CELLULE STAMINALI E PROBLEMATICHE CORRELATE - Augusto Pessina
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Augusto Pessina
Dipartimento Scienze Biomediche, Chirurgiche e Odontoiatriche
Università degli Studi di Milano
CELLULE STAMINALI E
PROBLEMATICHE CORRELATE
Università Cattolica Sacro Cuore
28 Febbraio 2013
Augusto Pessina,2013
Induced Pluripotent Stem Cells(iPSc)
NOBEL PRIZE 2012
Ci sono alternative agli embrioni?
Cosa sono le IPSc
Quali problemi pongono?
Una nota antropologica
Augusto Pessina,2013
ALTERNATIVES TO EMBRYO
Do they exist? Are they ethical?
•Amniotic fluid ( De Coppi)
•Placenta (Parolini ; Heustschleger, Vien,De Coppi )
•Pluripotent spermatogonial stem cells in testis of neonatal and adult mice
(Shinohara 2004; Guan 2006 ( Multipotent ? Seandel 2007)
•2006 Robert Lanza : basta un blastomero per ottenere cellule pluripotenti (si
ma… l’embrione muore??)
•Bovine oocyte extract , Artificial cytoplast ( EDI et al…)
PARTHENOGENESIS
•Stimulation of monkey oocytes >>Blastocyst >>cyno-1 (?) >> neural cells and
epithelial cells, cardiomyocytes(Vrana et al, Pnas 2003).
•Activation of human oocytes to blastocystis (Brevini et al.,2005)
•Healthy mice ( 2 /371 tries) from paired mature-immature oocytes donor
immature oocyte with a knockout of imprinting control region on chr 7 (
Kawahara M et al, Nature 2007) Augusto Pessina,2013
PREMI NOBEL PER LA FISIOLOGIA
E LA MEDICINA 2012
44 anni = l’età di Yamanaka
Yamanaka, S. (2006). Induction
Gurdon, J.B. (1962).
of pluripotent stem cells from
The developmental capacity of nuclei
mouse embryonic and adult
taken from intestinal epithelium cells fibroblast cultures by defined
of feeding tadpoles. factors. Cell 126:663-676.
Journal of Embryology and Experimental Morphology
10:622-640.
Augusto Pessina,2013
Augusto Pessina,2013
CLONAZIONE DI J.B. GURDON ,1962 Xenopus laevis Augusto Pessina,2013
CLONAZIONE DI WILMUT , 1997
( Dolly)
Augusto Pessina,2013
Dolly viva Augusto Pessina,2013
Dolly morta Augusto Pessina,2013
Augusto Pessina,2013
Augusto Pessina,2013
Augusto Pessina,2013
Augusto Pessina,2013
Augusto Pessina,2013
A: retro/ lentivirus
transduction
B: adenovirus
transduction
C: plasmid
tarnsfection
D: transposone
based transfection
Augusto Pessina,2013Molecular Vision 2010; 16:768-773
Received 2 January 2010 | Accepted 21 April 2010 | Published 28 April 2010
Figure 1. Identification of a c.70del20 mutation in a patient with unilateral
microphthalmia. A: Photograph of Patient 1 with SOX2anophthalmia syndrome.
Note right microphthalmia (prosthesis in place) and prominent ears.
B: Sequence fragments showing the c.70del20 region in the patient (p), his mother (m)
and his father (f). The position of the deletion is indicated with a red arrow. Note
normal SOX2sequence in the patient’s parents
Augusto consistent with their unaffected status.
Pessina,2013Augusto Pessina,2013
A scheme of the generation of induced pluripotent stem (iPS) cells.
1. Isolate and culture donor cells.
2. Transfect stem cell-associated genes into the cells by viral vectors.
3. Harvest and culture the cells according to ES cell culture, using
feeder cells
(lightgray).
