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La rivista è online
16 (3) 2013 Mag/giu
®
ISSN 1127-6312 Bimestrale. Spedizione in abbonamento postale. 70%. Filiale di Milano. EURO 13.35
3
Mag/Giu
2013
• Oryza sativa • Metodi alternativi • Cere •
Rossetto
ad alto
contenuto
in acqua
COSMETIC TECHNOLOGY
Meristemi del riso
Contribuiscono
al ringiovanimento
Articoli
Germano Coppi1, Laura Ceriotti2, Giovanni Talamini3, Marisa Meloni4, Maurizia Dossena5
1 Consulente AFI, S. Martino Siccomario (PV); 2Consulente, Dairago (MI); 3Consulente, Pavia; 4CEO Vitroscreen, Milano;
5Dipartimento di Biologia e Biotecnologia, Università di Pavia - germano.coppi@gmail.com
Dalla Tossicologia classica
ai Metodi alternativi
Parole chiave Riassunto ne oculare e cutanea e gli studi per la
- 3R valutazione della cancerogenesi di un
- Metodi alternativi composto negli animali. In seguito ai
- Validazione Negli studi tossicologici sui farmaci gravi problemi prodotti dall’uso della
- Cosmetici sono stati da sempre utilizzati differen- talidomide, vennero richiesti dalle au-
- Sostanze chimiche ti specie di animali nell’esecuzione dei torità regolatorie anche studi sulla fun-
- Farmaci vari test indicati dalle agenzie regola- zione riproduttiva e precisamente stu-
torie. L’avvento del principio delle 3R, di sulla fertilità maschile e femminile,
del REACH per le sostanze chimiche, studi di teratogenesi su almeno due
dei dispositivi medici e del 7° emenda- specie di animali e studi di tossicità
mento per i cosmetici, ha portato allo peri- e post-natale sempre nell’anima-
sviluppo di metodi alternativi in vitro. le. Inoltre si rese necessario stabilire dei
criteri di qualità degli studi che furono
In questo lavoro sono stati presi in esa- la base delle Good Laboratory Practices
me i metodi alternativi già validati o (GLP). Ultimamente le autorità rego-
in corso di validazione per cercare di latorie hanno richiesto studi anche sul
From classical eliminare, o almeno di ridurre al mi- potenziale genotossico di un compo-
toxicology nimo, l’uso degli animali negli studi sto con una serie di test in vitro (test di
tossicologici per le sostanze sopraci- Ames, test di aberrazione cromosomi-
to alternative tate. In particolare vengono discussi ca…) ed in vivo (test del micronucleo).
methods i test alternativi per le valutazioni di A questi studi di tossicologia sono stati
irritazione oculare, sensibilizzazione, aggiunti anche studi di safety phar-
Summary irritazione e corrosione cutanea, tossi- macology nell’animale per evidenziare
cità acuta, fototossicità, genotossicità, eventuali altre attività farmacologiche
cancerogenesi, ADME, e tossicità ri- oltre all’azione terapeutica primaria
Animal studies have been always conducted produttiva. del composto in esame.
in toxicology. The incoming of 3R principles,
REACH for chemical substances, medical devi- Oggi per poter registrare un nuovo
ces, and the 7th amendment for cosmetics, have Introduzione farmaco occorre eseguire una lunga e
boosted the development of in vitro alternative alla tossicologia classica costosa serie di studi tossicologici con
methods. l’utilizzo di un gran numero di anima-
Alternative methods just validated or on the La tossicologia classica ebbe la sua li. Numerose sono le linee guida di US
way to be validated to replace or reduce animals origine alla fine del 1800 e si sviluppò Food and Drug Administration (FDA),
in toxicology studies were reviewed. fino al primi 50 anni del 1900. Ven- European Medicines Agency (EMA),
ne introdotto il test chiamato DL50 e International Conference on Harmo-
In particular the alternative methods for the cioè la dose di un composto letale per nisation (ICH) e Organisation for Eco-
evaluation of eye irritation, skin corrosion, il 50% degli animali trattati. Furono nomic Cooperation and Development
skin irritation, skin sensitization, phototoxici- introdotti gli studi di tossicità subacu- (OECD) relative a questi studi; è im-
ty, acute toxicity, genotoxicity, carcinogenicity, ta e cronica per valutare gli effetti dei portante sottolineare che per questi
toxicokinetics/metabolism, and reproductive composti dopo ripetute somministra- studi regolatori è richiesta l’esecuzione
toxicology are discussed. zioni, gli studi per valutare l’irritazio- secondo le GLP.
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Fattori che hanno modifi- Tabella 1 Esempio di riduzione del numero di animali nella cancerogenesi
cato la tossicologia classica Studio classico di cancerogenesi nel ratto con piccolo gruppo per la farmacocinetica (TK)
Dose Bassa Media Elevata Controllo Confronto*
A nostro modo di vedere ci sono stati tre
fattori che hanno messo in discussione gli N° Animali 60 M + 60 F 60 M + 60 F 60 M + 60 F 60 M + 60 F 60 M + 60 F
studi classici della tossicologia. N° Animali per TK 9M+9F 9M+9F 9M+9F 9M+9F 9M+9F
satellite**
1 Principio delle 3R N° Massimo ani- 690
Un primo fattore che ha messo in discus- mali per studio
sione l’uso di numerosi animali nella tos-
sicologia classica è stato il principio delle Studio di cancerogenesi nel ratto con minimo numero di animali
3R introdotto da W Russel e R Burch Dose Bassa Media Elevata Controllo Confronto*
(1), recepito dalla Direttiva Europea
N° Animali 50 M + 50 F 50 M + 50 F 50 M + 50 F 50 M + 50 F
(86/609/CEE) e riconfermato nella Di-
rettiva Europea (2010/63/UE). Il princi- N° Animali per 3M+3F 3M+3F 3M+3F 3M+3F
pio delle 3R dichiara che per la protezio- TK satellite**
ne degli animali occorrono: N° Massimo ani- 424
Refinement: procedimenti meno dolorosi; mali per studio
Reduction: utilizzo di un minor numero *Non tutti gli studi sono condotti con un composto di confronto;
di animali; **Non tutti gli studi prevedono un gruppo satellite per lo studio farmacocinetico
Replacement: sostituzione completa degli
animali.
