Sviluppo di un immunosensore per la diagnosi virologica dell'influenza A.
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RELAZIONE FINALE
PROGETTO:
Sviluppo di un immunosensore per la diagnosi
virologica dell’influenza A.
Relazione Finale
Settembre 2008
Autori: Dr. Laura Bifulco.
Supervisore e responsabile scientifico del progetto: Prof Raffaello Pompei
Il Progetto è stato finanziato da
(P.O.R. SARDEGNA 2000/2006-Misura 3.13)
Cofinanziato daINDICE DEI CONTENUTI
1- ANAGRAFICA DEL PROPONENTE E/O COPROPONENTI 3
1.1 Sedi delle attività di ricerca (*) 3
2- ARTICOLAZIONE DELL’ATTIVITÀ 3
3- DESCRIZIONE DELLE ATTIVITÀ REALIZZATE 3
3.1 Fase 1 4
3.2 Fase 2 8
4- CONSULENZE ATTIVATE 15
5- GRADO DI UTILIZZO DELLE RISORSE TECNICHE 20
5.1 Utilizzo di attrezzature e laboratori esterni 20
5.2 Acquisto di strumentazione e licenze 21
5.3 Altre risorse tecniche 21
6- RISULTATI OTTENUTI NEL PROGETTO 21
7- CRITICITÀ INCONTRATE DURANTE LA REALIZZAZIONE
DELL’ATTIVITÀ 22
(Criticità tecnico-scientifiche, Criticità gestionali, Criticità finanziarie) 22
8- ALTRE INFORMAZIONI 22
9- CONSIDERAZIONI FINALI 221- Anagrafica del Proponente e/o Coproponenti
1.1 Sedi delle attività di ricerca (*)
Strutture di riferimento Biotecne
Via Via Nuoro 58
Comune Cagliari
Provincia CA
Responsabile del Centro Prof. Gaetano Di Chiara
1.2 Sedi delle attività di ricerca (*)
Strutture di riferimento Dipartimento di Scienze e Tecnologie
Biomediche-Sezione di Microbiologia Applicata
Via via Porcell, 4
Comune Cagliari
Provincia CA
Responsabile della Sezione Prof. Raffaello Pompei
(*) ripetere per ciascuna sede e/o struttura di riferimento
2- Articolazione dell’attività (ottobre 2006 – luglio 2008)
Mese STATO
Mese
Titolo della fase del progetto termine (da iniziare, in corso,
inizio (*)
(*) terminato)
A - Purificazione Fab 3 18 Terminato
A1 – Stabilizzazione del Fab 6 12 Terminato
A2 - Valutazione della stabilità del Fab 6 12 Terminato
B - Immunofluorescenza indiretta 3 12 Terminato
C - Coniugazione-Fab-Fluoresceina 3 9 Terminato
D -Preparazione antigene 3 18 Terminato
E - Coniugazione Fab-Enzima 6 18 Terminato
F - Determinazione dell’attività dell’enzima coniugato 7 15 Terminato
G -Valutazione dell’affinità del Fab 9 14 Terminato
H -Valutazione della stabilità del prodotto Fab-enzima 9 14 Terminato
I – Saggi amperometrici 9 14 Terminato
L - saggi immunologici amperometrici 10 18 Terminato
M - Prove preliminari immobilizzazione 15 18 Terminato
(*) indicare, ad es.,: 1, 2, … considerando che il mese di inizio del progetto è il mese 1
3- DESCRIZIONE DELLE ATTIVITÀ REALIZZATE
Aggiungere in questa parte tanti capitoli quante sono le fasi previste3.1 Fase A e G
TITOLO Fase A, A1, A2 e G
Produzione, purificazione e stabilizzazione
del Fab
Descrizione delle attività realizzate
Il lavoro di seguito descritto è stato realizzato presso i laboratori del Dipartimento di Scienze e
Tecnologie Biomediche - Sezione di Microbiologia applicata dalle Dott.sse Laura Bifulco (consulente
di Biotecne) e Samuela Laconi (contratto a progetto con Biotecne) sotto la supervisione del Prof.
Raffaello Pompei.
Produzione dell’anticorpo
L’anticorpo monoclonale (Fab) ricombinante umano contro l’influenza di tipo A continua ad
essere prodotto e continuerà ad essere prodotto per tutto il periodo della sperimentazione (18
mesi). Sono infatti necessarie elevate quantità di anticorpo per poter realizzare le azioni e fasi
successive.
La produzione è stata sempre attuata con le metodiche e i materiali descritti nella prima
relazione ma per quanto si sia cercato di ottimizzare il protocollo per migliorare la resa in
anticorpo si è continuato ad avere delle produzioni variabili. Infatti, da ogni litro di
brodocultura si è calcolato di poter ricavare al massimo 1 mg di Fab in forma attiva. Si è
valutato quali potessero essere i fattori che determinavano tale variabilità e si è cercato di
standardizzare maggiormente la produzione.
Per garantire la stabilità della proteina si è osservato che l’aggiunta dell’inibitore delle serin
proteasi (PMSF: 34.8 µg/ml) nelle dosi consigliate dal protocollo non era sufficiente. La dose
dell’inibitore è stata quindi triplicata ed è stata inoltre ulteriormente stabilizzata con l’aggiunta
di un appropriato cocktail di inibitori di proteasi (complete EDTA free - Roche) che è stato
scelto tra tutti i prodotti in commercio come il più adatto.