4. A small subset of the transfected cells become iPS cells and generate
ES-like colonies
Augusto Pessina,2013Augusto Pessina,2013
Augusto Pessina,2013
The most stringent method to evaluate A less stringent method to assess
the pluripotency of iPSCs is to inject the pluripotency of iPSCs is
the ES cells into host blastocysts to teratoma formation assay.
assay if viable chimeras are produced . In this assay, iPSCs injected under the
By using an appropriate reporter system or cell skin of nude mice should develop
markers, cells from the iPSC lineage can be teratomas with the distinct structure of all
traced throughout the whole body of chimeric three germ layers (ectoderm, mesoderm,
mice. However, chimera formation is not a and endoderm). The teratoma assay
practical approach for human cells, nor even for requires a threshold level of cells to prove
mouse cells, as this is time-consuming and not successful, though the exact number has
applicable to most research laboratoriesAugusto Pessina,2013
not yet been identified..
The more frequently used method for assessing the pluripotency of
iPSCs is to differentiate in vitro the putative iPSCs into various cell
types and assay for cell markers
These include gene expression markers, antigen markers, and epigenetic markers (DNA methylation and
histone modification patterns). For human iPSCs, frequently used stem cell expression markers are AP1,
Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, and TRA-2-49/6E. For mouse iPSCs, AP1, Nanog, and
SSEA-1 are often used. Human and mouse iPSCs have been differentiated in vitro into neural stem cells,
neurons, cardiomyocytes, etc. Specific expression and antigen markers are available for each of these cell
types.
Augusto Pessina,2013Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome
12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells. Stadtfeld
M, Apostolou E, Akutsu H, Fukuda A, Follett P, Natesan
S, Kono T, Shioda T, Hochedlinger K. Nature. 2010 May
13;465(7295):175-81. Epub 2010 Apr25
Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated by enforced expression of defined sets
of transcription factors in somatic cells. It remains controversial whether iPSCs are molecularly and
functionally equivalent to blastocyst-derived embryonic stem (ES) cells. By comparing genetically
identical mouse ES cells and iPSCs, we show here that their overall messenger RNA and microRNA
expression patterns are indistinguishable with the exception of a few transcripts encoded within the
imprinted Dlk1-Dio3 gene cluster on chromosome 12qF1, which were aberrantly silenced in most of
the iPSC clones. Consistent with a developmental role of the Dlk1-Dio3 gene cluster, these iPSC
clones contributed poorly to chimaeras and failed to support the development of entirely iPSC-derived
animals ('all-iPSC mice').
In contrast, iPSC clones with normal expression of the Dlk1-Dio3 cluster
contributed to high-grade chimaeras and generated viable all-iPSC mice. Notably,
treatment of an iPSC clone that had silenced Dlk1-Dio3 with a histone deacetylase inhibitor
reactivated the locus and rescued its ability to support full-term development of all-iPSC mice.
Thus, the expression state of a single imprinted gene cluster seems to distinguish
most murine iPSCs from ES cells and allows for the prospective identification of
iPSC clones that have the full development potential of ES cells.
Augusto Pessina,2013I PROBLEMI BIOLOGICI DELLE IPSc
( MOLTO SIMILI A QUELLI DELLE CELLULE EMBRIONALI)
Genomic instability in iPS: time for a break
M.A Blasco et al, The EMBO Journal (2011) 30, 991 - 993
• Recent works have revealed that transcriptional and epigenetic
reprogramming is often incomplete, which has raised some concerns on the
nature of iPS.
• Inevitably, now the genome itself of iPS has been scrutinized; and the
reports come with an unexpected twist: the presence of mutations in the
Stem cells:
genome The dark side of induced pluripotency
of iPS.
Martin F. Pera, Nature,471:46–47,2011
Induce pluripotent stem cells have great therapeutic potential. But genomic and
epigenomic analyses of these cells generated using current technology reveal
abnormalities that may affect their safe use.
Induced Pluripotency and Oncogenic Transformation Are Related
Processes
Riggs et al.Stem Cell Dev. 2012 Oct 26. [Epub ahead of print]
Taken together, these findings support a model in which OF and iPSCs are
related, yet distinct cell types, and in which induced pluripotency and induced
tumorigenesis are similar processes Augusto Pessina,2013Genomic instability in iPS: time for a break
M.A Blasco et al, The EMBO Journal (2011) 30, 991 - 993
• Recent works have revealed that transcriptional and epigenetic
reprogramming is often incomplete, which has raised some concerns on the
nature of iPS.