In particolare la Direttiva Europea Tabella 2 Scadenze per il REACH
(86/609/CEE) riporta due importanti Date Scadenze
articoli:
30/12/2006 Pubblicazione nel giornale ufficiale della UE
Art. 7.2 Un esperimento sull’animale
non dovrebbe essere condotto se è ragio- 01/06/2007 Entrata in vigore
nevolmente e praticamente disponibile
01/06/2008 Partenza delle preregistrazioni delle sostanze
un altro metodo scientificamente valido
per raggiungere lo stesso scopo; 01/12/2008 Termine della fase di preregistrazione
Art. 23 La Commissione e gli Stati Mem- 01/12/2010 Termine delle registrazioni delle sostanze secondo l’Annex X:
bri dovrebbero incoraggiare la ricerca >1000 t/anno
nell’ambito di sviluppo e validazione di >100 t/anno (sostanze che possono causare effetti avversi e che
tecniche alternative in grado di provvedere sono classificate come R50/53 secondo la Direttiva 67/548/CE)
lo stesso livello di informazione ottenuto >1 t/anno (sostanze classificate CMR* di categ. 1 o 2 secondo
la direttiva 67/548/CE
con la sperimentazione animale, ma che
riducano il numero di animali utilizzati o 01/06/2013 Scadenza per la registrazione di sostanze secondo l’Annex IX
>100 t/anno
richiedano procedure meno dolorose.
01/06/2018 Scadenza per la registrazione di sostanze secondo l’Annex VII e VIII
Anche la legislazione italiana si è allinea-
>1 t/anno
ta a questi principi con opportuni inter-
venti legislativi (D. Lgs. N. 116, 1992; *CMR = sostanze cancerogene, mutagene e tossiche per la riproduzione
Circolare 14/5/2001). Sparrow e coll (2)
hanno riportato numerosi esempi di ridu- ne di questi, sugli animali. Sempre dal 3 Avvento del REACH
zione del numero degli animali; un esem- Marzo 2009 è stata proibita la vendita Un terzo fattore che ha pure messo in
pio viene riportato nella Tabella 1 per lo in Europa di prodotti ed ingredienti co- discussione la tossicologia classica è stata
studio di cancerogenesi nel ratto, dove si smetici testati su animali per i quattro la legislazione europea su Registration,
passa da 690 a 424 animali utilizzati. endpoint seguenti: tossicità genetica, tos- Evaluation, Authorisation and restriction
sicità acuta, irritazione cutanea e oculare. of CHemical (REACH) del 2006, che
2 Direttive sui cosmetici Il divieto per altri endpoint come tossi- rappresenta il maggior investimento sulla
Un secondo fattore che ha decisamente cità riproduttiva, tossicità a dosi ripetu- sicurezza delle sostanze chimiche indu-
messo in discussione l’uso degli animali te e tossico-cinetica, è entrato in vigore striali e conseguentemente dei prodotti
nelle varie sperimentazioni è stata la Di- nel Marzo 2013. Altri endpoint, come la di consumo. Durante la decisione politi-
rettiva 2003/15/CEE (VII emendamen- cancerogenesi e la reprotox, rimarranno ca del processo, sono stati fatti parecchi
to della Direttiva sui Cosmetici 76/768/ scoperti visto che i metodi in vitro non tentativi, tra il 2001 e il 2005 per valutare
CEE) che ha messo al bando i test con sono al momento disponibili. Con que- i costi del REACH, sia finanziariamente
animali sui cosmetici finiti. In particola- ste stringenti tempistiche risulta evidente che riguardo al numero degli animali ri-
re, a partire dal Settembre 2004 è stato la necessità e l’urgenza per l’industria co- chiesti per gli studi tossicologici.
vietato testare i prodotti cosmetici finiti smetica e l’Unione Europea di sviluppare In Tabella 2 vengono riportate le sca-
sugli animali e, dal Marzo 2009 testare test validati che sostituiscano i test in vivo denze per le sostanze preregistrate presso
ingredienti cosmetici o una combinazio- per tutti questi endpoint. ECHA (3).
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In Tabella 3 viene riportato il numero Tabella 3 Elenco delle sostanze preregistrate riferite alle date di registrazione
delle sostanze preregistrate presso ECHA Data di registrazione Sostanze Sostanze Sostanze non Totale
(3). non phase in* phase in** classificate
Nelle Tabelle 4,5 vengono riportati gli 30/11/2010 1.730 47.858 5.098 54.686
studi eseguiti con la tossicologia classica
31/05/2013 2.097 53.048 4.454 59.599
evidenziando il numero di animali neces-
sari ed i relativi costi per l’esecuzione dei 31/05/2018 ---- ---- 29.550 29.550
vari test richiesti utilizzando lo scenario 3, Totale 3.827 100.906 39.102 143.835
come riportato da Rovida e Hartung (3).