Preparazione colonna cromatografica, purificazione e
stabilizzazione del Fab
La preparazione della colonna cromatografica e la purificazione del Fab sono avvenute
seguendo i protocolli descritti nella prima relazione anche se tali protocolli sono stati modificati
per migliorare la resa in proteina come sotto riportato.
Per la preparazione della colonna cromatografica è stata aumentata la quantità di anticorpo
(anti human IgG Fab specific) coniugato portando il rapporto ml di resina/mg anticorpo da 1:1
a 1:1,5.
Per quanto riguarda il protocollo della purificazione invece è stata modificata la fase di raccolta,
trattamento e conservazione dei campioni.Per poter conoscere in quali frazioni sia contenuto il Fab e a quale concentrazione, le frazioni raccolte vengono analizzate in elettroforesi su gel di acrilamide-bisacrilamide denaturante al 12%. Il Fab è presente normalmente nelle frazioni da 3 a 9 su un totale di 10 frazioni raccolte. Il Fab così purificato viene quindi saggiato in ELISA.Nelle fasi iniziali del lavoro si è anche saggiato con la immunofluorescenza indiretta su cellule MDCK infettate e non infettate col virus dell’influenza A (ceppo WSN H1N1) a varie diluizioni, per avere un raffronto tra i due test. Per quanto riguarda inoltre la stabilità della proteina si è osservato che l’aggiunta dell’inibitore delle serin proteasi (PMSF: 34.8 µg/ml) nelle dosi consigliate dal protocollo non era sufficiente a garantirci la richiesta stabilità dell’anticorpo. La dose dell’inibitore è stata quindi triplicata ed è stata inoltre ulteriormente stabilizzata con l’aggiunta di un appropriato cocktail di inibitori di proteasi (come precedentemente indicato) che viene aggiunto in diversi passaggi della preparazione e di conservanti. Inoltre l’anticorpo una volta purificato è stato immediatamente congelato a -80°C sino al momento dell’uso. Si è anche valutata la stabilità dell’anticorpo congelato in raffronto a quella all’anticorpo liofilizzato. Non sembrano al momento esserci differenze sostanziali tra i due metodi. Si è comunque accertato che per lo meno nel breve periodo (al massimo un mese) la minore perdita di attività si realizza con la conservazione a 4°C. Verifica dell’attività dell’anticorpo Test ELISA Le produzioni sono state saggiate con il test ELISA. Delle produzioni iniziali sono stati saggiati sia il Fab appena ottenuto (grezzo) sia una volta purificato. In seguito, nelle produzioni dell’ultimo periodo, sono stati saggiati attraverso i test ELISA soltanto i purificati. Nelle prove iniziali del progetto sono stati utilizzati come antigene (Ag) sia virus purificato sia campioni di tamponi faringei.Per le prove successive è stato utilizzato come antigene sempre il virus purificato tal quale o diluito (in bicarbonato 0,05 M pH9.6) 1:10 e 1:100. Il legame con la piastra è avvenuto O/N a 4°C. Il giorno seguente è stato aggiunto il Fab purificato (t.q., diluito 1:10 e 1:100) e, per la maggior parte delle produzioni, non purificato (t.q.) per 90 min a 37°C, oltre che i relativi controlli. Sono stati fatti 10 lavaggi con PBS-Tween allo 0,05% e quindi è stato aggiunto l’anticorpo secondario perossidato (Anti-human Fab specific PEROX SIGMA). Nuovamente sono stati fatti i lavaggi come indicato prima ed è stato aggiunto il substrato. Sono state fatte quindi delle letture a 450 nm dopo 30 e 45 minuti. Dal test è risultato positivo sia il Fab grezzo che quello purificato. In figura è mostrato il test elisa effettuato sul fab prodotto in due successive purificazioni. Nella prima riga sono testate tutte le frazioni di purificato appena prodotto, nella seconda riga le frazioni di Fab purificati da una settimana e conservate congelate a -80 °C. Si osserva una perdita di attività anche se non molto rilevante (Figura 1. e Tabella 1).
Colonne
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Righe
A:
Frazioni
raccolte
di Fab
purificato
B:
Frazioni
raccolte
di Fab
purificato
e
congelato
C:
Controllo
Figura 1. Test ELISA delle frazioni raccolte di Fab purificato.
Nella figura si osserva nella prima riga della piastra la risposta delle frazioni 1 – 12 raccolte
durante la purificazione. In questo caso la maggiore attività si è avuta per le frazioni 5 e 6,
attività minore per le frazioni 4 e 7 e ancora minore per le frazioni successive alla 7. Nella
seconda riga si osserva la risposta delle tre migliori frazioni della purificazione eseguita la
settimana precedente e di alcune frazioni negative. Nella riga C è un controllo negativo (BSA)
Tabella 1. In tabella sono riportati i dati numerici dell’ELISA rappresentata nella Figura 1.
Colonne
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Righe
A O,004 0,003 0,004 0,089 0,115 0,114 0,097 0,044 0,033 0,022 0,021 0,022
B 0,099 0,103 0,056 0,005 0,007 0,006 0,006 0,004 0,005 0,004 0,006 0,002
C 0,002 0,003 - 0,004 - 0,001 0,002 - 0,004 0,007 0,006 0,003
0,005 0,007 0,004Risultati ottenuti nell’ambito della fase
In questa fase è stato ottenuto il Fab sia allo stato grezzo, che purificato nella quantità
complessiva di una dozzina di milligrammi.
