Aspetti metodologici e di laboratorio - Massimo Gion Centro e Programma Regionale Biomarcatori
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Aspetti metodologici e di laboratorio
Massimo Gion
Centro e Programma Regionale Biomarcatori
Ospedale SS Giovanni e Paolo, Venezia, Aulss13 SerenissimaAgenda – Metodi immunometrici – Indicatori di performance analitica – Fattori di variabilità dei risultati
Metodi immunometrici Principio base dell’immunometria: • Assunzione di identità immunologica fra l’Antigene ricercato nel campione biologico e l’Antigene standard usato per la curva di calibrazione. • Questo assunto non sempre si verifica nella realtà diagnostica.
Metodi immunometrici
Particolarità
1. Metodo di misura indiretto (confronto di
immunoreattività con uno standard)
2. Ordine di grandezza delle concentrazioni
misurabili (10 -9 - 10 -12 g)
Quale impatto hanno sulla performance
analitica?Agenda – Metodi immunometrici – Indicatori di performance analitica – Fattori di variabilità dei risultati
Indicatori di performance analitica – Esattezza – Precisione – Accuratezza
Indicatori di performance analitica
Esattezza (inesatteza)
– Concordanza tra il valore di riferimento (valore
“vero”) di un analita e la media di una serie di misure
ripetute dell’analita presente in un campione.
– Riflette “l’errore sistematico” del metodo, inteso
come differenza fra valore “vero” e valore misurato
– E’ legata alla natura “comparativa” dei metodi
immunometriciIndicatori di performance analitica
Precisione (Imprecisione)
– Grado di variazione fra misure ripetute di uno stesso
campione (nel dosaggio, fra dosaggi)
– La misura dell’imprecisione rappresenta l’errore
casuale del metodo ed è una stima della ripetibilità
della misura all’interno dello stesso metodo.
– E’ legata alla concentrazione molto bassa dei
marcatori nei liquidi biologici (ng/ml o pg/ml), che
comporta un rischio intrinseco di imprecisione
maggiore degli esami di chimica clinica.Preciso, Esatto
??Preciso, Inesatto
??Impreciso, Esatto
??Impreciso, Inesatto
??Indicatori di performance analitica – Esattezza – Precisione – Accuratezza
Indicatori di performance analitica
Accuratezza (inaccuratezza)
– Scostamento di una singola determinazione rispetto
al valore “vero”
– E’ composta da esattezza e imprecisione fra metodi
– Viene misurata e monitorata attraverso programmi
di verifica esterna di qualità (VEQ), che mostra le
differenze dei risultati di laboratori che usano
metodi diversiIndicatori di performance analitica
Le verifiche di qualità
Imprecisione (errore casuale)
Ripetibilità di uno stesso metodo nel tempo
• Metodo di verifica: controllo di qualità interno
Inaccuratezza (errore sistematico)
Confrontabilità fra metodi
• Metodo di verifica: Programmi di verifica
esterna di qualità (VEQ)Indicatori di performance analitica
Controllo di qualità interno
• Materiale di controllo (uno o più livelli) a
concentrazione nota viene misurato in ogni serie
analitica
• I risultati vengono registrati su apposite “carte di
controllo” (cartacee o informatiche) e valutati
utilizzando regole decisionali prefissate di
accettazione o rigetto della serieIndicatori di performance analitica
Verifica esterna di qualità (VEQ)
• Materiale di controllo (uno o più livelli) a
concentrazione NON dichiarata viene inviato da un
ente terzo e misurato periodicamente
• I valori trovati vengono trasmessi all’ente terzo che li
elabora e rende noti i risultati ai partecipanti
• I risultati di ciascun laboratorio sono messi a
confronto con tutti gli altri (in generale e per metodo)Indicatori di performance analitica
Verifica esterna di qualità (VEQ)
Qualche esempioEQAS-CNR Immunocheck Analyte: CA 15-3 Sample IM71c (2017.02.16) Consensus mean: 38.6 KU/L
EQAS-CNR Immunocheck Analyte: CEA Sample IM71b (2017.02.16) Consensus mean: 22.4 KU/L
EQAS-CNR Immunocheck Analyte: PSA Sample IM66b (2016.10.28) Consensus mean: 3.87 mmg/L
Per essere confrontabili, metodi diversi
dovrebbero essere calibrati con uno Standard
Internazionale ….