*Sostanze notificate come dannose secondo la Direttiva 67/548/CEE **Sostanze presenti
nel mercato UE prima del 18 Settembre 1981 e quelle designate come polimeri (NLP)
Come si vede dall’esame della Tabella 4 il
numero di animali da utilizzare per i vari
Tabella 4 Numero di animali per test in vivo richiesti per la preparazione dei dossier, valu-
test è molto variabile; particolarmente tando il numero dei composti secondo lo scenario 3 (Composti: 68.209)
elevato è il numero necessario per le prove
Test OECD TG Animali Numero totale %
sulla tossicità riproduttiva (89.62%), an- per test animali
che se limitate ad una sola generazione, per (somma delle medie) (somma dei vari test)
le prove di tossicità ripetuta e per la muta- Irritazione oculare 405 1.3 12.414 0.02
genesi. Il numero di animali per le prove di
Sensibilizzazione 429, 429R, 406 47 823.891 1.52
tossicità su pesci ed uccelli è relativamente cutanea
basso. Va sottolineato comunque che il
Tossicità acuta 420, 423, 425, 403, 402 77 689.003 1.27
numero totale di animali stimato è di 54.4
milioni, cioè un numero veramente impo- Tossicità ripetuta 407, 410, 412, 408, 411, 360 1.187.122 2.19
nente per tutte le prove da eseguire per il 413
REACH nell’unione Europea. Mutagenesi Cfr test 70 1.870.768 3.45
Cancerogenesi 451 400 49.912 0.09
Il costo stimato in totale è di 9.5 miliardi
di Euro (3). Anche l’esame della Tabella Tossicità 421, 422, 414, 414(II spe- 9.016 48.648.236 89.62
riproduttiva cie), 416, 416(II specie), 426
5 rivela che il costo maggiore è relativo ai
test di tossicità sulla funzione riprodutti- Bioaccumulazione 305 16 21.062 0.04
(pesce)
va (72.49%); sono pure molto elevati i co-
sti relativi alle prove di tossicità ripetuta. Tossicità subacuta 203 42 223.046 0.41
(pesce)
Tossicità cronica 210, (212, 215) 400 711.662 1.31
Avvento (pesce)
dei metodi alternativi Tossicità acuta
(uccelli)
205, 223 70 44.000 0..08
Negli ultimi anni quindi l’impiego di test
basati sull’uso di animali è stato contra- Tabella 5 Costi richiesti per la preparazioni dei dossier valutando il numero dei composti
stato, come abbiamo visto in preceden- secondo lo scenario 3 (Composti: 68.209)
za, dai tre fattori citati in precedenza. Test OECD TG Costo medio Costo totale %
Sono emerse nuove tecnologie come per test (migliaia di Euro)
(migliaia di Euro)
bioinformatica, genomica, proteomica,
metabolomica, sistemi biologici in vitro Irritazione oculare 405 1.1 10.504 0.11
e modelli analitici (sistemi in silico), che Sensibilizzazione 429, 429R, 406 9.29 162.850 1.71
potenzialmente offrono valide alternative cutanea
ai test basati sull’impiego di animali. Si Tossicità acuta 420, 423, 425, 403, 402 15.2 88.502 0.93
sono evidenziati molti dubbi sulla predit-
Tossicità ripetuta 407, 410, 412, 408, 411, 413 705.2 1.832.718 19.22
tività dei test condotti su specie differenti
da quella umana (differenze interspecie), Mutagenesi Vedi test 10.8 288.633 3.03
sulla capacità di estrapolare, dai test con- Cancerogenesi 451 780.4 97.378 1.02
dotti sugli animali esposti ad alte dosi di
sostanza, dati d’interesse per l’uomo e Tossicità 421, 422, 414, 414(sec specie), 2128.2 6.912.147 72.49
riproduttiva 416, 416(sec specie), 426
l’ambiente soggetti solitamente a bassi
livelli di esposizione e sulla relativa varia- Bioaccumulazione 305 10 13.164 0.14
(pesce)
bilità e bassa riproducibilità di alcuni test
basati sugli animali, ai quali si sommano i Tossicità subacuta 203 4.2 22.305 0.23
(pesce)
loro costi elevati ed i lunghi tempi speri-
mentali (e le grandi quantità di sostanza Tossicità cronica 210, (212, 215) 26.3 46.792 0.49
(pesce)
non sempre disponibile nei primi stadi
della sperimentazione). Tossicità acuta 205, 223 96.2 60.469 0.63
(uccelli)
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Esempi per la potenziale sostituzione dei sposizione (risk characterization). Vista in un secondo laboratorio, la variabi-
test basati sull’uso di animali includono: l’importanza dei risultati di questi test, lità e quindi la riproducibilità tra labo-
• colture in vitro di cellule, tessuti e or- le agenzie regolatorie dei diversi Paesi ratori.
gani (ad esempio cornee di mucca ma- accettano metodi alternativi solo dopo • Valutazione indipendente (peer re-
cellata od occhi di pollo usati per studi che questi siano stati scientificamente va- view) dello studio di validazione con-
sull’irritazione oculare); lidati, cioè se ne è dimostrata l’affidabilità dotto da esperti estranei al lavoro.
• linee cellulari (ad esempio, cellule di (riproducibilità del metodo nel tempo ed • Accettazione regolatoria, processo che
topo 3T3 impiegate per valutare effet- in laboratori diversi) e la rilevanza (signi- a livello europeo (EC adoption) pre-
ti fototossici); ficatività ed utilità di una procedura per il vede l’inclusione dei metodi validati
• cellule staminali coltivate per test di fine prefissato) (5). nel Regolamento 440/2008/CE, che
embriotossicologia; La Commissione Europea ha previsto sottostà al regolamento REACH (cfr
• modelli di tessuti ricostituiti (come finanziamenti per progetti diretti a met- sezione 1.4.2). Successivamente il me-
EpiDerm™ e Episkin®, sviluppati per tere a punto alternative ai test su animali todo è largamente accettato nell’U-
valutare la corrosione cutanea); nella ricerca medica nell’ambito del VII nione Europea, visti anche gli obblighi
• sistemi in silico (includono modelli Programma Quadro (2007-2013). E’ re- imposti dalla Direttiva 86/609/ECC.
predittivi che relazionano le proprietà cente la notizia che l’industria cosmetica, L’accettazione regolatoria, che include
biologiche/tossicologiche di una so- tramite la sua associazione europea, Co- Paesi extra UE, si svolge principalmen-
stanza alla sua struttura chimica) (4). smetics Europe, ha devoluto una ‘discreta’ te a livello dell’OECD e dell’ICH
somma per lo studio dei metodi alterna- (international adoption). Il processo
Altri approcci per ridurre l’uso di test in tivi, che si è aggiunta alla stessa somma di accettazione regolatoria potrebbe
vivo includono: stanziata dalla Commissione. Criteri e richiedere anche 5 anni di tempo.
