Diagnosi differenziale delle encefaliti virali - Maria R. Capobianchi Laboratorio di Virologia - Quaderni del ...
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Diagnosi differenziale delle encefaliti virali
Maria R. Capobianchi
Laboratorio di Virologia
Istituto Nazionale Malattie Infettive “L. Spallanzani”
La maggioranza dei casi di meningo-encefalite
(fino a 80%) rimane
ad eziologia sconosciuta
Le procedure diagnostiche di routine comprendono una piccola schiera di
patogeni noti
Restano fuori
Patogeni emergenti
Patogeni legati a situazioni epidemiche contingenti
Agenti che sono neuropatogeni solo in presenza di fattori individuali di
rischio
Agenti noti di cui non si conosce o non è sospettato il potenziale
neuropatogeno
Una vasta schiera di agenti sconosciuti
L’innovazione tecnologica per migliorare l’efficienza diagnostica
Meningiti Virali Lazio 2005-2016
140
120
100
80
60
40
20
0
2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016
Men NN Virale Haem. Pneu. Strep. Staph List. Altri
Virali: circa 70-130/180-230 segnalazioni per anno
Dati SIMI Lazio (analisi SERESMI non pubblicata)
Courtesy of S. Lanini
Eziologia Lazio campione 2016-2017
Altre malattie con manifestazioni SNC
• Parotite, Varicella, Morbillo, Arbovirosi
17%
12%
70% 1%
Entero Herpes WNV Ignoto
Meningiti virali: spesso manifestazione
(infrequente) di alcune malattie virali
Courtesy of S. Lanini
Importanza della diagnosi di laboratorio
A causa della analogie nella presentazione clinica, è difficile distinguere tra infezioni
virali e batteriche sulla base della presentazione clinica
Quindi la diagnosi di laboratorio è cruciale per la gestione clinica
Il liquor è il campione di scelta
Indizi utili (ma non sufficienti a guidare una
terapia mirata):
• Conta cellulare (90% delle meningiti
batteriche presentano >100 WBC/mm3)
• Glucosio (ridotto in meningiti batteriche e
fungine, normali in forme virali)
• Proteine (elevate quasi sempre)
Diagnosi di laboratorio
Metodi diretti Metodi indiretti
liquor Siero,liquor
• Microscopia • ELISA
• Antigeni • IFA
• Coltura • Test di neutralizzazione
• Metodi molecolari • Immunità cellulare
Approccio di Laboratorio: pregi e difetti
Standard diagnostico per le forme batteriche:
• Coltura
Risultato lento
Elevata sensibilità, ma negativa nelle forme decapitate
• Esame microscopico
Risultato immediato
Sensibilità fra 60 e 90% nelle forme floride, scarsa nelle forme decapitate
• Antigeni
Risultato immediato
Sensibilità bassa
• Molecolare
Risultato rapido
Sensibilità elevata; rileva infezioni decapitate e patogeni non coltivabili
Caratterizzazione per sequenziamento
Standard diagnostico per le forme virali:
• Coltura
Gold standard, sensibilità bassa, risultato lento
• Molecolare
Diamond standard, sensibilità elevata, risultato rapido
Caratterizzazione per sequenziamento
Game changers.1
BETTER TEST
BETTER CARE
Le tecniche molecolari di rilevazione degli acidi nucleici, ed in
particolare la PCR, hanno rivoluzionato la diagnosi di laboratorio
delle infezioni (virali) del SNC, aumentando in modo significativo la
% di identificazione
Aspetti favorevoli:
Elevata sensibilità
Elevata specificità
Tempi rapidi di risposta
Costi contenuti
Metodi quali- e quantitativi
Game changers.2
The multiplex revolution: paradigm shift from disease-based sequential diagnosis of etiological agents to a syndrome-based assessment
The multiplex revolution:
paradigm shift from disease-based sequential diagnosis
of etiological agents to a syndrome-based assessment
I saggi monoplex (ricerca mirata di agenti singoli) sono vantaggiosi in caso di indagine
mirata per forte sospetto clinico, ma spesso si devono applicare in maniera
sequenziale a seguito di esclusione, oppure in batterie parallele complesse e costose,
che richiedono volumi ampi di campione o rachicentesi ripetute
L’approccio sindromico ha stimolato lo sviluppo di pannelli multiplex
(agenti eziologici più probabili associate ad un quadro sindromico)
Vantaggi:
•Piccolo volume di campione
•un singolo prelievo
•rapidità di risultato
•possibilità di rilevare rapidamente infezioni miste
Esistono numerose soluzioni commerciali sia per i saggi monoplex che per i saggi
