottico delle cellule uroteliali di sfal-
riportarono la comparsa di cancri vescicali in giovani fem- damento eventualmente presenti nell'urina. Esso trova il
mine di topo Swiss dopo l'inserimento nella vescica di pil- suo limite principale nella scarsa sensibilità specie per
lole costituite da colesterolo (come veicolo) e ciclamato. In quanto riguarda i carcinomi vescicali di basso grado (13),
seguito, in esperimenti dietetici, fu osservata una inciden- che per loro specifica caratteristica tendono a esfoliare un
za lievemente maggiori di carcinomi alla vescica nei ratti numero di cellule insufficiente per una corretta valutazione
nutriti con grandi quantità di dolcificanti artificiali per un del preparato.
periodo di oltre due anni (6). Tuttavia, l'assunzione dieteti- La cistoscopia è considerata il metodo diagnostico
ca da parte di tali ratti era enorme se confrontata con gli standard per sensibilità e per specificità. L'esame cisto-
usuali consumi umani e numerose ricerche cliniche non scopico consiste nell'inserire un tubo di fibre ottiche attra-
sono riuscite a dimostrare differenze di incidenza del can- verso l'uretra fino ad arrivare alla vescica dove è possibile
cro vescicale tra le persone che fanno uso di dolcificanti osservare la superficie mucosa ed effettuare prelievi biop-
artificiali e i controlli (7-8). tici su aree sospette per individuare l'eventuale presenza
Abbiamo già accennato alla aumentata incidenza di di neoplasia; questa tecnica è certamente molto accurata
carcinoma vescicale nei pazienti con infezioni da Schisto- (circa il 90 % delle neoplasie può essere diagnosticato in
soma haematobium. Non è certo se il parassita elabori un questo modo) ma è costosa e invasiva, creando notevoli
agente carcinogeno nelle urine o se invece causi infiam- disagi a chi vi si sottopone (13).
mazione locale, irritazione e successive lesioni riparative, In tempi recenti diversi studi hanno sollevato notevole
iperplastiche ed eventualmente neoplastiche, della muco- interesse circa la possibilità di disporre di opportuni mar-
sa vescicale. Comunque sia, il carcinoma da schistosoma catori di neoplasia vescicale dosabili in campioni di urina
ha una distribuzione a livello della mucosa vescicale ab- (14, 15). L'interesse nell'uso di tali marcatori è nato dalla
bastanza differente rispetto a quanto si osserva nelle neo- necessità di disporre di uno strumento diagnostico in gra-
plasie da esposizione lavorativa o nelle forme spontanee, do di sostituire l'esame citologico convenzionale caratte-
facendo pensare ad un effetto locale (9). rizzato da una scarsa sensibilità verso le forme di
Studi epidemiologici retrospettivi sottolineano che tra i neoplasia della vescica di basso grado.
fumatori di sigarette il rischio di cancro vescicale può es- Un marcato re che recentemente ha suscitato interesse
sere 5-7 volte aumentato rispetto ai non fumatori (10). è il BTA (Bladder Tumor Antigen); gli anticorpi monoclona-
Vari studi prospettici hanno confermato tale associazione, li usati per la ricerca del BTA sono diretti verso una pro-
tuttavia il tentativo di indurre neoplasie negli animali da teina correlata al fattore H del complemento umano
esperimento ha portato a risultati discordanti. (human Complement Factor H-related protein, hCFHrp)
Il più comune segno dell'eventuale presenza di una simile per composizione, struttura e funzione al fattore H
neoplasia vescicale è l'ematuria (11), presente nell'B5% stesso (human Complement Factor H, hCFH) (16). Si è di-
dei pazienti ; accanto ad essa vi sono altri segni indicativi mostrato che la hCFHrp è sintetizzata da diverse linee
quali pollachiuria e disuria che compaiono in un terzo dei cellulari di tumore della vescica in coltura cellulare, ma
pazienti e si aggravano negli stadi avanzati della patolo- non dalle linee cellulari epiteliali normali (17).