• valutazione dati/informazioni di tipo processi per la validazione dei metodi
epidemiologico; sono stati sviluppati e applicati in Europa Una volta validati e corredati di opportu-
• weight of evidence approach (WoE) e (sotto la sorveglianza del Laboratorio di ni documenti che ne attestino la validità
Intelligent Testing Strategy (ITS); Referenza dell’Unione Europea sui Me- scientifica e accettati dalle autorità gover-
• read-across approach (per cui le infor- todi Alternativi ai test animali, EURL native, i metodi possono essere impiegati
mazioni su una sostanza struttural- ECVAM, in particolare la sua Commis- nei laboratori accreditati per questo tipo
mente simile possono essere usate per sione Scientifica chiamata ESAC), negli di test. Gli studi sono condotti in ac-
riempire vuoti di conoscenza di un’al- Stati Uniti (attraverso la Interagency Co- cordo con i requisiti di Buona Pratica di
tra sostanza); ordinating Committee on the Validation Laboratorio (GLP) secondo la Direttiva
• data sharing (via lettera di accesso of Alternative Methods (ICCVAM)), in 2004/10/CE, così da promuovere la qua-
(LoA); Giappone (attraverso il Japanese Center lità e la validità dei dati che devono poi
• mutuo riconoscimento dei risultati for the Validation of Alternative Methods essere sottomessi alle autorità regolatorie
tossicologici condotti in Stati diversi ( JaCVAM)). Nel 2009 EURL ECVAM, nazionali o internazionali.
evitando la ripetizione di test uguali; ICCVAM, JACVAM e il corrispondente In Italia una sezione dell’Istituto Supe-
• rinuncia agli studi tossicologici quan- organismo del Canada (the Environmetal riore di Sanità svolge attività consultive,
do i livelli di esposizione umana sono Health Science and Research Bureau) han- a livello nazionale ed internazionale, su
sotto i livelli di pericolo (Threshold of no firmato un accordo per favorire a livel- problematiche correlate all’identifica-
Toxicological Concern, TTC) (CPMP/ lo internazionale la diffusione di metodi zione e validazione di metodi in vitro,
SWP/5199/02 – EMEA/CHMP/ alternativi riproducibili e scientificamen- da utilizzare in ambito regolatorio per
QWP/251344/2006). te validati, fugando ogni timore di rischi l’identificazione di effetti tossici delle
In questo caso tuttavia, per determina- per la salute. sostanze chimiche. In particolare, segue
re il TTC, devono essere prodotti altri La valutazione di nuovi metodi richiede lo sviluppo e la validazione di metodi al-
dati tossicologici e di struttura chimi- 5 passaggi (6). ternativi, controlla che l’esecuzione delle
ca di sostanze strutturalmente correla- • Ricerca e sviluppo di un metodo che prove tossicologiche in vitro siano esegui-
te a quelle oggetto di studio. potrebbe dar vita ad un test ottimizza- te secondo le Buone Pratiche di Labora-
to. Questa fase può essere sostenuta da torio (GLP) ed esegue un monitoraggio
università, centri di ricerca nazionali e in ambito nazionale sul rispetto delle
Validazione dei test alternativi industria. autorizzazioni in deroga alla sperimenta-
ed organizzazioni coinvolte • Prevalidazione: uno studio di parec- zione animale. In aggiunta, il Centro di
Grazie alle informazioni generate da spe- chi anni atto a valutare riproducibili- Referenza Nazionale per i metodi alter-
cifiche batterie di questi test alternativi, le tà, affidabilità e predittività del test e nativi, benessere e cura degli animali da
autorità regolatorie determinano la capa- a definire un modello interpretativo laboratorio (IZSLER di Brescia) è stato
cità intrinseca della sostanza di interferire da usare per predire i risultati degli riconosciuto negli ultimi anni come cen-
con la salute umana (hazard identifica- endpoint in vivo. Si conduce in EURL tro di riferimento nazionale per la raccol-
tion), e ne permettono la classificazione ECVAM, nell’industria e negli istituti ta e la valutazione dei metodi impiegati
e l’etichettatura. Inoltre questi dati con- internazionali con esperienza di preva- per ridurre/sostituire l’uso di animali
sentono di valutare i potenziali rischi che lidazione e validazione. da laboratorio e raggruppare gli esperti
la sostanza potrebbe arrecare all’uomo e • Validazione: un studio di molti anni del settore come previsto dalla Direttiva
all’ambiente sotto reali condizioni d’e- atto a valutare la trasferibilità del test 2010/63/UE. L’impiego di metodi alter-
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nativi non è lo stesso nei diversi settori in- tata annualmente a partire da un volume di tollerabilità locale non sarebbe suffi-
dustriali; studi in vitro sono d’obbligo in maggiore o uguale ad una tonnellata. Per ciente per valutarne la pericolosità e si
un settore e non previsti in un altro. Qui testare le sostanze chimiche d’interesse, dovrebbe considerare un test di tossicità
di seguito sono riportate queste differen- circa 30.000, servirebbero parecchi anni, sub-cronica, sebbene non richiesto dalla
ze in settori d’interesse quali il settore dei un gran numero di animali (stimato circa legislazione delle sostanze chimiche.