… disponibile oggi per:
hCG, AFP, hCT, CEA, hTG, PSAL’adozione di uno standard internazionale
di riferimento può eliminare il problema?
?L’esempio del PSA
Oggi è disponibile uno standard
internazionale WHOStandard internazionale WHO per il PSA
La ricalibrazione contro lo standard WHO:
– dovrebbe ridurre la variabilità fra metodi
riducendo, al minimo le implicazioni cliniche di
tali variazioni, ma ….
– cambia i valori assoluti di PSA!Recalibration to WHO standards
• Calibration to the WHO standard could lead to a
proportional negative bias in mass units of
approximately 20% compared with the non-WHO
calibrated assay
C. Stephan et al, Clin Chem Lab Med 2008;46:623–629Impact of different PSA standardization on the cut-off
definition and clinical interpretation of results
JS. Blanchet, T. Brinkmann, JMB 27,161-168, 2008Recalibration to WHO standards
An appropriate clinical decision point of 3.1
ng/mL was identified to preserve the clinical
performance of the assay calibrated to the WHO
standard
JS. Blanchet, T. Brinkmann, JMB 27,161-168, 2008Distribution of patients according to the tPSA cut-off
value. Unadjusted WHO clinical cut-off
Hybritech Calibration
WHO Calibration ≤ 4 ng/mL > 4 ng/mL Total
≤ 4 ng/mL 47 38 (15%) 85
> 4 ng/mL 0 170 170
Total 47 208 255
JS. Blanchet, T. Brinkmann, JMB 27,161-168, 2008Distribution of patients according to the tPSA cut-off
value. Adjusted WHO clinical cut-off
Hybritech Calibration
WHO Calibration ≤ 4 ng/mL > 4 ng/mL Total
≤ 3.1 ng/mL 47 0 47
> 3.1 ng/mL 0 208 208
Total 47 208 255
JS. Blanchet, T. Brinkmann, JMB 27,161-168, 2008Il medico che interpreta il risultato è a conoscenza dello standard usato dal laboratorio ? I diversi laboratori sono allineati sullo standard da utilizzare ? Il laboratorio che usa la calibrazione WHO, … cambia il cutoff da 4.0 a 3.1 ng/mL?
La variabilità fra metodi può essere ridotta
con l’uso di una preparazione standard di
riferimento
L’adozione di uno standard di riferimento è
condizione sufficiente a eliminare il
problema della variabilità fra metodi?
??Different prostate-specific antigen assays give different results on the same blood sample: an obstacle to recommending uniform limits for prostate biopsies C. Stephan, J. Kramer, H-A. Meyer, G. Kristiansen, S. Ziemer, S. Deger, M. Lein, S. A. Loening, K. Jung BJU International 2007:99,1427–1431
Recalibration to WHO standards
• Even WHO calibrated assays do not deliver similar tPSA
values
• Thus, calibration might be an important, but not the
exclusive factor, to improve the harmonization among
the various assays
• The 3.1 ng/mL cut-off cannot be applied to any WHO
calibrated tPSA assay, since an appropriate clinical
decision point should be defined for each tPSA assay
JS. Blanchet, T. Brinkmann, JMB 27,161-168, 2008Agenda – Metodi immunometrici – Indicatori di performance analitica – Fattori di variabilità dei risultati
Fattori di variabilità dei risultati
La variabilità è solo (o prevalentemente)
dovuta al metodo?