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hCFH e hCFHrp giocano un ruolo inibitorio fondamen- sandosi sulla presenza e la localizzazione di sottopopola-
tale nel controllo della via alternativa del complemento, zioni nell'istogramma del DNA. Lo stato di ploidia del DNA
processo che permette la lisi delle cellule riconosciute è correlato con il grado e lo stadio del tumore; con poche
come estranee all'organismo; per interazione con il fattore eccezioni, tumori vescicali di grado 1 mostrano un Indice
del complemento C3b, hCFH e hCFHrp inducono l'inibi- di DNA diploide, mentre la maggior parte delle neoplasie
zione della sintesi di un complesso di attacco alla mem- di grado 3 hanno DNA aneuploide (23). L'applicazione
brana, prevenendo la lisi cellulare (18). elettiva di questa metodica è quella relativa al monitorag-
Studi in vitro hanno dimostrato che la sintesi di hCFHrp gio dei pazienti con neoplasia di basso grado o superficia-
e hCFH può conferire un vantaggio selettivo per la cresci- le dove è in grado di fornire informazioni quantitative
ta alle cellule tumorali in vivo permettendo ad esse di visualizzabili graficamente e facilmente confrontabili nell'-
sfuggire al sistema immunitario dell'organismo. ambito di analisi sequenziali. È inoltre utile integrare gli
Studi recenti hanno suggerito un possibile ruolo di mar- schemi previsti per il monitoraggio con l'analisi in citome-
catore neoplastico per i prodotti di degradazione della fi- tria a flusso in quanto quest'ultima consente di risparmiare
brina o del fibrinogeno. Il loro dosaggio nelle urine con al paziente alcune delle periodiche valutazioni cistoscopi-
metodi immunochimici può essere utile per indicare la pre- che normalmente previste sostituendole con una metodi-
senza di carcinoma della vescica (19). La sensibilità di ca non invasiva e certamente meno costosa sia in termini
questo test nello scoprire malattie ad un basso stadio (Ta, di rischio che in termini economici. Inoltre la citofluorime-
T1) è del 62%, mentre in relazione alla gradazione citolo- tria permette di valutare non solo l'evoluzione della malat-
gica, neoplasie di basso grado (G1 o G2 su una scala che tia nel tempo, ma anche di monitorare l'efficacia della
va da G1 a G4, dove G4 corrisponde a cellule scarsa- chemioterapia sfruttando le proprietà chimiche di alcuni
mente differenziate) è tra il 61 % e il 64%. Benchè il do- chemioterapici che, dopo essersi intercalati al DNA, sono
saggio della fibrina e del fibrinogeno sia considerato più in grado di emettere un segnale fluorescente se stimolati
sensibile dell'esame citologico delle urine, esso riesce a da una sorgente di luce con lunghezza d'onda opportuna
diagnosticare 1/3 dei casi di carcinoma in situ e circa il (24,25).
15% dei casi di malattia di alto grado.
Recentemente studi sperimentali hanno evidenziato un MATERIALI E METODI
possibile nuovo marcatore per le neoplasie vescicali. (20). Sono stati selezionati tre gruppi di soggetti suddivisi in
Si tratta di NMP22, una proteina della matrice nucleare base ai seguenti criteri:
appartenente ai costituenti proteici del fuso mitotico rico- 1° gruppo costituito da trenta soggetti sani( età media
nosciuta da due anticorpi monoclonali, Mab 303-22 e Mab 49,2 anni) con anamnesi negativa per patologie benigne e
302-18. NMP22 si può trovare sia nelle cellule normali maligne della vescica;
che in quelle tumorali; la cellula tumorale mostra una più 2° gruppo costituito da trenta soggetti con patologie be-
alta concentrazione di NMP22 rispetto alla cellula norma- nigne della vescica (cistiti croniche, urolitiasi) (età media
le, in relazione al più elevato indice di proliferazione che 52,7 anni);
caratterizza le popolazioni cellulari neoplastiche. A segui- 3° gruppo costituito da trenta soggetti con recente dia-
to della morte delle cellule tumorali la proteina NMP22 vie- gnosi di carcinoma delle cellule transizionali o recidiva
ne rilasciata in circolo ed è dosabile nelle urine (20-21). dello stesso (età media 56,3anni).