farmaci e dispositivi medici, i prodotti 54 milioni) e alcuni miliardi di Euro (sti- La sperimentazione animale non è men-
chimici ed i cosmetici. mati circa 9.5). Per questo il Regolamento zionata nella Direttiva del 1976, ma solo
REACH ‘sfida’ l’industria chimica a svi- successivamente nel sesto emendamento
Farmaci e dispositivi medici luppare metodi in vitro affidabili e rapidi del 1993 (Direttiva 93/35/CEE) e poi
L’Agenzia Europea dei Medicinali per predire la tossicità negli uomini, ad nel settimo emendamento (Direttiva
(EMA) è l’agenzia europea che valuta e usare quelli già validati o anche a livello 2003/15/CEE) entrato in vigore nel
monitora i prodotti farmaceutici, svilup- di prevalidazione (purchè giustificati), ad 2004, dove si prende una forte posizione
pa linee guida e fornisce supporto scien- usare modelli tossicocinetici per stimare, contro l’impiego di animali nella valuta-
tifico alle aziende farmaceutiche. I requi- dalle concentrazioni misurate in vitro, zione degli ingredienti e prodotti cosme-
siti europei per verificare la sicurezza dei l’esposizione a livello dell’organismo e di tici. In particolare, a partire da Settembre
farmaci è stata armonizzata con quella conseguenza selezionare la dose, la via di 2004 si è di fatto vietato testare i prodotti
dei maggiori mercati farmaceutici (US e somministrazione e le specie animali da cosmetici finiti sugli animali e dal Marzo
Giappone) nelle linee guida ICH. Queste testare. Adattamenti del regime di spe- 2009 si è proibito di testare ingredienti
prevedono che prima di portare un far- rimentazione per le sostanze fabbricate cosmetici, o una combinazione di questi,
maco sul mercato e prima che questo sia o importate in quantitativi diversi sono sugli animali (testing ban). Sempre dal
testato sull’uomo, la sua sicurezza venga riportati nell’allegato XI e suoi aggior- Marzo 2009 è proibita la vendita in Eu-
testata negli animali (pre-clinical animal namenti (in particolare il Regolamento ropa di prodotti ed ingredienti cosmetici
studies) come riportato nella Direttiva 440/2008/CE e successive modifiche) testati su animali per i quattro seguenti
2001/83/CE recepita in Italia col D. Lgs. (Report from the Commission, 2010). Il endpoint: tossicità genetica, tossicità acu-
n. 219 del 2006 (allegato I). Questi test Regolamento REACH inoltre sostiene lo ta, irritazione cutanea e oculare (mar-
coinvolgono molte migliaia di animali e scambio di dati tossicologici tra aziende keting ban). Il divieto su altri endpoint,
sono richiesti sia per valutare la pericolo- con la formazione di consorzi in modo di come tossicità riproduttiva, tossicità a
sità di ciascun singolo ingrediente attivo avere, per una sostanza, una sola registra- dosi ripetute e tossicocinetica, è entrato
che per ciascun prodotto farmaceutico zione e richiede alle aziende di sottoporre in vigore nel Marzo 2013. Con essi altri
finito. Considerando i costi di questi test una proposta di test alle autorità prima endpoint, come la cancerogenesi, rimar-
e la loro relativa accuratezza nel predire i di intraprendere nuovi test su vertebrati ranno scoperti, visto che alcuni metodi in
risultati degli studi clinici (solo una bassa per le liste di dati più impegnative. L’A- vitro utili per l’identificazione dei rispet-
percentuale di prodotti arrivata in Fase 1 genzia Europea per le sostanze chimiche tivi endpoint (nel caso specifico il perico-
di sperimentazione clinica raggiungerà il (ECHA) è l’agenzia europea che gestisce lo di cancro) sono disponibili, ma non
mercato), l’industria farmaceutica pro- gli aspetti tecnico-scientifici-amministra- sufficienti a sostituire completamente i
muove lo sviluppo di metodi alternativi, tivi del Regolamento REACH. test condotti sugli animali. Con queste
quali metodi in vitro ed ‘omici’ nei test stringenti tempistiche è risultato urgente
preclinici ed approcci clinici alternativi Cosmetici e indispensabile per l’industria cosmetica
quali il microdosing (7), pur non essendo- La vendita dei cosmetici in Europa è re- sviluppare test validati che sostituiscano
ne obbligati dalle agenzie regolatorie. golata dalla Direttiva 76/768/CEE del i test in vivo per tutti questi endpoint. E’
1976, che richiede che ogni ingrediente proprio l’industria cosmetica che, più di
Prodotti chimici cosmetico messo sul mercato non debba altri settori, ha portato avanti a proprie
Nel Dicembre 2006 l’Unione Europea causare danni alla salute dell’uomo quan- spese gran parte dello sviluppo e della va-
ha rivisto completamente la normativa do applicato in condizioni normali e pre- lidazione dei metodi alternativi.
relativa ai prodotti chimici introducen- viste per il suo uso. La responsabilità della Va sottolineato che La Direttiva 76/768/
do il Regolamento 1907/2006/CE che sicurezza dei prodotti è affidata al produt- CEE sarà sostituita nel Luglio 2013 dal
riguarda la registrazione, la valutazione, tore o alla persona che li immette sul mer- Regolamento 1223/2009/CE, in cui
l’autorizzazione e la restrizione d’uso di cato. Dal momento che la maggior parte probabilmente sarà previsto un ulterio-
sostanze chimiche (REACH). Questo degli ingredienti cosmetici è rappresen- re rinvio del bando alla sperimentazione
Regolamento intende armonizzare il si- tata da prodotti chimici, per alcuni i dati animale per quelle aree di tossicologia
stema regolatorio delle sostanze chimiche tossicologici sono già disponibili con l’a- non coperte da test alternativi validati.
e stabilire le informazioni minime neces- dempimento al regolamento REACH. In
sarie che produttori, importatori, e altri altri casi, sostanze usate come ingredienti
utilizzatori devono fornire per dimostra- cosmetici richiedono altri o nuovi tipi Futuri sviluppi
re che le sostanze prodotte, importate, e di test, indipendentemente dai requisiti dei metodi alternativi
utilizzate non siano nocive per la salute di volume dipendenti dal Regolamento
umana e per l’ambiente e che i rischi sia- REACH. Ad esempio, per un basso volu- Un aggiornamento sullo stato di validazio-
no adeguatamente controllati. I test tossi- me di sostanza chimica, usata come ingre- ne e accettazione regolatoria dei metodi al-
cologici richiesti variano in funzione del diente cosmetico applicato di frequente o ternativi è presentato nella Tabella 6. Come
volume di sostanza prodotta od impor- ripetutamente sulla pelle umana, un test descritto nel Technical Report ‘Alterna-
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Tabella 6 Attuale situazione dei principali metodi alternativi
(Per questa tabella abbiamo preferito utilizzare la terminologia inglese perché più aderente alle realtà regolatorie)
Test method per human health Current status Regulatory Regulatory Regulatory Regulatory
effect acceptance acceptance acceptance acceptance
USA Japan OECD EU
Eye irritation
Bovine Corneal Opacity and ICCVAM peer review Acceptance in 2008 OECD TG 437 EU test
Permeability (BCOP) test method and report (2007). (2009) method B.47
ESAC statement (2007)
Isolated Chicken Eye (ICE) test method ICCVAM peer review Acceptance in 2008 OECD TG 438 EU test method
and report (2007). (2009) B.48
ESAC statement (2007)
Cytosensor Microphysiometer assay ECVAM validation Recommendation to SPSF submitted
completed. ESAC Federal Agencies: in to OECD (2010)
statement 2009 progress Draft TG
Fluorescein Leakage assay ECVAM validation SPSF submitted
completed. ESAC to OECD (2010)
statement 2009 Draft TG
Low Volume Eye test ECVAM validation Acceptance in USA
completed (2007). in progress.