• Inevitably, now the genome itself of iPS has been scrutinized; and the
reports come with an unexpected twist: the presence of mutations in the
genome of iPS.
Stem cells: The dark side of induced pluripotency
Martin F. Pera, Nature,471:46–47,2011
Induced pluripotent stem cells have great therapeutic potential. But
genomic and epigenomic analyses of these cells generated using current
technology reveal abnormalities that may affect their safe use.
Induced Pluripotency and Oncogenic Transformation Are Related
Processes
Riggs JW, Barrilleaux BL, Varlakhanova N, Bush KM, Chan V, Knoepfler PS. Stem Cells Dev. 2012 Oct 26. [Epub ahead of print]
Taken together, these findings support a model in which OF and iPSCs are related,
yet distinct cell types, and in which induced pluripotency and induced
tumorigenesis are similar processesAugusto Pessina,2013Copy number variation and selection during
reprogramming to pluripotency
(S.M Hussein et al, Nature,471:58–62 ,2011)
The mechanisms underlying the low efficiency of
reprogramming somatic cells into induced pluripotent
stem (iPS) cells are poorly understood.
There is a clear need to study whether the
reprogramming process itself compromises genomic
integrity and, through this, the efficiency of iPS cell
establishment.
Remarkably, expansion of human iPS cells in culture
selects rapidly against mutated cells, driving the lines
towards a genetic state resembling human ES cells.
Augusto Pessina,2013iPSC
Problemi di natura etica,legale ,sociale
-La privacy
-Il consenso
-I diritti del donatore
-La proprietà intellettuale
-Uso etico delle ips
-Traslazione clinica
Reference: Zarzeczny et al., iPS Cells: Mapping the Policy
Issues . Cell, 139:1032.1037.
Augusto Pessina,2013Privacy
• Il fingerprint del DNA contiene informazioni sul donatore
,un uso inappropriato può violare la privacy individuale
• De-identificare/ anonimizzare i risultati è una soluzione?
- futuri usi clinici potrebbero rendere necessarie
informazioni sullo stato di salute del donatore
- le tecnologie “single nucleotide polymorphisms” possono
identificare il donatore
• Che fare di dati inattesi di cui si viene a conoscenza
durante la ricerca? (es. predisposizioni genetiche del
donatore a patologie specifiche).
Augusto Pessina,2013Interrogativi circa il consenso
• Un consenso generico (per ricerche biologiche o banking)
non è accettabile
• Occorre enumerare rigorosamente le ricerche e gli usi cui
il consenso è riferito ( come includere i dati e l’uso non
prevedibile a priori?).
• Occorre un consenso per ogni nuovo progetto di ricerca?
(Es.: derivazione di gameti,produzione di chimere umane-
animali,ricerche sulla fertilità ,ricerche di base , trapianti e
altri usi clinici ,ecc….)
• Possono i genitori decidere per la donazione di cellule di
un figlio?
• Se perdura il diritto del donatore all’informazione su dati
che lo riguardano deve durare il diritto al ritiro del
consenso dato?
• Fino a quando un donatore può ritirare il consenso dato?
Si deve prevedere il diritto di distruzione su richiesta del
Augusto Pessina,2013
donatore dopo che una linea iPS è creata?DIRITTI DEL DONATORE
• Il donatore ha diritto a benefici finanziari per l’uso
commerciale di una linea di sue cellule? (negli USA i
tribunali hanno rigettato tale richiesta per “public policy
reasons”)
• Il diritto di autonomia e dignità del donatore deve
riguardare il suo genoma? e quindi le informazioni
sulla sua salute individuale possono essere
utilizzate?
• Una linea cellulare manipolata è da considerare
un prodotto nuovo o no ? ( dal momento che ha
una certa quantità di caratteri unici del donatore?