Poiché la stabilità dell’anticorpo nel tempo è un fattore cruciale si è lavorato all’ottimizzazione
di questo punto. È stata migliorata la stabilità dell’anticorpo, agendo sulla aggiunta di inibitori
delle proteasi durante la produzione, e sulla tecnica di conservazione. Dai risultati si può
notare che sulle frazioni raccolte si osserva, per quanto ridotta, una conservazione dell’attività
dopo un periodo di conservazione.
Di tutte le produzioni è stata saggiata l’attività. Il Fab in tutte le prove eseguite si è dimostrato
attivo sia sui campioni di cellule MDCK infette sia sui campioni di tamponi faringei.
Si è migliorata la produzione dell’anticorpo anche se le produzioni di Fab mantengono
comunque una certa variabilità come raccolta. Si è invece potuta migliorare la stabilità
dell’anticorpo alla conservazione .
Grado di raggiungimento degli obiettivi prefissati, scostamenti
rispetto al progetto ed eventuali criticità evidenziate
L’obiettivo è stato raggiunto in termini di produzione di Fab attivo, di maggiore
standardizzazione delle produzioni e di maggiore stabilità del prodotto.
Attività ancora da realizzare
Attività completata.
3.2 Fase B
TITOLO FASE B
Immunofluorescenza indiretta
Descrizione delle attività realizzate
Il lavoro di seguito descritto è stato realizzato presso i laboratori del Dipartimento di Scienze e
Tecnologie Biomediche - Sezione di Microbiologia applicata dalle Dott.sse Laura Bifulco e Samuela
Laconi sotto la supervisione del Prof. Raffaello Pompei.
Immunofluorescenza indiretta
Il Fab è stato saggiato anche in immunofluorescenza indiretta utilizzando cellule MDCK
infette e non infette col virus dell’influenza A (ceppo WSN- H1N1) così come descritto nella
relazione precedente. Non si è ritenuto di dover ripetere ulteriori prove essendo i dati ottenuti
precedentemente già sufficientemente significativi. Alcuni risultati ottenuti col protocollo
indicato nella relazione precedente sono riportati nelle Tabelle 2 A e B.
Tabella 2 – A – Test di immunofluorescenza su cellule MDCK infettate e non, in presenza o
assenza di Fab anti influenza A.Risultati prove con il Fab fluorescenza
estratto grezzo
MDCK (-) non inf. Senza siero -
MDCK (+) inf. Senza siero ++
MDCK non inf. con siero -
MDCK (+) inf. siero ++
Tamponi faringei con siero -/+
Tabella 2 - B
Risultati prove con il Fab fluorescenza
purificato
MDCK (-) non inf. Senza siero -
MDCK (+) inf. Senza siero +++
MDCK non inf. con siero -
MDCK (+) inf. siero +++
Tamponi faringei con siero -/+
Legenda: - nessuna attività; + debole attività; ++ media attività; +++ massima attività
I dati nel caso della fluorescenza sono stimati in base alle osservazioni microscopiche e non
sono pertanto quantificabili numericamente.
Risultati ottenuti nell’ambito della fase
Il Fab sia come estratto grezzo sia purificato è risultato positivo alle prove in fluorescenza,
perciò attivo sia sui campioni di cellule MDCK infettate, che sui tamponi faringei di pazienti
infetti.
Grado di raggiungimento degli obiettivi prefissati, scostamenti
rispetto al progetto ed eventuali criticità evidenziate
L’obiettivo prefissato di questa fase era un ulteriore controllo dell’attività dell’anticorpo
monoclonale. Si è voluto testare l’anticorpo sia sull’antigene prodotto nelle cellule infettate in
vitro, sia sui campioni clinici. Tale obiettivo è stato raggiunto.
Attività ancora da realizzare
Non ci sono altre attività da realizzare.
3.3 Fase CTITOLO FASE C Coniugazione-Fab-Fluoresceina
Descrizione delle attività realizzate
Il lavoro di seguito descritto è stato realizzato presso i laboratori del Dipartimento di Scienze e
Tecnologie Biomediche - Sezione di Microbiologia applicata dalle Dott.sse Laura Bifulco e Samuela
Laconi sotto la supervisione del Prof. Raffaello Pompei.
Marcatura con FITC
Per poter marcare l’anticorpo è stato necessario produrre circa 2 mg di proteina purificata
che è stata dializzata contro PBS e concentrata fino a 1 mg/ml con il VIVASPIN 20 (SIGMA). Il
Fab così ottenuto è stato marcato con la fluoresceina utilizzando il kit Fluorescein labeling della
Roche. Il Fab marcato (Fab*) è stato quindi purificato con una colonna cromatografica
Sephadex G-25. In particolare sono state raccolte 10 frazioni da 0.5 ml , che sono state
osservate a 280 nm allo spettrofotometro. Da una prima analisi circa 1/5 della proteina totale
viene raccolta nella 7° frazione. L’anticorpo così marcato è stato saggiato in
immunofluorescenza diretta (Tabella 3). Queste prove sono utili come sistema di raffronto in
previsione della marcatura del Fab con la perossidasi per la costruzione
dell’immunobiosensore.