ESAC statement (2009).
ICCVAM international
peer review (2009)
SkinEthic assay Under validation
EpiOcular assay Under validation
Cytotoxicity test short time JaCVAM under validation
exposure (STE)test
Cytotoxicity test three-dimensional JaCVAM peer review
dermal model (MATREX) ongoing
Cytotoxicity test SIRC cells JaCVAM peer review
ongoing
Use of anesthetics, analgesics in Draize NICEATIM -ICCVAM Acceptance in USA SPSF submitted
eye test Recommendations peer review (2009) in progress to OECD (2010)
In vitro methods of moderate and mild NICEATIM -ICCVAM Acceptance in USA
irritant Recommendations for BCOP, peer review (2009) in progress
ICE, IRE, HET-CAM
In vitro approach for antimicrobial NICEATIM -ICCVAM Acceptance in USA in
Recommendations for other studies peer review (2009) progress
Skin Corrosion
Corrositex Skin Corrosivity test ICCVAM report (1999) Acceptance in 2000 OECD TG 435
ESAC statement (2000) (2006)
Episkin Skin Corrosivity test ESAC statement (1998) OECD TG 431 EU test
ICCVAM report (2002) (2004) Method B.40
Epiderm Skin Corrosivity test ESAC statement (1998) OECD TG 431 EU test
ICCVAM report (2002) (2004 Method B.40 Bis
SkinEthic Skin Corrosivity test ESAC statement (2006) OECD TG 431 EU test
(2004) Method B.40 Bis
Rat Skin TER Corrosivity test ESAC statement (1998) OECD TG 430 EU test
ICCVAM report (2002) (2004) Method B.40
EST-1000 (CellSystem) ESAC statement (2009) OECD TG 431 EU test
(2004) Method B.40 Bis
Skin irritation
EpiSkin Skin Irritation test ESAC statement (2007) Accepted by OECD TG 439 EU test
Japanese board Method B.46
EpiDerm Skin Irritation test ESAC statement (2008) OECD TG 439 EU test
Method B.46
SkinEthic RHE ESAC statement (2008) OECD TG 439 EU test
Method B.46
in vitro dermal irritation assays to NICEATM-ICCVAM Study
evaluate false negative corrosives in progress
EpiDerm, EpiSkin, SkinEthic, RHE
Skin sensitisation
Local Lymph Node Assay for skin ESAC statement (1999) Acceptance in OECD TG 429 EU test
sensitisation (1999) (2002) Method B.42
Reduced Local Lymph Node Assay ESAC statement (2007) Acceptance in Under discussion
for skin sensitisation ICCVAM peer review and (2010) within the revi-
report (2008) sion of TG 429
MUSST ECVAM under validation
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G Coppi, L Ceriotti, G Talamini, M Meloni, M Dossena
Test method per human health Current status Regulatory Regulatory Regulatory Regulatory
effect acceptance acceptance acceptance acceptance
USA Japan OECD EU
h-CLAT ECVAM under validation
Direct Peptide Reactivity Assay ECVAM under validation
Update Murine local lymph node NICEATIM-ICCVAM Acceptance in OECD TG 429
assay (LLNA) (20% reduction) international peer review (2010) (updated) approved
(2008)
Nonradioactive LLNA protocol NICEATIM-ICCVAM
(LLNA:BrdU-Flow Cytometry) international peer review
(2009)
Nonradioactive LLNA protocol NICEATIM-ICCVAM Transmitted to Acceptance by OECD TG442B
(LLNA:BrdU-ELISA) international peer review USA Federal agen- Board
(2009) cies: in progress
Nonradioactive LLNA protocol NICEATIM-ICCVAM Transmitted to Acceptance by OECD TG442A
(LLNA:DA) international peer review USA Federal agen- Board (2008)
(2009) cies: in progress
Harmonized performance stan- Endorsed by ESAC and Acceptance in Draft OECD update
dards for LLNA ICCVAM (2010) to TG 429
Acute phototoxicity
3T3 NRU Phototoxicity test ESAC statement OECD TG 432 EU Test Method B.41
(photo-irritation) (2004)
3T3 NRU Phototoxicity test: ESAC statement OECD TG 432 EU Test Method B.41
UV filter chemical (2004)
Acute toxicity
Up and Down procedure (UDP) ESAC statement (2007) Accepted OECD TG 425 (2001)
Fixed dose procedure (FDP) ESAC statement (2007) OECD TG 420 EU test
(2001) Method B.1 Bis
Acute toxic class method (ATC) ESAC statement (2007) OECD TG 423 EU test
(2001) Method B.1 Tris
In vitro cytotoxicity test 3T3 Neutral ICCVAM peer review and Yes, agency OECD TG 129
Red Uptake For initial dose setting report (2008) endorsement (2010)
In vitro cytotoxicity test ICCVAM peer review and Yes, agency OECD TG 129
NHK Neutral Red Uptake report (2008) endorsement (2010)
For initial dose setting
Acute inhalation toxicity OECD TG 403 OECD TG 403
(revised version) (2009)
Inhalation toxicity-acute toxic class OECD TG 436 (2009) OECD TG 436
method (2009)
Genotoxicity
In vitro micronucleous test ESAC statement OECD TG 487 Mentioned in
(2006) Annex VIII
Comet assay in vivo and in vitro JaCVAM under validation
(2 test methods)
Carcinogenicity
Cell transformation assay pH 6.7 ECVAM validation
Cell transformation assay pH 7 ECVAM validation
Cell transformation assay ECVAM validation
Balb/c 3T3 cell
BHAS cell transformation JaCVAM validation
Toxicokinetics/Metabolism
In vitro hepatic biotransformation ECVAM, ICCVAM,
Enzyme induction; (Hepa RG) and JaCVAM
cryopreserved human hepatocytes validation
(3 test methods)
Reproductive toxicology
In vitro embryotoxicity test em- ESAC statement
ploying micromass culture, (2001)
rat embryo culture and embryonic
stem cells
LUMI CELL® estrogen receptor NICEATIM,
transcriptional activation assay: JaCVAM,ECVAM
agonist and antagonist validation
MELN® estrogen receptor ECVAMunder
transcriptional activation assay; validation
agonist and antagonist
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tive ‘non animal’ Methods for Cosmetics questo caso la sostituzione dei test in Fino ad ora il maggior limite di questi
Testing: Current Status and Future Pro- vivo avverrà molto probabilmente dopo sistemi integrati è che si fanno crescere li-
spectives’, del 2010 (8) la completa sosti- il 2017. nee cellulari più adatte a vivere in coltura
tuzione dei test in vivo è stata raggiunta rispetto a tipi cellulari organo-specifici.