Recentemente anche l'analisi citofluorimetrica della La classificazione dei tumori segue le norme stabilite
ploidia del DNA è stata impiegata nella diagnosi e nel mo- dall' American Jiont Committee on Cancer (24) (Tab. 1).
nitoraggio delle neoplasie della vescica. Le applicazioni I volontari sani sono stati reclutati tra operatori di labo-
cliniche della citometria a flusso nel settore della citologia ratorio in base all'assenza di qualsiasi sintomo riguardan-
riguardano l'analisi delle secrezioni bronchiali, del liquor e te l'apparato urinario e alla negatività delle analisi dei
di materiale prelevato dalla cervice uterina (22) e dalla ve- sedimenti urinari.
scica. La selezione dei pazienti è awenuta sulla base della
L'impatto clinico più importante è stato riscontrato nel- positività al carcinoma delle cellule transizionali conferma-
l'analisi di campioni di lavaggio vescicale o di urine da ta dall'esame istopatologico, nei quindici mesi prima della
minzione estemporanea: in particolare la citofluorimetria si arruolamento; campioni presentanti patologia diversa dal
è rilevata decisiva non solo nella diagnosi di carcinoma carcinoma vescicale sono stati esclusi.
della vescica su materiale non bioptico, ma soprattutto nel Campioni di pazienti che si sono sottoposti ad un'anali-
monitoraggio del paziente trattato con chirurgia di tipo si invasiva quale l'esame cistoscopico, sono stati raccolti
conservativo.
La citometria a flusso oltre a consentire l'analisi della Tabella 1
ploidia del DNA, permette di effettuare valutazioni bipara- Distribuzione dei pazienti con neoplasia della vescica nei di-
metriche DNA/citocheratina. Il ricorso alla doppia marcatu- versi stadi
ra DNA-citocheratina ha permesso di ridurre
drasticamente l'interferenza legata alla presenza di popo- Stadio Pazienti (%)
lazioni cellulari di origine infiammatoria spesso presenti in
TI 46,5
campioni ottenuti da pazienti con lesioni neoplastiche ul-
T2 23,5
cerate oppure da soggetti in corso di profilassi chemiote-
T3 IO
rapica con BCG o Mitomicina C (23).
T4 20
La citofluorimetria riesce a distinguere le neoplasie ve-
Totale 100
scicali con DNA diploide da quelle DNA aneuploide, ba-
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a distanza di almeno dieci giorni. Dopo il lavaggio, i complessi antigene-anticorpo che si
L'analisi citofluorimetrica del DNA e l'esame citologico sono formati reagiscono con un secondo anticorpo marca-
sono stati effettuati con sei campioni diversi di urina (tre to con dioxigenina (DIG) specifico per l'NMP22. Dopo un
campioni per l'esame citofluorimetrico e tre 'per l'esame ci- ulteriore lavaggio, la dioxigenina legata all'anticorpo è ul-
tologico) raccolti alla stessa ora in tre giorni consecutivi e teriormente marcata attraverso l'utilizzo di un anticorpo
fissati con etanolo 50%. Nel terzo giorno di raccolta dei anti-dioxigenina di pecora legato con l'enzima perossida-
campioni è stato aggiunto un campione di urine per il do- si.