multiplexEsempi di piattaforme basate su pannelli sindromici multiplex
Meningitis-Encephalitis (ME) Panel (FilmArray)
Bacteria: Virus: Fungi:
C. neoformans o
E. coli K1 CMV
gattii
Haemophilus
Enterovirus
influenzae
Listeria
HSV-1
monocytogenes
N. meningitidis HSV-2)
S. agalactiae HHV-6
Human
S. pneumoniae
parechovirus
VZVProgramma di intervento per la riorganizzazione della
sorveglianza ed il miglioramento diagnostico delle
sindromi neurologiche di sospetta origine infettiva nella
regione Lazio (DCA U00162/2018)
Settori di intervento
• Sorveglianza integrata della sindrome neurologica acuta a sospetta
eziologia infettiva
• Gestione della sindrome neurologica nell’ambito della rete delle
malattie infettive
• Sistema di diagnostica avanzata a supporto della
rete e della sorveglianza (approccio comune e
standardizzato basato su PCR multiplex rapida)INMI: Meningitis-Encephalitis (ME) Panel
•Test eseguibile in urgenza (piattaforma maneggevole, semplice)
•Risultati in poco più di 1 ora dal caricamento
Hydration lysis Inject Sample
Start
run
Bacteria: Virus: Fungi:
1. Escherichia coli K1 1. Cytomegalovirus 1. Cryptococcus neoformans
2. Haemophilus influenzae 2. Enterovirus 2. Cryptococcus gattii
3. Listeria monocytogenes 3. Herpes simplex virus 1 (HSV-1)
4. Neisseria meningitidis
4. Herpes simplex virus 2 (HSV-2)
(incapsulato)
5. Streptococcus agalactiae 5. Human herpesvirus 6 (HHV-6)
6. Streptococcus pneumoniae 6. Human parechovirus (HPeV)
7. Varicella zoster virus (VZV)Dati del progetto California Encephalitis
1570 pazienti (1998-2005): agente eziologico identificato nel 16% dei casi
3% 1% 4% 3%
7%
11% 29%
Enterovirus
HSV-1
Viral
20% VZV
Bacterial
WNV
Prion 12%
EBV
Parasitic
Measles
Fungi
HSV-2
69%
15%
26%Nella gran parte dei casi di meningo-encefalite l’eziologia
rimane sconosciuta
Western
Legionella equine
pneumophila
dengue:
rubella
Baylisascarisvirus
Balamuthia
mumps Dengue
procioni
mandrillaris virusvirus
viruscapsulatum
encephalitis
influenza
Eastern Histoplasma
AVenezuela
Parvovirus
Kunjin virusB19 equine
Murray
Kunjin
WNV Valley
Mycoplasma
virus Venezuelan
St Louis equine
encephalitis
Bartonella
pneumoniae henselae
Toxoplasma
Rickettsia
Louping
JEVvirus gondii
ill
encephalitisvirus
Group
(MVEV) virus
Bencephalitis
Streptococcus
encephalitis virus (VEEV)
Colorado tick fever vius
Listeria
Escherichia
Cryptococcu
HHV Powassan
La crosse
CHIK virus
rickettsia Human
Streptococcu
HSV2
HSV1
human virus
Adenovirus
Bacillus anthracis
Aspergillo
Toscana CMV enteroviruses
sscoli
monocytog
6 Cryptococ
Neisseria
parechovirus
agalactiae
Streptococcus
Nipha virus
Coxiella
Mycobacterium cus gattiiù StreptococcusHIV
Borrellia
Rocio virus neoformans
enes
meningitidis
pneumoniae burnetii
Chlamydophila
Leptospira
Coccidioides
Rift
Brucella
Valley
tuberculosis immitis
virus Rabbies
piogene virus
species
EBV: Chlamydia
Epstein-Barr trachomatis
virus
psittaci
Treponema
Candida
influenza B pallidum 0
Salmonella spp
~ il 40% noto
~60% sconosciuto“circa 90% delle sequenze hanno le sembianze di materiale genetico virale,
ma non sono classificate tassonomicamente"
20% “Il viroma noto"
Viroma totale
20% “Il viroma grigio”
60% “Il viroma ignoto (dark)”
…esistono almeno 320.000 virus di mammiferi che
attendono di essere scoperti...
Courtesy of Fabrizio MaggiGame changers.3
CLINICAL METAGENOMICS: THE HOPE, THE HYPE, AND THE HERE
AND NOW
La sfida per il futuro (prossimo): oltre la PCR
Sviluppo di tecniche avanzate
DIAGNOSTICA
RICERCAAdvances in microbial communities studies from Leeuwenhoek to NGS
Escobar-Zepeda A. Front. Genet. 2015Metagenomics
Contemporary analysis of all genomes present in a sample
Current/future applications
• Pathogen discovery
• Description of microbial communities (virome, microbiome)
• Analysis of microbial variability
• Diagnostics the future lab
Metagenomic next-generation
sequencing (mNGS) is a
game-changing technology
for infectious disease diagnosis as
nearly all pathogens – viruses,
bacteria, fungi, and parasites – can
be detected in a single assay
NGS offers the potential to interrogate clinical specimens for the presence of infectious diseases
in a completely unbiased manner.