per alcuni endpoint quali l’irritazione e Negli ultimi anni molto è stato fatto per Inoltre è ancora una sfida aperta inte-
la corrosione cutanea, l’assorbimento e ottimizzare e validare modelli in vitro e in grare più organi su chip in una maniera
la penetrazione cutanea e la fototossici- silico. D’altra parte, in alcuni casi non è fisiologicamente rilevante da imitare la
tà. Sono stati accettati anche metodi per chiaro come le informazioni ottenute con complessa fisiologia umana e sviluppare
identificare le sostanze che causano seria metodi alternativi si possano combinare modelli farmacocinetici e farmacodi-
irritazione oculare e si sta procedendo tra loro in modo tale da ottenere la con- namici capaci di estrapolare comporta-
verso una strategia di test per sostituire fidenza richiesta per basare la valutazione menti clinici rilevanti da dati ottenuti
completamente il test di Draize. D’altra del pericolo esclusivamente su dati otte- in vitro. Quando sarà possibile coltivare
parte la completa sostituzione dei test per nuti senza l’impiego di animali. cellule specializzate o farle differenzia-
irritazione oculare, genotossicità e tossi- Come già annunciato nella prima parte re in cellule specializzate direttamente
cità acuta non è stata ancora raggiunta, di questo lavoro, lo sviluppo di metodi su chip, e mantenere in vita e funzionali
sebbene il divieto di testing e marketing alternativi è sostenuto dai recenti avanza- organi umani su organi-chip attivamente
nella normativa cosmetica sia già entrato menti della ricerca cellulare, incluso l’uso ed automaticamente collegati tra loro, le
in vigore dal 2009. delle cellule staminali che, ad esempio, da informazioni da essi generate saranno più
pluripotenti possono essere indotte a for- predittive e potranno essere adottate dal-
Per gli endpoint per i quali i metodi in mare tessuto intestinale utile per studiare le autorità regolatorie.
vivo sono stati vietati nel 2013 la situa- in vitro gli effetti di farmaci e tossine (9)
zione non è migliore. Ad esempio, la e lo sviluppo di (co)-colture cellulari bi- o
tossicocinetica è stata identificata come tri-dimensionali che tendono a mimare la Conclusioni
elemento cruciale per il futuro, visto che complessità dei tessuti nel corpo umano.
rappresenta il primo passo per trasferire i Inoltre, negli ultimi anni, molti ricerca- Ancora oggi, per la gran parte degli
dati osservati in vitro nella realtà umana. tori hanno focalizzato la loro attenzione endpoint tossicologici, non esistono me-
I modelli tossicocinetici, come ad esem- sullo sviluppo dei cosiddetti Organs-on- todi che permettono di verificare pie-
pio i modelli basati sulle proprietà fisio- chips, dove colture cellulari sono state in- namente l’efficacia e la sicurezza di una
logiche (Physiologically-Based Toxico- tegrate in sistemi microfluidi per mimare sostanza chimica o di un farmaco senza
kinetics: PBTK), sono da considerarsi le il microambiente che cellule e tessuti mo- utilizzare test su un organismo vivente.
migliori soluzioni per simulare il destino strano in vivo (10,11). Questo non per Tuttavia, di fronte alla nuova sensibilità
delle sostanze nell’organismo umano e creare organi da trapiantare, ma per for- ed attenzione per problemi etici e scienti-
mettere in relazione l’esposizione con la nire le funzioni degli organi in grado di fici relativi alla sperimentazione animale,
concentrazione delle sostanze nei tessuti testare gli effetti terapeutici e tossici delle senza trascurare l’importanza dei modelli
e nei fluidi umani (biomonitoring data). sostanze (per esempio, studiare la tossi- tradizionali, si ricercano nuove prospet-
D’altra parte per l’impiego di questi mo- cità dopo parecchi giorni di esposizione tive meno invasive e più attente a trova-
delli, che sostituiranno completamente ripetuta) in sistemi adatti ad applicazio- re un giusto equilibrio tra esigenze della
i test tossicologici attualmente in uso, si ni ad elevato throughput (per esempio conoscenza scientifica ed il rispetto della
richiede probabilmente ancora qualche studiare la diversa risposta dei pazienti vita animale (14). I passi avanti compiu-
anno (> 2017). esposti allo stesso trattamento farmacolo- ti nella ricerca hanno accompagnato la
La tossicità riproduttiva è probabilmente gico) e che si possono integrare tra loro nascita e lo sviluppo di nuove strategie
uno degli endpoint più difficili da studiare creando body-on-a-chip (per esempio per sperimentali capaci di dare risposte alle
in vitro, visto i tanti meccanismi coinvolti predire certi aspetti di assorbimento, di- molteplici domande aperte dalla biologia
nella fertilità femminile e maschile, nella stribuzione, metabolismo ed escrezione e dalla medicina.
