Separa e identifica gruppo 2 - Lavoro a cura di: Ceroni Manuela Romano Laura Scalera Giulia Ursomanno Giulia - Istituto Superiore Statale Pitagora
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Separa e identifica gruppo 2 Lavoro a cura di: Ceroni Manuela Romano Laura Scalera Giulia Ursomanno Giulia
I plasmidi batterici Piccole molecole di DNA circolare, composti da 1000 a 200.000 coppie di basi sono presenti in più copie separate dal DNA cromosomico. Laboratorio 2 di ABE Scopo = formare plasmide Vettori ideali per ingegneria genetica: ricombinante (pARA-R) che • Capacità di replicare a partire dal sito ori produce proteine fluorescente • Capacità di iniziare la trascrizione grazie al promotore rossa nei batteri • Contengono un gene o più che codificare per la resistenza agli antibiotici Per clonare il gene della proteina fluorescente rossa (rpf) ci • Posso essere trasmessi da un ceppo batterico all’altro grazie serve il DNA di due plasmidi diversi: alla coniugazione batterica • Plasmide pKAN-R che porta il gene che rende i batteri resistenti alla kanamicina, il gene del rfp, promotore • Plasmide pARA che contiene il gene che rende i batteri promotore resistenti all’ampicillina, una sequenza di DNA che attiva il promotore quando i batteri vengono coltivati con arabinosio, uno zucchero a 5 atomi di carbonio -> sequenza si chiama attivatore di arabinosio araC pKAN-R 5.512 bp Gene per pARA resistenza 4.872 bp agli antibiotici sito ori
La ligasi Enzimi coinvolti nella duplicazione del DNA e nel clonaggio dei geni Il DNA ricombinante è il risultato dell’unione di frammenti provenienti da una digestione con enzimi di restrizione Laboratorio 3 di ABE Scopo = formare plasmide pARA-R sito araC ori Abbiamo unito frammenti di DNA pARA-R prodotti durante il laboratorio 2 5.302 bp pBAD con la DNA ligasi per creare nuovi plasmidi ricombinanti ampR rfp
Elettroforesi su gel Utilizzata per separare e identificare le molecole in base alla loro carica elettrica Questa tecnica sfrutta le cariche presenti nelle molecole di DNA o RNA (caricate negativamente), nel contesto di ingegneria genetica che migrano tramite un gel di agarosio, e il l'elettroforesi su gel è usata per campo elettrico. separare e identificare i plasmidi e brevi frammenti di DNA Nucleotide: •una base azotata (purinica/pirimidinica); •uno zucchero a cinque atomi di carbonio (pentoso), che insieme alla base azotata costituisce un nucleoside; •un gruppo fosfato che, insieme al nucleoside, completa il nucleotide. acido in ambiente acquoso costituito dall'anione fosfato legato ad una molecola organica tramite uno dei suoi quattro atomi di ossigeno
Elettroforesi su gel Struttura dell’apparecchio L'apparecchiatura per l'elettroforesi è composta, fondamentalmente, da tre parti: ALIMENTATORE: fornisce un flusso di corrente continua agli elettrodi applicati alla cella e il DNA, carico (–) a pH neutro, migra verso il polo positivo (anodo) ad una velocità che dipende da equilibrio tra: -forze di spinta del campo elettrico -forze frenanti esistenti CELLA: contiene gel di agarosio e due elettrodi che creano un campo elettrico quando cella viene collegata ad alimentatore SLITTA O LETTINO: apposito alloggio per il gel di agarosio
Gel idrofilo di agarosio è un polisaccaride (zucchero complesso) prodotto dalle alghe (agar) solubile in acqua alla temperatura di ebollizione, mentre diventa solido, in appositi stampi formato da unità di legate alternativamente rettangolari, viene inserito a una estremità dello D-galattosio con legami glicosidici e di 3,6-anidro-L- stampo (quella negativa) un pettine dotato di denti α-(1→3) e β-(1→4) rettangolari (pozzetti) galattosio La struttura tridimensionale dell'agarosio è mantenuta tale tramite la formazione di legami H la sua struttura è una matrice porosa con tanti di fori attraverso i quali passano le soluzioni delle biomolecole biomolecole gel poroso elettroforesi non è l'unico composto utilizzato per i gel infatti biomolecole esistono diversi tipi di supporti utilizzabili: come l'amido o miscele di agarosio e poliacrilmmaide gel poroso
Elettroforesi su gel Azioni che si devono compiere quando si fare un’elettroforesi su gel • Dopo solidificazione del gel pettine viene rimosso e resta scavata sulla superficie del gel una fila di 'pozzetti' • Immergo il gel nella soluzione salina all’interno della cella i pozzetti sono immersi nel liquido conduttore (TBE)* conduzione elettrica lascia invariato il PH • Aggiungiamo al campione di DNA un miscela -glicerolo -un colorante: permettere di valutare quando staccare la corrente • Prelevo campioni di DNA con una pipetta
• Caricamento nei vari pozzetti dei campioni C’è pozzetto con marcatore (marker) costituito da DNA di dimensione note standard di riferimento • Chiudo coperchio della cella • Genero campo elettrico Corsa elettroforetica Voltaggio di 100 V frammenti di DNA o RNA lentamente migrano verso il polo positivo • Si stacca la corrente Prima che il DNA esca fuori dal gel Il risultato mostra bande (o bandeggi) *TEMPISTICHE 20-30 minuti rettangolari (forma del pozzetto) luminose.