However, significant challenges confront clinical microbiology laboratories attempting to
implement metagenomics using traditional clinical work flowsIl primo caso clinico (meningo-
encefalite fulminante) in cui la
metagenomica ha permesso la
diagnosi eziologica tempestiva e la
conseguente adozione di terapia
mirata, efficace
Absence of mycobacteria (Panel G, acid-fast), fungi (Panel
H, Gomori methenamine silver), and leptospira or other
spirochetes (Panel I, Warthin–Starry silver). TEM revealed
the presence of an inflammatory
infiltrate and the absence of inclusion bodies, viral
particles, or other evidence of microorganismsTemporal trends in the publication of Encephalitis Cases
involving NGS in the last decade
Brown JR et al J of Inf 201844 CASE REPORTS
Agenti identificati con tecniche di metagenomica (shot-gun) NGS
HSV-1, Varicella, Morbillo, Parotite,
Coxsackie A9, JC virus, EBV, West Nile
Agenti noti 16 virus, St Louis encephalitis virus,
Echovirus 30, M. tubercolosis,
Cryptococcus neoformans
Arenavirus, Squirrel bornavirus,
Agenti nuovi 18 Cyclovirus, Densovirus, Astrovirus,
Gemycircuarlvirus
Parvovirus 4, Coronavirus OC43,
Patogeni inattesi 5 Astrovirus VA1/HMO-C, mumps
vaccine virus
Balamuthia mandrillaris, Candida
Patogeni rari 5 tropicalis, Brucella melitensis,
Leptospira santarosai, Naegleria
fowleri
Brown JR et al J of Inf 2018Il protocollo sindromico per la gestione del paziente (DCA U00162/2018)
ASPETTI DIAGNOSTICI
IL LABORATORIO
Sperimentazione di un modello di diagnostica avanzata
che si avvale dell’ausilio della metagenomica per
l’attribuzione eziologica delle meningoencefaliti
• Analisi metagenomica (basata su NGS) su tutti i
campioni di liquor negativi allo screening (F.A.)
• I risultati verranno riferiti al contesto territoriale,
stagionale e individuale (fattori di rischio)
• La mappatura spazio-temporale servirà a disegnare
pannelli diagnostici differenziati per i vari contesti
della nostra regionemNGS WORKFLOW (SISPA)
Total nucleic acid extraction
Reverse transcription and amplification of nucleic acid
(non targeted amplification):
Sequence Independent Single Primer Amplification - SISPA
Amplicon purification & fragmentation
Library preparation
Sequencing with Ion Torrent S5 platform
Preliminary work included optimization of SISPA, using positive controls (true clinical CSF samples) or
negative CSF samples spiked with known amount of DNA (HSV) and RNA (HCV) virusesBioinformatic workflow 1. Quality control of raw reads was performed using BaseCaller and Cutadapt 2. High quality reads were mapped to human genome using Bowtie2 (in very-sensitive mode) 3. No-human reads where mapped to NCBI nucleotide database, with a cut-off E-value of 10-5
Results. 2
CSF negative to FilmArray were analyzed by metagenomics
Total CSF:
72
Age N° Gender Diseases
(years) (%M)
60 17 58 1 Meningoencephalitis; 6 Encephalitis; 10 Not definedResults 3.
72 CSF analyzed by metagenomics
Average reads per sample: 4.17 x 107 ± 1.42 x 106 (95% CI)
Median reads length: 190nt (30-390)
Human reads: 3.93 x 107 (range: 5.25x 105 -5.29 x 107 )
No hits reads: 4.41 x 105 (range: 2.06x 105 -2.45 x 106 )
Eukaryotic reads: 7.54 x 104 (range: 2.90x 104 -6.13 x 106 )
Bacterial reads: 2.41 x 104 (range: 6.90x 101 -2.68 x 107 )
Viral reads: 20.5 (range: 1 - 1.91 x 107 )
viral reads ≈ 0,00005%
(range: 0,000003 % - 34 %)Conclusions (pros) • Viruses excluded from FilmArray detected in ~15% (11/72) of CSF, in some cases confirmed a posteriori by targeted PCR • Overall good agreement results between IonTorrent and Illumina platforms • In some cases relevant number of reads (i.e. TTV), providing near full genome characterization • Unbiased mNGS may represent a suitable approach to characterize the virome in samples containing small amounts of NA (i.e. CSF) • Possible to foresee the eventual replacement of many single-agent assays performed in reference laboratories with a unified mNGS approach?
Conclusions (cons)
• In some cases disagreement between NGS and targeted amplification
(PCR)
RNA vs DNA? Amplified region?
• Lack of standardization for data analysis and interpretation
• So far timeframe not compatible for clinical decision-making
Open issues
• Difficulties in discriminating between pathogenic organisms or
bystanders (non pathogenic) and contaminants (i.e. reagent and
environmental contaminant background signatures)
Need of algorithm correctly prioritizing etiologic pathogens
• Ethical implications of metagenomics: incidental findingsSUMMARY Laboratory diagnosis of meningitis/encephalitis is critical for patient care Laboratory diagnosis of meningitis/encephalitis is multifaceted with many complexities, not suitable to one stop shopping New assays are constantly being developed to aid in the diagnosis of meningitis/encephalitis
Work in progress Barbara Bartolini M. Beatrice Valli Paris, May Martina Rueca 1888 Cesare Gruber SERESMI Giuseppe Ippolito
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