?Fattori di variabilità dei risultati
Concetto di variabilità complessiva
Le componenti della variabilità
• Imprecisione (metodo dipendente)
• Inaccuratezza (metodo dipendente)
• Interferenze (parzialmente metodo dipendente)
• Individualità (non metodo dipendente)Fattori di variabilità dei risultati
Fattori di individualità e interferenze
• Variabilità biologica
• Eterogeneità dell’antigene
– Polimeri/aggregati
– Frammenti
– Micro-eterogeneità
• Presenza in circolo di autoanticorpi
• Presenza di circolo di sostanze cross-reagenti
• Effetto della matriceComponenti delle variabilità complessiva
interferenze
imprecisione
inaccuratezza
individualità
Componenti metodo-dipendenti
Campione-dipendenti
Variabilità complessiva
(Messeri G, 2004)Variabilità complessiva intra-metodo
Campioni Metodo A
1
imprecision 2
inaccuracy 3
sample dependent
4
interference
5
sample individuality
6
Variabilità complessiva
(Messeri G, 2004)Variabilità complessiva inter-metodo
Metodi Campione A
1
imprecision 2
inaccuracy 3
sample dependent
4
interference
5
sample individuality
6
Variabilità complessiva
(Messeri G, 2004)Fattori di variabilità dei risultati
Metodi diversi possono portare a
risultati diversi
Quanto diversi ?
?Abbott AxSym Total PSA* 3,0
Abbott AxSym PSA 3,6 589 men
Baxter/Dade Stratus II 4,0
Bayer/Chiron ACS PSA
Bayer Immuno 1
3,5
3,6
without CaP
bioMérieux Vidas TPSA
bioMérieux Vidas PSA**
3,6
4,4
23 t-PSA assays
Boehringer Elecsys 3,4
Boehringer Enzymun ES 700 2,9
Brahms Kryptor 3,1
Byk-Sangtec IRMA-Mat 2,6
Byk-Sangtec Liaison 2,7
Chiron ACS PSA 2*** 2,9
DPC Coat-A-Count IRMA 3,7
DPC Immulite 3. Generation 3,5
DPC Immulite standard 3,7
Eurogenetics/Tosoh AIA 4,1
Hybritech/Beckman Access 3,7
Hybritech Tandem-E 3,7
Hybritech Tandem-R 3,8
Roche Cobas Core II 3,0
Wallac Delfia Dual Label 3,0
Wallac Delfia EQM 3,1
Fornara & Semjonow: PSA: Der Weg zum
1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 Befund, Zuckschwerdt Verlag München,
95-Perzentile t-PSA [ng/ml] 2002Byk / IRMA-Mat
Boehringer / ES700
Boehringer / Elecsys 2010 „alt“
Cut-offs
CIS / Kryptor
Chiron / ACS 2
equivalent to
Wallac / Dual Label traditional 4-10
Wallac / EQM
Abbott / AxSym (Mono-Mono) „neu“
Roche / Cobas Core II
Abbott / AxSym (Mono-Poly) „alt“
Dade / Stratus II
DPC / Immulite 3. Generation
Bayer / Immuno
DPC / IRMA CoataCount
DPC / Immulite Standard
Hybritech / Tandem-E
Hybritech / Tandem-R
BioMerieux / Vidas „neu“
Tosoh / AIA 600
Behring / Nephelometer
Biomerieux / Vidas „alt“ Fornara & Semjonow: PSA: Der Weg zum
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Befund, Zuckschwerdt Verlag München,
2002
Total PSA [ng/ml]Fattori di variabilità dei risultati
Assay of substances of biological importance fall
into two categories
– Analytical assays
result independent of the measuring system
– Comparative assays
result dependent on the measuring system
(R. Ekins, 1999)Fattori di variabilità dei risultati
Comparative assays
Any statement regarding the relative
amounts of the substance is meaningless
without an indication of the measuring
system employed
(R. Ekins, 1999)Aspetti metodologici e di laboratorio
Conclusioni (1/2)
La variabilità in immunometria non è eliminabile
– La conoscenza delle componenti analitiche dell’errore
è essenziale per una corretta scelta ed applicazione
dei metodi di dosaggio
– La conoscenza delle componenti analitiche e non
analitiche della variabilità complessiva è cruciale per
una corretta interpretazione dei risultatiAspetti metodologici e di laboratorio
Conclusioni (2/2)
– Il confronto fra risultati seriati nello stesso paziente è
accurato solo se il dosaggio viene eseguito con lo stesso
metodo
– E’ compito del medico curante spiegare al paziente
l’importanza di eseguire il dosaggio di un marcatore
sempre nello stesso laboratorio
– E’ compito del laboratorio informare l’utenza (medico,
paziente) in caso di variazione di metodiGrazie per l’attenzione
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