saggio di NMP22. La concentrazione dell'antigene presente nell'urina è
proporzionale all'intensità della colorazione sviluppatasi
Analisi citofluorimetrica nel pozzetto, e viene valutata con l'impiego di un lettore di
L'analisi citofluorimetrica del DNA è stata effettuata uti- micropiastre (ETI System Fast Reader, Sorin, Saluggia,
lizzando un citofluorimetro Epics XL-MCL (Coulter, Mia- Italia) valutando l'assorbanza ad una lunghezza d'onda di
mi, Florida) fornito di laser ad argon. I campioni vengono 490 nm. La curva standard è determinata utilizzando in
centrifugati per dieci minuti a 3000 giri/minuto. Il pellet vie- doppio i calibratori forniti dalla ditta. L'intervallo dei valori
ne risospeso in 10 mL di soluzione tampone PBS (Pho- dei calibratori e compreso tra O UI/mL e 120 UI/mL. Il
sphatase Buffered Saline solution) pH 7,4. I campioni così campione viene considerato positivo, quando il risultato
ottenuti subiscono due lavaggi tramite centrifugazione a ottenuto è maggiore di 10 UI/mL.
2000 giri/minuto per dieci minuti ed il pellet finale viene ri-
sospeso in 2 mL di PBS pH 7,4. Successivamente, 100 RISULTATI
fiL della sospensione finale vengono aggiunti alle provette Poiché i dati riguardanti l'NMP22 raccolti durante lo
del kit Kinesis CK (Biorad, Segrate, Italia), per consentire studio non hanno distribuzione normale, riporteremo di se-
simultaneamente la colorazione DNA-Citocheratine; lo io- guito le medie e l'intervallo di confidenza, nei tre diversi
duro di propidio è un fluorocromo che intercalandosi al gruppi studiati.
DNA, emette un segnale fluorescente nel rosso, mentre Il dosaggio dell'NMP22 nei volontari sani (gruppo 1) ha
l'anticorpo monoclonale anticitocheratina coniugato con mostrato un valore medio di 3,3 UI/ml (intervallo di confi-
fluoresceina isotiocianato (FITC) permette di distinguere denza al 95% compreso tra 2,8 UI/mL e 4,1 UI/mL) e cioè
le cellule epiteliali dalle altre componenti cellulari even- sensibilmente inferiore al valore di cut off suggerito che è
tualmente presenti nel campione di urine, grazie alla emis- pari a 10 UI/mL. L'analisi citofluorimetrica del DNA cellula-
sione di una specifica fluorescenza verde. re nei volontari sani ha mostrato in tutti i casi un Indice di
L'analisi del DNA è stata effettuata sulla popolazione DNA diploide mentre l'esame citologico è risultato negati-
positiva alle citocheratine, acquisendo non meno di vo per cellule tu morali in tutti e trenta i soggetti.
10.000 eventi (Figg. 1, 2) . Il valore medio osservato di NMP22 in soggetti con
condizioni benigne del tratto urinario (gruppo 2) è stato di
Dosaggio di NMP22 6,0 UI/mL (intervallo di confidenza al 95% compreso tra
L'espressione di NMP22 è stata valutata utilizzando il 4,2 UI/mL e 9,3 UI/mL). Non si sono osservati falsi positivi
kit NMP22 Matritech (Matritech, Newton, MA). Si tratta di in nessun caso. In tutti i casi l'Indice del DNA determinato
un dosaggio immunoenzimatico eseguibile su micropia- con la cito metri a a flusso, è risultato diploide. L'esame ci-
stra da 96 pozzetti. Calibratori, controlli e campioni di uri- tologico delle urine è risultato negativo in 25 soggetti
na reagiscono con un anticorpo specifico per NMP22 (83%), mentre nei restanti cinque soggetti (17%) l'esame
adsorbito sulle pareti di ogni pozzetto della micropiastra. è risultato inconclusivo.