Tabella 3 - Prove di coniugazione Fab-fluoresceina
Immunofluorescenza diretta
Anticorpo MDCK Infette MDCK non infette
Fab-FITC + -
Fab non coniugato - -
Legenda: (-) test negativo; (+) test positivo;
Anche in questo caso la valutazione della positività del test è una stima effettuata mediante le
osservazioni microscopiche al microscopio a fluorescenza.
Risultati ottenuti nell’ambito della fase
La coniugazione del Fab è risultata positiva sia in termini di avvenuta coniugazione sia in
termini di attività residua del Fab coniugato.
Grado di raggiungimento degli obiettivi prefissati, scostamenti
rispetto al progetto ed eventuali criticità evidenziate
L’obiettivo prefissato si considera pienamente raggiunto. L’unica criticità rilevabile è che i
materiali patologici usati (tamponi faringei) hanno dato segnali piuttosto deboli, ma questo
dipende dal prelievo e dal numero di cellule presenti. Bisogna standardizzare meglio i prelieviAttività ancora da realizzare
Nessuna azione da proseguire in questa attività.
Fase D
TITOLO FASE D Preparazione dell’antigene
Descrizione delle attività realizzate
Il lavoro di seguito descritto è stato realizzato presso i laboratori del Dipartimento di Scienze e
Tecnologie Biomediche - Sezione di Microbiologia applicata dalle Dott.sse Laura Bifulco e Samuela
Laconi sotto la supervisione del Prof. Raffaello Pompei.
Purificazione del virus dell’influenza A sierotipo H1N1
Per la preparazione del virus è stata allestita una coltura cellulare con cellule MDCK infettate
con il virus dell’influenza A ceppo WSN sierotipo H1N1. Inizialmente sono state preparate 2
fiasche da 75 ml. Una fiasca è stata infettata con il virus e l’altra è stata utilizzata come
controllo negativo. Le cellule dopo 48 h dall’infezione sono state congelate a –80°C. Dopo una
fase di congelamento-scongelamento, la coltura è stata centrifugata (4000 rpm) e il surnatante
è stato messo in agitazione con il PEG 8000 a 4°C O/N. Il giorno successivo la soluzione PEG-
virus è stata centrifugata (2500 rpm per 45 min a 4°C) e il pellet è stato risospeso in 10 ml di
PBS e prontamente utilizzato in taluni casi o altrimenti congelato sino al momento dell’uso.
Risultati ottenuti nell’ambito della fase
E’ stato ottenuto l’antigene sotto forma di virus H1N1 purificato nella quantità desiderata.
Tale quantità è stata calcolata in 109 virus/ml dopo la concentrazione con il PEG.
L’antigene prodotto è stato utilizzato in tutti i successivi saggi sia per i test ELISA, per le prove
in fluorescenza sia per i saggi immunologici amperometrici.
Grado di raggiungimento degli obiettivi prefissati, scostamenti
rispetto al progetto ed eventuali criticità evidenziate
L’obiettivo è stato completamente raggiunto.
Attività ancora da realizzare
Attività completata.
3.4 Fase E, F e H
TITOLO FASE E, F e H
Coniugazione Fab-Enzima e valutazione
dell’attività del coniugato e della suastabilità Descrizione delle attività realizzate Il lavoro di seguito descritto è stato realizzato presso i laboratori del Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche - Sezione di Microbiologia applicata dalle Dott.sse Laura Bifulco e Samuela Laconi sotto la supervisione del Prof. Raffaello Pompei. Prove di marcatura con l’enzima Perossidasi Per poter marcare l’anticorpo è stato necessario produrre diversi milligrammi di proteina purificata, che è stata dializzata contro PBS e quindi concentrata fino a 4 mg/ml con il VIVASPIN 20 (SIGMA). Il Fab così ottenuto è stato marcato con la Perossidasi utilizzando il Peroxidase Labeling kit della Roche. Il Fab marcato (Fab*) non è stato ulteriormente purificato. Per la purificazione non si è ritenuto necessario un ulteriore passaggio in colonna cromatografica Sephadex G-25. Infatti in accordo con il protocollo indicato è possibile usare il Fab* marcato anche senza purificazione. Controllo della avvenuta marcatura Il Fab coniugato è stato testato sia in elettroforesi (Figura 2) per valutare l’avvenuta marcatura sia in Elisa. Elettroforesi I coniugati, il Fab libero e la perossidasi libera sono stati preparati con il colorante Laemli non denaturante, fatti correre a voltaggio di 130-150 Volt su SDS gel di poliacrilammide SDS. Al termine della corsa dopo 50 -60’ il gel è stato colorato con Coomassie Brilliant Blue R250 e decolorato con una soluzione decolorante di metanolo e acido acetico glaciale . Il Fab e la perossidasi sono proteine il cui peso molecolare è attorno ai 35 - 40 Kdalton ciascuna. Il coniugato presenta quindi un peso molecolare di 75 – 80 Kdalton.
Pozzetti 2 e 3 Coniugati Pozzetto 5 Pozzetto Pozzetto 8
Fab-perossidasi Marker 6 Peros- Fab
sidasi
Figura 2. Immagine del gel elettroforetico: si osservano le bande dei coniugati (pozzetti 2 e 3),
e i controlli, perossidasi (pozzetto 6) e Fab (pozzetto 8).