Corsa Elettroforetica frammenti di DNA migrano verso il polo positivo muovendosi tra i reticolati dell'agarosio. I parametri che influenzano la velocità di migrazione sono: In genere ha una durata di ❑ Dimensioni del filamento (lunghezza del frammento) 20-30 minuti, un’intensità di 100 V ❑ Concentrazione di agarosio nel gel per gel 0,8% agarosio e frammenti di 100-1000 bp. ❑ Conformazione dell'acido nucleico (Con Agarosio non ❑ Voltaggio applicato: generalmente sui 100 V ma quanto più è alto il bisogna superare i 150- voltaggio, maggiore sarà la velocità di migrazione 200 V perché si rischia di sciogliere il gel) ❑ Temperatura (influenza l'energia cinetica di tutto il sistema) RISULTATO: i frammenti restano incastrati nelle maglie di agarosio. Non sono visibili ad occhio → colorare i frammenti di acidi nucleici con coloranti intercalanti le bande più lontane sono costituite Mostra bande rettangolari luminose: ognuna è dai frammenti più piccoli di acidi costituita da tutti i frammenti di DNA della stessa nucleici, poiché riescono a passare lunghezza (indipendentemente dalla sequenza in bp). più agevolmente attraverso il gel
Conformazione dei frammenti di DNA LINEARE SUPERAVVOLTO • Non presenta • Forma molto compatta ripiegamenti/riavvolgimenti • Migra attraverso il gel molto rapidamente • Nel gel agarosio migra con una • Conformazione naturale che si trova nelle velocità media cellule batteriche CERCHIO RILASSATO MULTIMERO • Rottura di uno dei legami covalenti situati nello scheletro zucchero-fosfato • Unioni di più plasmidi lungo uno dei due filamenti • Plasmidi replicati in di nucleotidi batteri • Lenta migrazione • Migra molto lentamente attraverso il gel (anche se attraverso il gel uguale n di coppie di base)
LABORATORIO 4: assicurarsi di aver creato un plasmide ricombinante Esaminare Prodotti della restrizione dei plasmidi pKAN-R e pARA Prodotti della ligasi
Dimensione dei frammenti di DNA Determinate da confronto con DNA ladder miscela di frammenti di = DNA con dimensioni note viene caricato accanto ad altri campioni di DNA Non sono visibili a occhio su gel : in modo da rendere facile il confronto delle bisogna sottoporli a processo di bande dei campioni con le bande del ladder. colorazione I DNA ricombinanti (cioè vettori contenenti i DNA da clonare) vengono inseriti in cellule batteriche. Selezione delle cellule trasfette tramite marckers
Utilizzo pratico: Individuazione di un’impronta genetica ❑ DNA FINGERPRINTING: Analisi condotte analizzando microsatelliti o brevi sequenze ripetute in tandem (STR) Es: ( ) ( ) Tratti di DNA che si ripetono uno di ( ) Per amplificare un frammento di seguito all’altro DNA che contiene sequenze ripetute si individuano le STR Numero di copie di STR utilizzando primer Presenti nel GENOMA UMANO in ogni locus è diverso per ogni individuo Consentono di amplificare singoli microsatelliti Il DNA di un individuo con molte • Indagini forensi ripetizioni produrrà un segmento amplificato più lungo di quello • Test paternità che produrrà quello di una • Identità di resti persona con meno ripetizioni. umani
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