Nei pazienti con neoplasia della vescica (gruppo 3), il
valore medio osservato di NMP22 è stato di 38,7 UI/mL
90 0 0
Z0002347 . H03 FL3
CELL CVCLE (intervallo di confidenza al 95% compreso tra 11,3 UI/mL
SO
DATA e 105,7 UI/mL). Tutti i valori osservati di NMP22 sono ri-
BaDO
7 0 00
f'1~ Me an Gl =10 1 . 2
sultati superiori a 10 UI/mL. L'esame citofluorimetrico ha
mostrato un DNA aneuploide in 23 soggetti (77%). In 7
cv G1 = 4 ,'
l-< i,1 casi (23%) l'Indice di DNA è risultato diploide ed in questi
V 6 000 y. Gl = 84 .3
~I
.o soggetti le lesioni neoplastiche erano citologicamente ben
8;j 500 0
Mean G2=207. 9 differenziate (G 1) . L'esame citologico urinario è risultato
:1 negativo per presenza di neoplasia in 10 casi (33%), e
Z 4000 CU GZ 5,2
...... % G2 = 3,' non conclusivo in 7 casi (23%) (grado G1). Nei restanti 13
V
I,)
3000
20 00
Il x S = 12 .3
casi (43%) l'esame citologico ha dato esito positivo. I dati
riguardanti il grado tumorale sono raccolti riportati in Ta-
1\ bella 2. Le relazioni tra dati citofluorimetrici e dosaggio di
G2/Gl =2. 054
1 000 I· NMP22 sono riportati in Tabella 3
o .JI t"-. G~
....,.
o 6 4 32 0 384 448 5 12
128
DN A
192 256
Cont e nt
Ch i Sq .= 4 3. 7 DISCUSSIONE
La cistoscopia è sicuramente una tecnica di elevata
Figurai sensibilità nell'individuare la malattia, ma trova il suo limite
Esempio di istogramma relativo all'analisi della ploidia del principale nell'essere un procedimento invasiva e costosa,
DNA in citometria aflusso dunque difficilmente proponibile se non in soggetti ad ele-
LlGAND ASSAY VOL. 4 NUMERO 1 ANNO 1999
Il
Tabella 2 vato rischio di neoplasia vescicale. Non va inoltre sottova-
Distribuzione dei pazienti con neoplasia della vescica in base lutata la possibilità che le lesioni neoplastiche non villose
al grado di differenziazione cellulare ("flat cancer"), possano in ogni caso sfuggire anche all'e-
Grado Numero pazienti Pazienti (%) same cistoscopico.
Diversi studi condotti sull'analisi del contenuto di DNA
Gl 9 30,0
delle cellule neoplastiche della vescica (24) hanno posto
G2 lO 33,3
in evidenza che tumori scarsamente differenziati (grado
G3 II 36,7
III) presentano un bassissimo numero di cellule con conte-
Totale 30 100,0
nuto diploide di DNA, essendo in maggioranza costituiti
Tabella 3
Relazioni tra grado di differenziazione, ploidia del DNA e esame citologico nei pazienti con carcinoma della vescica
Citometria a flusso
Esame Grado I (n= 9) Grado 2 (n= lO) Grado 3 (n= II)
citologico Inconc1usivo Diploide Aneuploide Dipoide Aneuploide Aneuploide
Inconclusivo 4 2
Benigno 3 2 5
Maligno 3 lO
H.S.R Milano Lab.Analisi Set.Immunochimica 71ul97 17 :05 :04
caUL TERCRl EPIC SC R) Acquisi linn Flow C YIOIl1C(!"y Rc pol1 DNA
OP ID : FUL VIO
158 second s. 8 11 ) 2 c:venLS
Cylosc:uings rrom prolocol DNA M anual Stop
1: 2: J: A 1:
~,r-----------------' ~ r---'r------------'
E
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SS LOG Propi dio Pro p id lo Pr o pld i o
5: 6: F
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CITO F i te
Figura 2
Istogrammi e citogrammi relativi all'analisi citofluorimetrica in doppia fluorescenza DNA-Citocheratine di un campione di urine
ottenuto da un paziente con diagnosi di carcinoma della vescica non trattato. (1) In base alle caratteristiche di diffusione e di rifra-
zione della luce incidente viene selezionata la popolazione di interesse comprendente solo strutture cellulari integre, epiteliali e
non. (2) Viene attivato il sistema di discriminazione dei doppietti, che consente di analizzare il segnale fluorescente dello Ioduro di
Propidio proveniente da cellule isolate e non da quelle eventualmente aggreggate. (3A) Istogramma relativo al DNA di tutte le cel-
lule non aggregate presenti nel campione: si evidenzia la presenza di una popolazione cellulare con contenuto aneuploide (*) di
DNA. (4) Si verifica la coespressione della fluorescenza relativa al DNA (in ascissa) e di quella relativa alle Citocheratine (in
ascissa) e di quella relativa alle Citocheratine (in ordinata), come conferma della integrità delle cellule da analizzare separatamen-
te. (5) Si seleziona la popolazione positiva alle Citocheratine il cui picco è localizzato in seconda decade logaritmica. con presenza
di un picco di fluorescenza in seconda decade logaritmica. (6F) Istogramma relativo al contenuto di DNA cellulare dell sola popo-
lazione positiva per le Citocheratine: la popolazione con DNA aneuploide (*) risulta essere la componente preponderante fra le
cellule di sicura origine epiteliale .