Dalla figura si può osservare l’avvenuta coniugazione. Nei primi pozzetti infatti si osserva una
sola banda all’altezza dei 75KD mentre non si osservano bande all’altezza dei 35 – 40 KD come
nei pozzetti di controllo
Test ELISA
I test ELISA sono stati condotti secondo la metodica sopra riportata, per valutare l’attività del
coniugato (Tabella 4). I dati riportati in tabella si riferiscono al test eseguito subito dopo la
coniugazione. I test ELISA sono stati effettuati anche dopo periodi di conservazione a -80°C
del coniugato per valutarne la stabilità.Tabella 4 – Analisi quantitativa dell’attività del complesso Fab/Perox. Letture allo
spettrofotometro a 450 nm dopo 45 minuti
Prove ELISA – Fab coniugato con la per ossidasi
Fab-perox Fab non C Fab –perox Fab non C
coniugato 1:10 coniugato
1:10
MDCK 0,078 0,009 0,008 0,015 0,008 0,007
infette
MDCK non 0,012 0,004 0,005 0,005 0,007 0,006
infette
BSA 0,006 0,002 0,005 0,006 0,007 0,007
Legenda: (Fab – perox)= Fab coniugato con la perossidasi; (C) controllo negativo.
Valutazione della stabilità del coniugato
I test ELISA sono stati ripetuti dopo un periodo di conservazione del coniugato Fab-perossidasi.
Il coniugato ha mostrato un’attività piuttosto debole, anche se significativa rispetto al
controllo. C’è da rilevare che la conservazione a –80° influisce negativamente sulla già non
molto elevata attività del coniugato.
Risultati ottenuti nell’ambito della fase
Sono state eseguite marcature del Fab con la perossidasi. I dati sono significativi per quanto
riguarda la formazione del coniugato.
Per quanto riguarda l’attività del Fab coniugato con la perossidasi e la sua stabilità, i risultati
sono stati finora non sufficientemente significativi sia dal punto di vista qualitativo che
quantitativo, in quanto, pur formandosi un coniugato con le dimensioni attese, la sua attività
specifica nel riconoscere l’antigene è debole.
Grado di raggiungimento degli obiettivi prefissati, scostamenti
rispetto al progetto ed eventuali criticità evidenziate
Il complesso Fab-Perox si forma in quantità elevata.
L’attività specifica del coniugato è debole e presenta una eccessiva variabilità rispetto alle
necessità richieste dal funzionamento del sistema.
Attività ancora da realizzare
Occorre riverificare tutte le fasi del protocollo di coniugazione per valutare quale sia la fase di
maggiore criticità al fine dell’ottenimento di un prodotto più attivo e più stabile. Visto che il Fab
coniugato con la perossidasi non risulta sufficientemente stabile per un significativo
funzionamento del sistema programmato, ci si propone di verificare anche l’uso di anticorpi
commerciali al fine di ottenere un risultato stabilmente positivo.
3.5 Fase ITITOLO FASE I Prove in amperometria con la perossidasi Descrizione delle attività realizzate Il lavoro di seguito descritto è stato realizzato presso i laboratori del Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche - Sezione di Microbiologia applicata dalla Dr. Laura Bifulco sotto la supervisione del Prof. Raffaello Pompei. Prove con l’enzima Perossidasi in amperometria Per la produzione dell’immunosensore oggetto della presente ricerca con il Fab coniugato con la perossidasi occorre effettuare uno studio sull’attività elettrochimica della perossidasi in presenza del suo substrato al fine di costruire una curva di calibrazione. A tale scopo sono state eseguite prove preliminari qualitative in amperometria. E stato utilizzato un sistema a tre elettrodi concepito nel seguente modo: elettrodo di riferimento a calomelano saturo, elettrodo di lavoro a carbone vetroso ed elettrodo contatore di platino. Le prove sono state fatte sia con l’enzima in soluzione, utilizzando diverse concentrazioni di enzima, sia immobilizzando l’enzima sulla superficie dell’elettrodo di lavoro. Non sono state eseguite con questo sistema prove quantitative. Il substrato utilizzato è stato il perossido di idrogeno. Il mediatore redox utilizzato è stato Il TTF (tetrathiafulvalene), che non essendo solubile in acqua è stato immobilizzato per semplice deposizione alla superficie dell’elettrodo in tutti i casi, sia col sistema in soluzione sia col sistema immobilizzato. La risposta si è registrata già a partire dal sistema in soluzione. L’enzima è stato preparato in soluzione 2,5 mg in 200 µl di PBS a pH 7.0 immediatamente prima dell’uso. Si è fatta anche una prova con l’enzima immobilizzato sulla superficie dell’elettrodo di carbone vetroso. L’immobilizzazione dell’enzima perossidasi è stata effettuata mediante deposizione di 20 µl di una soluzione enzima-BSA in buffer Tris maleato a pH 7.0 e successivo cross-linking con la glutaraldeide. Le prove effettuate con il sistema immobilizzato sono state positive. L’elettrodo modificato ha manifestato risposta positiva anche dopo essere stato conservato per tre giorni al buio a 4°C. Le prove successive immunologiche amperometriche sono state effettuate utilizzando elettrodi stampati di pasta di carbone gentilmente forniti dall’Università di Firenze dalla dott.ssa Ilaria Palchetti del gruppo del Professor Marco Mascini. Risultati ottenuti nell’ambito della fase Sono state eseguite prove di misurazione del substrato perossido di idrogeno con l’enzima
perossidasi, sia in soluzione, sia immobilizzato sulla superficie dell’elettrodo. Le curve hanno
registrato una risposta positiva.