Augusto Pessina,2013Proprietà intellettuale
• Cosa si può brevettare ? La linea cellulare o la
procedura per ottenerla o il suo utilizzo ? (Negli
USA le strategie di brevetto sono alquanto aggressive. In
Europa sono più restrittive se riguardano la distruzione di
embrioni )
• Ogni tecnica di riprogrammazione è di per sé una
nuova procedura brevettabile?
• La proliferazione dei brevetti pluri-patents (con più
propreitari ) non può complicare e rendere
costoso la negoziazione di tecnologie e diminuire
la ricaduta dei benefici sociali e personali?
Augusto Pessina,2013USO ETICO DI iPS cells
• La questione cruciale :le iPS sono equivalenti delle hESC ?
Per rispondere a questa domanda si rende necessario
sperimentare su cellule embrionali umane!
• La tecnica di “tetraploid complementation” potrebbe
permettere la clonazione umana (con iPS introdotte in una
blastocisti tetraploide si genera un animale geneticamente
identico al donatore della cellula somatica anche per il
DNA dei mitocondri!!)
• L’uso a scopi riproduttivi (derivazione di gameti) pone
gravi questioni etiche sia in relazione al consenso che alla
sicurezza e introduce alla possibilità di clonazione
• La funzionalità di gameti derivati in vitro dovrà
necessariamente essere verificata mediante la produzione
e la conseguente distruzione di embrioni .
Augusto Pessina,2013Nature 461, 86-90 (3 September 2009) | doi:10.1038/nature08267; Published online 23 July 2009
iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation
Xiao-yang Zhao1,2,5, Wei Li1,2,5, Zhuo Lv1,2,5, Lei Liu1, Man Tong1,2, Tang Hai1, Jie Hao1,2, Chang-long Guo1,2, Qing-wen Ma3,
Liu Wang1, Fanyi Zeng3,4 & Qi Zhou1 Nature Genetics
(a) IVF in the mouse (control).
(b) Tetraploid
complementation:
electrofusion of two-cell
embryo (4N) followed by
culture to blastocyst stage
and injection of ESCs (2N)
derived from fertilized
embryos (fESCs). The
resulting pup is 2N; the
placenta is 4
(c) Tetraploid complementation
with injection of ntESCs,
showing similar efficiency
to fESCs.
(d) Nuclear transfer results in
only 1%–2% term
development; most have
large placentas (98%–99%
die in utero).
Augusto Pessina,2013Translazione clinica
• Per poter utilizzare ips in terapia sarà necessario passare
attraverso modelli animali aprendo altri problemi etici
come la produzione di chimere uomo-animale.
• Le prospettive sembrano assai complesse. Occorre la
messa a punto di standards di riferimento che siano
accettabili
• Le agenzie regolatorie possono applicare i criteri già usati
per altri prodotti cellulari? Ogni nuova linea iPS è da
considerare un prodotto individuale nuovo e quindi non
assimilabile ad altri?
• Sembra improbabile che i processi standardizzati e
approvati per alcune cellule staminali possano essere
applicati anche alle iPS.!
Augusto Pessina,2013Inoltre
• La forte pressione commerciale suscitata dalle iPS
rappresenta oggi un impedimento pratico alla condivisione
di criteri standardizzati per la loro produzione
• Ancor più grave se si pensa agli aspetti terapeutici.
• Un esempio dagli USA:
• Trials clinici in lesioni al midollo spinale eseguiti dalla
Geron con progenitori oligodendrocitici derivati da hESC
• …i dati sulla efficacia, sulla sicurezza e sulle procedure di
produzione restano confidenziali tra la Ditta e la FDA.
• Nessuno può imparare da questi studi che sono destinati
ad essere ripetuti con ulteriore dispendio di risorse e di
embrioni umani.
Augusto Pessina,2013Ringraziamenti a
ARIANNA BONOMI
VALENTINA COCCE’
FRANCESCA SISTO
LOREDANA CAVICCHINI
LABORATORIO COLTURE CELLULARI
Dipartimento di Scienze Biomediche,Chirurgiche e Odontoiatriche
Università degli Studi di Milano
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