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da cellule di tipo aneuploide, mentre le neoplasie più diffe- duare soggetti sani (con valori di NMP22 4,1 Ul/mL) e pa-
renziate mostrano un contenuto di DNA diploide. In tal zienti con patologie benigne della vescica (con valori di
senso il riscontro di cellule epiteliali diploidi in un campio- NMP22 compresi tra i 4,2 UI/mL e i 9,3 UI/mL). Tali ipotesi
ne di urina non può essere considerato in alcun modo dovranno essere owiamente suffragate da studi mirati su
esclusivo di neoplasia della vescica. Di conseguenza l'im- casistiche molto ampie, allo scopo di valutare le reali pos-
piego della citometria a flusso ripropone in un certo senso sibilità di impiego estensivo e l'eventualità di aggiungere il
il problema già precedentemente esposto tra i limiti intrin- dosaggio di NMP 22 in quei protocolli di diagnosi e moni-
seci dell'esame citologico tradizionale. Anche alla luce dei toraggio della malattia che già comprendono la citometria
dati in nostro possesso la citometria a flusso difficilmente a flusso del DNA.
può essere utilizzata come indagine di screening, mentre
il suo impiego nel monitoraggio della malattia potrebbe BIBLIOGRAFIA
comportare notevoli vantaggi: ci sembra opportuno infatti
sottolineare che la citometria a flusso è in grado di indivi- 1. Landis SH, Murray T, Bolden S, et al. Cancer
duare anche un esiguo numero di cellule neoplastiche statistics. J Clin Cancer 1998; 48: 6-29.
grazie alla sua capacità di valutare migliaia di cellule in 2. Heney NM, Ahmed S, Flanagan MJ, et al. Superfici al
pochi secondi, riducendo in tal modo il numero dei cam- bladder cancer: progression and recurrence. J Urol 1983 ;
pioni che per la citologia convenzionale risultano non ade- 130: 1083-108.
guati e quindi inconclusivi dal punto di vista diagnostico
(25). Inoltre l'impiego di una marcatura specifica per le ci- 3. Oyasu R, Hopp ML. The etiology of bladder cancer.
tocheratine permette di eliminare il "rumore di fondo" lega- Surg Gynecol. Obstet 1974; 38; 97-101.
to alla componente infiammatoria eventualmente presente 4. Friedell G H. The pathogenesis of bladder cancer. Am J
e che crea spesso notevoli problemi di lettura del prepara- PathoI1977; 89: 431-6.
to citologico. Questo aspetto, unitamente alla non invasivi-
tà dell'indagine, rappresenta sicuramente il punto di forza 5. Bryan GT, Erturk E. Production of mouse urinary
dell'analisi citofluorimetrica del DNA cellulare su campioni b1adder carcinomas by sodium cyclamate. Science 1970;
di urina, metodo che consente il riscontro di neoplasie del- 167: 996-1001.
la vescica mediamente o scarsamente differenziate molto 6. Richardson HL, Abdon LI, Lou TJ, et al. Urinary
più precocemente di quanto non sia in grado di fare la ci- b1adder carcinoma and other patho1ogical alterations in
tologia convenzionale (26). rats fed cyclamates. Proc Am Assoc Cancer Res, 1972;
Fra i procedimenti non invasivi il test per il dosaggio del 13 : 2.