Grado di raggiungimento degli obiettivi prefissati, scostamenti
rispetto al progetto ed eventuali criticità evidenziate
I risultati sono quantitativamente significativi.
Attività ancora da realizzare
Attività completata
3.6 Fase L
TITOLO FASE L
saggi immunologici amperometrici
Descrizione delle attività realizzate
Il lavoro di seguito descritto è stato realizzato presso i laboratori del Dipartimento di Scienze e
Tecnologie Biomediche - Sezione di Microbiologia applicata dalla Dott.ssa Laura Bifulco sotto la
supervisione del Prof. Raffaello Pompei.
Saggi immunologici amperometrici
Il Fab è stato saggiato in amperometria utilizzando elettrodi stampati in cui l’elettrodo di
lavoro è in pasta di carbone. Gli elettrodi sono stati lavati e quindi testati in voltammetria
ciclica per valutare la bontà di ciascun elettrodo ed evitare interferenze nella finestra di lavoro
necessaria. Sono state eseguite quindi delle prove sempre in voltammetria ciclica con
l’elettrodo modificato con l’enzima perossidasi lasciato adsorbire sulla superficie dell’elettrodo
nudo allo scopo di conoscere il potenziale di lavoro più idoneo con tale sistema. In tali
condizioni il potenziale al quale si è presentato il picco di riduzione del substrato perossido di
idrogeno è stato a -0,0052 mV (Tabella 5 a e b)Tabella 5a - I parametri di lavoro senza mediatore redox
Parametri Valori
Temperatura 25 °C
pH 7.0
Potenziale imposto -0,052 mV
Tabella 5 b - I parametri di lavoro in presenza del mediatore redox
Parametri Valori
Temperatura 25 °C
pH 7.0
Potenziale imposto -0,152 mV
TTF conc. 10 mg/ml acetone 30 µl
In presenza o assenza del mediatore redox TTF si osserva uno shift del picco di riduzione del
substrato. Poiché si è osservata nelle prove preliminari fatte con gli elettrodi stampati una
risposta sufficiente anche in assenza del mediatore redox, per le successive prove
immunologiche amperometriche si è deciso di non utilizzare tale mediatore per evitare possibili
problemi di tossicità nei confronti delle componenti biologiche utilizzate.
Gli elettrodi per le successive prove immunologiche amperometriche sono stati quindi preparati
utilizzando il Fab purificato preparato al momento. Come antigene è stato utilizzato il virus
influenzale purificato tal quale. Il legame tra il virus e la superficie degli elettrodi è avvenuto
O/N a 4°C. Il giorno seguente è stato aggiunto il Fab purificato t.q. ed è stato fatto avvenire il
contatto per 90 min a 37°C. Gli elettrodi sono quindi stati lavati con PBS-Tween allo 0,05% e
è stato aggiunto l’anticorpo secondario perossidato (Anti-human Fab specific PEROX SIGMA) e
tenuto a contatto per 45’ a 37°C. Gli elettrodi sono stati nuovamente lavati come indicato
prima.
Per i controlli (bianchi) sono state preparate due serie di elettrodi:
- una prima serie che presentava l’antigene immobilizzato, nella quale era stato fatto avvenire
il contatto con il Fab, ma non con l’anticorpo secondario perossidato (commerciale)
- e una seconda serie di elettrodi, che presentava l’antigene immobilizzato, al quale non era
stato legato il Fab, ma era avvenuta la reazione con il secondario perossidato.Gli elettrodi così modificati sono stati testati in crono-amperometria secondo i parametri
indicati nella tabella precedente ( T. 5), effettuando aggiunte di 10 µl di una soluzione di
perossido di idrogeno a 12 vol.
In Figura 3 si può osservare che le risposte alla presenza del substrato perossido di idrogeno
(media di 3 elettrodi) sono comparabili se si considerano quelle dei due bianchi mentre è stata
superiore quella degli elettrodi (media di 3 elettrodi) preparati con il sistema completo.
Interessante notare che le risposte per la medesima preparazione del Fab purificato
rispecchiano i risultati del test ELISA. Anche le prove eseguite con gli elettrodi preparati con il
Fab purificato appena prodotto e quello purificato e conservato congelato a -80 °C per una
settimana rispecchiano un andamento analogo ai test ELISA.
Immunoamperometria
0,00E+00
1 13 25 37 49 61 73 85 97 109 121 133 145 157 169 181 193 205 217 229 241 253 265 277 289 301 313 325 337 349 361 373 385
-2,00E-08
-4,00E-08
-6,00E-08
microA
-8,00E-08
-1,00E-07
-1,20E-07
-1,40E-07
tempo (s)
Bianco no AbII Fab Bianco no Fab
Figura 3. Prove in immuno-amperometria. Tracciati giallo e azzurro: controlli; tracciato viola:
prova in presenza del Fab anti-Influenza A purificato.