loro interazione e nel processo di sviluppo di molte sostanze candidate a divenire
prenatale umano. Seppur esistano sistemi farmaci) (12). Ad esempio, le tecnologie basate sull’omi-
in vitro validati, che studiano specifici ca, misurando l’impatto di una sostanza
aspetti coinvolti nel sistema riprodutti- Un microsistema biomimetico che rico- sull’espressione genica o proteica o sul
vo, come ad esempio effetti di tossicità struisce l’interfaccia tra alveoli e capillari metabolismo cellulare, possono essere
embrionale o distruzione del sistema en- del polmone umano è stato sviluppato utili per identificare i meccanismi d’azio-
docrino, si stima che siano necessarie stra- e fatto meccanicamente respirare (13). ne attivati da prodotti chimici nell’orga-
tegie di test integrati e ancora una decina Uno studio nanotossicologico condotto nismo e misurare i marcatori precoci di
di anni per la sostituzione dei metodi in su questo sistema ha suggerito che più tossicità (15). Una volta che questi mec-
vivo attualmente in uso. Molto complesso nanoparticelle attraversano la membrana canismi sono conosciuti potrebbe essere
è anche il meccanismo alla base della sen- degli alveoli per passare nel sistema circo- appropriato sviluppare metodi alternativi
sibilizzazione cutanea. Per questo motivo latorio quando il sistema è attivo piutto- specifici per ciascuno di essi da applicare
si prevede che la completa sostituzione sto che quando è a riposo, indicando che su modelli cellulari in vitro. I dati così
dei test in vivo per questo endpoint sarà studi tossicologici condotti su cellule im- ottenuti permetteranno un impiego più
rappresentata non da un singolo test, ma mobili sottostimano gli effetti infiamma- razionale e mirato dei test sugli animali.
da una batteria di test diversi. Anche in tori delle particelle sospese nell’aria. In ultima analisi, la combinazione di dif-
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ferenti metodi potrà sostenere lo sviluppo Bibliografia
di strategie integrate che sostituiranno i
test in vivo anche per lo studio della tossi- 1 Russell WMS, Burch RL (1992) 9 Spence JR, Mayhev CN, Rankin SA,
cità sistemica (8). The principle of Humane Experimental Kuhar MF, Vallance JE et al (2011)
Technique Methuen & Co, Special edition Different differentiation of human pluripo-
Sono pronte, per contro, le agenzie rego- published by UFAW, London tent stem cells into intestinal tissue in vitro
latorie ad accettare questi nuovi approcci 2 Sparrow SS , Robinson S, Bolam S, Nature 470 105-109
tecnologici? Bruce C, Danks A et al (2011) 10 Huh D, Hamilton GA, Ingber DE (2011)
A nostro parere per la registrazione di Opportunities to minimize animal use in From 3D cell culture to organ-on-chips
farmaci e dispositivi medici le agenzie pharmaceutical regulatory general toxico- Trends in Cell Biol 21 745-754
regolatorie sono ancora restie alla accet- logy: A cross-company review 11 Ghaemmaghami AM, Hancock MJ,
tazione di metodi alternativi in sostitu- Regul Toxicol Pharmacol 61 222-229 Harrington H, Kaji H et al (2012)
zione dei test classici tossicologici. Solo 3 Rovida C, Hartung T (2009) Biomimetic tissues on a chip for drug discovery
per alcuni test quali la tossicità oculare, Re-evaluation of animal numbers and cost for Drug Discov Today 17 173-181
la tossicità e l’irritazione cutanea, la tos- in vivo tests to accomplish REACH legislation 12 Huh D, Torisava Y, Hamilton GA, Kim HJ,
sicità acuta e la genotossicità sono stati requirements for chemicals - a report by the Ingberg DE (2012)
introdotti metodi alternativi. transatlantic think tank for toxicology Microengineered physiological biomimicry:
Per i prodotti sotto la giurisdizione di ALTEX 26 187-208 Organ-on-Chips
REACH, l’introduzione di metodi al- 4 Puzyn T, Leszczynski J, Cronin MT (2010) Lab Chip 12 2156-2164
ternativi ha avuto una maggiore penetra- Recent advances in QSAR studies. Methods 13 Huh D, Matthews BD, Mammoto A,
zione; non dimentichiamo che in questo and Applications Springer Com./ebook USA Montoya-Zavala M, Hsin HY et al (2010)
caso si tratta di composti per i quali si ave- 5 Balls M, Blaauboer BJ, Fentem JH, Reconstituting organ-level lung function on a chip
vano ben poche notizie sulla loro azione Bruner L, Combes RD et al (1995) Science 328 1662-1668
tossicologica ed ecotossicologica e quindi Practical aspects of the validation of toxicity 14 Battaglia L (2009)
ogni dato tossicologico ottenuto era cer- test procedures. The report and recommenda- Metodologie alternative, comitati etici e
tamente accolto con favore. tions of ECVAM workshop 5 obiezione di coscienza alla sperimentazione
ATLA 23 129-147 animale Com Naz Bioetica, Laterza, Roma-Bari
I prodotti cosmetici sono quelli in cui i 6 Manou I, Eskes C, de Silva O, Renner G, 15 Marshall E (1993)
metodi alternativi trovano il loro più va- Zuang V (2005) Toxicology goes molecular
sto impiego anche se per certi test sarà Safety data requirements for the purposes of Science 259 1394-1398
difficile eliminare completamente l’uso the Cosmetics Directive 16 Lorenzetti S, Altieri I, Arabi S et al (2011)
degli animali (cancerogenesi, tossicità Altern Lab Anim 33 21-26 Innovative non-animal testing strategies for
cronica). 7 Schroeder K, Bremm KD, Alepee N, reproductive toxicology: contribution of Ita-
Va comunque ricordato che esistono nu- Bessems JGM, Blaauboer B et al (2011) lian partners within the EU project ReProTect
merosi gruppi di ricercatori universitari Report from the EPAA workshop: in vitro Ann Ist Sup Sanità 47 429-444
e dell’industria che stanno studiando ed ADME in safety testing used by EPAA industry 17 Zuang V, Barroso J, Bremer S et al (2010)
approfondendo nuovi metodi alternati- sectors ECVAM Technical report on status of alternative
vi per cui è auspicabile che nei prossimi Toxicology in Vitro 25 589-604 methods for cosmetics testing (2008-2009)
anni si potrà arrivare ad una tossicologia 8 Adler S, Basketter D, Creton S, JRC Scient Techn Report EUR 24413 EN JRC, Ispra
che, oltre ad alcuni test classici poco rim- Pelkonen O, van Benthem J et al (2010) 18 van Vliet E (2011)
piazzabili, potrà utilizzare nuovi metodi Alternative (non animal) methods for Current standing and future prospects for the
alternativi con una notevole riduzione cosmetics testing: current status and future technologies proposed to transform toxicity
dell’uso degli animali e forse degli attuali prospects testing in the 21st century
costi molto elevati (16-18). Arch Toxicol 85 367-485 ALTEX 28 17A-44A
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