STA è sicuramente stato uno dei primi strumenti alternati-
vi alle metodiche tradizionali. Tuttavia è stato ormai stabili- 7. Kessler II, Clark JP. Saccharin, cyclamate and human
to che il risultato del dosaggio qualitativo del STA deve bladder cancer; no evidence of an association. JAMA
essere preso in considerazione solo congiuntamente alle 1978; 240: 349-53 .
informazioni derivanti dalla valutazione clinica del pazien- 8. Morgan RW, Meera GJ. Bladder cancer, smoking,
te e da altre procedure diagnostiche quali l'esame citologi- beverages and arti fici al sweetener. Can Med Assoc J
co e la cistoscopia. Sono stati osservati infatti livelli elevati 1974; III: 1067-71.
di questo marcatore anche in soggetti affetti da calcolosi
renale, nefrite, cistite cronica o che hanno subito traumi 9. Khafagy MM, Khafagy MM, CadwelI WL, Esposti
recenti della vescica o delle vie urinarie (20). Di conse- PL, et al. Carcinoma of the bilharzial urinary bladder; a
guenza anche in questo caso l'efficacia del test ha limiti study of the associated mucosal lesions in 80 cases.
precisi nella possibilità di false positività che possono atti- Cancer 1972; 30: 150-7.
vare indagini di secondo livello (cistoscopia) che si posso-
10. Cole P et al. Smoking and cancer of the lower urinary
no poi rivelare inutili. tract. New Eng J Med. 1971; 284: 129-32.
L'utilizzo delle classiche tecniche per la determinazione
del carcinoma a cellule transizionali della vescica, quali la 11. Varkarakis MJ, Gaeta J, Moore RH. Superfici al
cistoscopia e l'esame citologico delle urine, possono inve- bladder tumor: Aspects of clinical progression. Urology
ce essere validamente integrate non solo dall'analisi cito- 1974; 4: 414-20.
fluorimetrica del DNA ma anche dal dosaggio di NMP22. I
12. Thrasher J, Crawford E. Current management of
dati in nostro possesso indicano infatti che la quantifica-
invasive metastatic transitional celI carcinoma of the
zione di NMP22 urinario non risente di concomitanti pato-
bladder. J Uro11993; 149: 957-72.
logie infiammatorie della vescica. L'assenza di falsa
positività osservata nella nostra casistica lascia intravede- 13. Badalament RA, Hermanens DK, Kimmel M et al..
re la possibilità di definire un itinerario diagnostico a no- The sensitivity of bladder wash flow cytometry, bladder
stro parere interessante. wash cytology and voiled cytology in the detection of
Nel caso di pazienti con un livello di NMP22 inferiore ai bladdercarcinoma. Cancer 1987; 60: 1423-7.
10 UI/mL e con Indice di DNA diploide, il rischio di neopla-
14. Sarosdy MF, deVere White RW, Soloway MS. ResuIts
sia vescicale è basso, tanto da escludere la necessità di
of a muIticenter trial using the BTA test to monitor for
effettuare la cistoscopia. Il dosaggio di NMP22 permette di
and diagnose recurrent bladder cancer. J Urol 1995; 154:
discriminare con sicurezza tra soggetti con elevato rischio
379-83.
di neoplasia vescicale (NMP22 10 UI/mL) e soggetti sani
(NMP22 10 UI/mL), offrendo inoltre la possibilità di indivi- 15. Huland E, Huland H, Meier T. Comparison of 15
L1GAND ASSAY VOL. 4 NUMERO 1 ANNO 1999
11------------,
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Per corrispondenza:
Dott. Fulvio Ferrara
Servizio Integrato di Medicina di Laboratorio,
IRCCS H S. Raffaele
Via Olgetlina, 60
20132 Milano
Tel.: 02-26432418 - Fax: 02-26432640
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