RISULTATI FINALI OTTENUTI NELLE PROVE AMPEROMETRICHE
1 – Visto che il complesso perossidasi-Fab ha mostrato problemi di stabilità sono state eseguite
prove immunologiche amperometriche utilizzando il Fab anti influenza A prodotto nel nostro
laboratorio, associato con un anticorpo commerciale anti-Fab perossidato come secondario.2 – I risultati ottenuti mostrano che rispetto ai controlli con virus e anticorpo commerciale, ma
senza Fab, e con virus ma con Fab, senza l’anticorpo secondario perossidato, la risposta
amperometrica nella prova eseguita col Fab anti-Influenza A prodotto in questo lavoro è
chiaramente determinabile e differenziabile come risposta elettrochimica alla presenza del
substrato.
3 – Pertanto questo sistema può essere proposto per una diagnosi rapida di presenza
di virus Influenzale A in un materiale patologico, come test alternativo o integrativo
dei comuni test in ELISA.
Ovviamente occorre perfezionare il test ed utilizzarlo per saggiare un congruo numero di
materiali patologici ( espettorati, lavaggi bronchiali, tamponi faringei, tamponi di muco nasale
etc.) prelevati da individui con sospetta influenza, per accertare che i materiali organici
presenti non interferiscano con i segnali amperometrici .
Risultati ottenuti nell’ambito della fase
Grado di raggiungimento degli obiettivi prefissati, scostamenti
rispetto al progetto ed eventuali criticità evidenziate
Gli obiettivi fissati sono stati parzialmente raggiunti.
Vista la debole attività del coniugato Fab anti-influenza-perossidasi, si è ricorsi per la modifica
degli elettrodi al Fab associato all’uso di anticorpi commerciali anti-Fab. Tale sistema ha
mostrato caratteristiche qualitative e quantitative sufficientemente apprezzabili nei test
amperometrici messi a punto in questo lavoro.
Tuttavia i test amperometrici effettuati in questo progetto hanno dimostrato che il Fab da noi
prodotto verso antigeni del virus di Influenza A può essere efficacemente utilizzato per la
messa a punto dell’immunosensore, a patto che sia associato ad un anticorpo commerciale
coniugato con perossidasi.
Attività ancora da realizzare.
Le prove previste sono terminate e il programma è stato completato.
3.7 Fase M
TITOLO FASE M Prove preliminari immobilizzazione
Descrizione delle attività realizzateIl lavoro di seguito descritto è stato realizzato presso i laboratori del Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche - Sezione di Microbiologia applicata dalla Dott.ssa Laura Bifulco sotto la supervisione del Prof. Raffaello Pompei. Immobilizzazione Per questa fase si rimanda ai materiali e metodi e risultati riportati nella fase I Risultati ottenuti nell’ambito della fase Si è ottenuto un enzima immobilizzato su elettrodi a carbone vetroso. Grado di raggiungimento degli obiettivi prefissati, scostamenti rispetto al progetto ed eventuali criticità evidenziate L’obiettivo è stato raggiunto, anche se poi il metodo finale ha richiesto delle sostanziali variazioni rispetto alle prove programmate. Attività ancora da realizzare Prove terminate.
4- Consulenze attivate
Riportare nella tavola che segue l’elenco delle consulenze specialistiche attivate
N. Organizzazione Nome risorsa attivata
1 Dipartimento di Scienze e Prof. Raffaello Pompei
Tecnologie Biomediche - Sezione Dott,ssa Samuela Laconi
di Microbiologia applicata
2 Dr Laura Bifulco
3
4
5
Per ognuna delle consulenze riportate sopra descrivere l’attività svolta
N. Descrizione dell’attività svolta Utilizzato nell’ambito della fase
1 Coltivazione del E. coli trasformato ed estrazione del Fab A - Produzione del Fab
2 Preparazione colonna cromatografia e purificazione del Fab A - Purificazione Fab
3 Stabilizzazione del Fab A – Purificazione del Fab
4 Prove ELISA per determinare attività del Fab A – Purificazione del Fab
5 Prove in immunofluorescenza indiretta su cellule MDCK B - Immunofluorescenza indiretta
6 Coniugazione Fab purificato con la fluoresceina C - Coniugazione-Fab-Fluoresceina
7 Prove in immunofluorescenza diretta su cellule MDCK C - Coniugazione-Fab-Fluoresceina
8 Coltivazione di virus Influenza A-WSN in cellule MDCK
Purificazione del virus. D -Preparazione antigene
9 Prove di attività e di stabilità del coniugato Fab-perossidasi E - Coniugazione Fab-Enzima
10 Prove con l’enzima in fase liquida.
Immobilizzazione dell’enzima
Prove con l’enzima immobilizzato F – Prove in amperometria con la perossidasi
5- Grado di utilizzo delle risorse tecniche
5.1 Utilizzo di attrezzature e laboratori esterni
Laboratorio
N. (denominazione Descrizione dell’attività realizzata Utilizzato nell’ambito della fase
e sede)
1 Dipartimento
di Scienze e
Tecnologie Microscopio, spettrofotometro, centrifuga,
Biomediche Incubatore, sonicatore, bagnomaria,
- Sezione di A - Purificazione Fab freezer a -80°C, cappa a flusso laminare,Microbiologia
applicata
2 microscopio a fluorescenza, frezer,
B - Immunofluorescenza indiretta incubatore,
3 microscopio a fluorescenza, bagnomaria,
C - Coniugazione-Fab-Fluoresceina cella fredda,
4 incubatori a C02
D -Preparazione antigene centrifughe, freezer a -80°C
5 E - Coniugazione Fab-Enzima Spettrofotometro, centrifughe, cella frigo
6 F – Prove in amperometria Autolab, cella frigo
5.2 Acquisto di strumentazione e licenze
In riferimento alle attività svolte giustificare l’acquisto e l’utilizzo delle strumentazioni e delle licenze;
indicare inoltre per quali fasi progettuali sono state utilizzate.
Utilizzata
Descrizione Giustificazione della necessità %
N. nell’ambito
dell’attrezzatura/licenza dell’attrezzatura/licenza utilizzo
della fase
1
2
3
4
5
5.3 Altre risorse tecniche
Descrivere eventuali altre risorse tecniche utilizzate
Per effettuare le prove amperometriche e immunologico-amperometriche è stato utilizzato il
potenziostato AUTOLAB della ECHOCHEMIE presso i laboratori di Chimica del Dipartimento
di Scienze Chimiche dell’Università di Cagliari
6- Risultati ottenuti nel progetto
Elencare sinteticamente ma in modo accurato i risultati ottenuti complessivamente nel progetto, incluse
eventuali pubblicazioni, numerandoli a partire dal più importante
n. Descrizione del risultato ottenuto
1 Fab umano ricombinante purificato
2 Fab umano ricombinante stabilizzato
3 Test immunofluorescenza indiretta positivo con Fab anti-Influenza A.
4 Coniugato Fab-fluoresceina attivo su immunofluorescenza diretta.
5 Coniugato Fab-enzima perossidasi debolmente attivo.
6 Fab fluorescinato in grado di riconoscere il virus dell’Influenza A (possibile sistema
diagnostico).
7 Prove positive di attività della perossidasi immobilizzata.8 Prove immunologiche-amperometriche positive per determinare la presenza di
virus o anticorpi anti-Influenza A per la costruzione di un immunosensore ad
uso diagnostico
7- Criticità incontrate durante la realizzazione dell’attività
(Criticità tecnico-scientifiche, Criticità gestionali, Criticità
finanziarie)
- Il Fab anti-influenza A lo si è dovuto produrre in quantità elevate durante tutte le fasi dello
studio. Nelle fasi iniziali si è riscontrata una scarsa stabilità dell’anticorpo purificato. I protocolli
di produzione e purificazione dell’anticorpo infatti non prevedevano delle fasi di stabilizzazione.
- E’ importante che le analisi sia in fluorescenza che in ELISA siano eseguite col Fab purificato.
- Le prove eseguite col coniugato Fab-perossidasi hanno dato segnali deboli rispetto al
controllo eseguito con l’anticorpo commerciale.
- Le prove di immobilizzazione della perossidasi hanno dato risultati positivi. Tuttavia il
coniugato Fab-perossidasi ha mostrato attività piuttosto debole nell’interagire con l’antigene
specifico e si è dimostrato poco adatto alla immobilizzazione su elettrodi stampati.
- Le prove amperometriche finali sono state eseguite con Fab purificato non
coniugato e antigene virale purificato. Il sistema è stato rivelato mediante
anticorpi commerciali anti-Fab umano coniugati con perossidasi.
- In queste condizioni si sono ottenuti risultati chiaramente positivi per una
reazione elettrochimica indicativa della presenza del complesso Virus
Influenzale-Fab adesi all’elettrodo stampato.
8- Altre informazioni
Riportare qui eventuali altre informazioni non contenute nei punti precedenti
9- Considerazioni finali
Riportare qui ogni considerazione che si ritiene utile inviare a Sardegna Ricerche
- Tutte le fasi del progetto sono state portate a termine secondo il programma
previsto.
- Tutte le fasi hanno portato a risultati positivi per quanto riguarda preparazione del
Fab e dell’antigene virale e per i processi di coniugazione Fab-fluorescina e Fab-
perossidasi.
- La fase F ha portato a risultati parzialmente positivi, in quanto il coniugato Fab-
perossidasi, pur essendosi formato in quantità rilevante, si è dimostrato poco attivo
e ha determinato segnali deboli quando messo a contatto col substrato specifico.- Questo fatto ha reso necessario inserire una variante nelle fasi successive (G-H-I-
L) per la valutazione preliminare dei saggi amperometrici da eseguire con elettrodi
stampati su cui dovevano essere adesi i Fab-perossidati.
- Si è ricorso all’uso di anticorpi commerciali anti-Fab umani-coniugati con la
perossidasi, che si sono dimostrati perfettamente efficienti nel riconoscere il
complesso Fab-virus Influenzale: la reazione chiaramente determinabile sia
qualitativamente che quantitativamente, ha permesso di ottenere dei tracciati in un
apparato immunologico-amperometrico a parametri standardizzati, in grado di
rivelare con una certa rapidità la presenza di anticorpi anti-Influenza A in un siero, o,
variando il sistema adeso all’elettrodo, di determinare virus influenzali in materiali
patologici idonei.
Firma del legale rappresentante
Prof. Gaetano Di Chiara
Firma del coordinatore scientifico del progetto
Prof. Raffaello Pompei
Data
21/10/2008Puoi anche leggere
